Validação analítica da cinarina

1. VALIDAÇÃO ANALÍTICA DA CINARINA ACADÊMICA: SILVIA DOS SANTOS NEVES ORIENTADORA.:Dra MARIA ANA PIGNATEL MARCON MARTINS UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA UNISUL CURSO DE QUÍMICA INDUSTRIAL JUNHO, 2012

2. INTRODUÇÃO Originada do Norte da África e do Mediterrâneo, a cinarina é citada desde o século 4 a.C. como alimento e medicamento. Foi muito apreciada pelos antigos romanos como um vegetal com efeitos benéficos para a digestão. ( MARTIN BAUER GROUP). As folhas da alcachofra se caracterizam pela sua composição em ácidos fenólicos (até 2%), como ácido caféico, ácido clorogênico e cinarina; flavonoides (0,1 a 1%), e óleos voláteis. (CARVALHO, 2004 ).

3. JUSTIFICATIVA O grande objetivo de uma indústria farmacêutica é produzir produtos de confiança e qualidade já que este tem o objetivo curativo ou preventivo de doenças em seres humanos. A Cinarina, princípio-ativo do extrato Alcachofra, é usado no produto Alcagest, produzido pela empresa Airela Indústria Farmacêutica Ltda., o mesmo não possui método validado para determinação do teor. Sendo assim, viu-se a necessidade de desenvolver um método capaz de determinar o teor de Cinarina, tanto na matéria – prima como no produto final, um método eficiente e preciso, um método validado para o princípio-ativo presente na Alcachofra.

4. OBJETIVOS OBJETIVO GERAL: Desenvolver um método eficaz para análise de teor da Cinarina, avaliando-se a sensibilidade, através de um espectrofotômetro UV-VIS.

5. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: Realizar um levantamento bibliográfico com base na Resolução nº 899 da ANVISA e determinar quais parâmetros deverão ser avaliados na validação do método analítico do princípio – ativo Cinarina. Desenvolver o Protocolo e o Relatório de Validação do Teor de Cinarina, contendo todos os procedimentos detalhados a serem seguidos. Certificar através da seletividade que o método é capaz de determinar o princípio ativo em presença de outros componentes. Construir uma curva de calibração avaliando a relação CONCENTRAÇÃO X ABSORVÂNCIA.

6. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: Demonstrar com a linearidade que os resultados encontrados são diretamente proporcionais às concentrações d a substância ativa no extrato, dentro de um intervalo especificado. Estimar a partir da precisão a concordância entre os resultados obtidos. Demonstrar através da exatidão que os resultados encontrados com o método desenvolvido têm proximidade em relação ao valor verdadeiro. Certificar com a robustez a confiabilidade do método em estudo. Implantar o método validado para a determinação da cinarina, tanto para matéria – prima como para o produto final.

7. CINARINA Conhecida popularmente como Alcachofra , foi trazida para o Brasil pelos imigrantes europeus. O extrato de alcachofra é utilizado para tratar problemas como: Gastrite; Meteorismo; F latulência; D oença do trato biliar funcional.

8. CINARINA Figura 1. Estrutura química da cinarina. ( 1,5- dicafeoilquínico ) Fonte: http:www.scielo.br

9. ESPECTROFOTÔMETRO UV-VIS A espectrofotometria é uma das técnicas analíticas mais utilizadas devido a robustez, custo baixo e grande número de aplicações desenvolvidas . Figura 2. Esquema espectrofotômetro UV-VIS. Fonte: http:www.infoescola.com.br

10. METODOLOGIA VALIDADA Categoria Finalidade do teste I Testes quantitativos para a determinação do princípio ativo em produtos farmacêuticos ou matérias–primas II Testes quantitativos ou ensaio limite para a determinação de impurezas e produtos de degradação em produtos farmacêuticos e matérias-primas III Testes de performance (por exemplo: dissolução, liberação do ativo) IV Testes de identificação Quadro 1 . Classificação dos testes, segundo sua finalidade. Fonte: Resolução nº 899, ANVISA.

11. PLANO DE VALIDAÇÃO PARÂMETRO CATEGORIA I CATEGORIA II CATEGORIA III CATEGORIA IV QUANTITATIVO ENSAIO LIMITE Especificidade Sim Sim Sim * Sim Linearidade Sim Sim Não * Não Intervalo Sim Sim * * Não Precisão Repetibilidade Sim Sim Não Sim Não Intermediária ** ** Não ** Não Limite de detecção Não Não Sim * Não Limite de quantificação Não Sim Não * Não Exatidão Sim Sim * * Não Robustez Sim Sim Sim Não Não Quadro 2. Plano de validação segundo a classificação do analito. Fonte : Resolução nº 899, ANVISA.

12. METODOLOGIA PREPARO DA SOLUÇÃO PADRÃO:   Pesar 2,5 mg de padrão referência de cinarina em uma balão de 25 mL, adicionar 15 mL de uma solução 1:1 de metanol e água. Agitar a solução em ultrasson por 10 minutos, completar o volume com o mesmo solvente e filtrar a solução por papel filtro.   PREPARO DA SOLUÇÃO AMOSTRA: Pesar 500,0 mg do extrato de alcachofra em um balão de 25 mL, adicionar 15 mL de uma solução 1:1 de metanol e água. Agitar a solução em ultrasson por 10 minutos, completar o volume com o mesmo solvente e filtrar a solução por papel filtro.

13. PROCEDIMENTO REAGENTE TUBOS TESTE TUBOS CONTROLE BRANCO 1 2 3 C1 C2 C3 Solução amostra (mL) 0,9 1,0 1,1 0,9 1,0 1,1 - Água purificada (mL) 4,1 4,0 3,9 4,35 4,25 4,15 10,0 Tampão Acetato (mL) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,5 NaNO 2 40% (mL)* 0,25 0,25 0,25 - - - 0,5 Deixar em repouso durante 3 minutos. NaOH 10% (mL)* 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,5 Quadro 3. Preparo das amostras . Fonte: Acervo próprio.

14. RESULTADOS E DISCUSSÕES SELETIVIDADE AMOSTRAS AMIDO (mg) EXTRATO ALCAHOFRA (mg) PADRÃO CINARINA (mg) CONCENTRAÇÃO CINARINA (mg/ mL ) Extrato - 500,30 - 0,0949 Extrato + Amido 50,20 501,07 - 0,0971 Branco - - - - Padrão Cinarina - - 2,7 0,1132 Quadro 4. Preparo das amostras para o ensaio de seletividade. Fonte: Acervo próprio, 2012.

15. RESULTADOS E DISCUSSÕES SELETIVIDADE Fonte: Acervo próprio, 2012. Figura 3. Varreduras das amostras.

16. RESULTADOS E DISCUSSÕES LINEARIDADE Quadro 5: Concentrações dos padrões de cinarina. CURVA AMOSTRA CONC. (mg/ mL ) ABSORBÂNCIA CONTROLE ABSORBÂNCIA ABS TUBON - ABS CN 1ª CURVA   Tubo 1 – 80% 0,0144 0,396 C1 0,067 0,329 Tubo 2 – 90% 0,0162 0,454 C2 0,065 0,389 Tubo 3 – 100% 0,0179 0,514 C3 0,071 0,443 Tubo 4 – 110% 0,0197 0,569 C4 0,072 0,497 Tubo 5 – 120% 0,0215 0,628 C5 0,077 0,551 2ª CURVA Tubo 1 – 80% 0,0144 0,399 C1 0,065 0,334 Tubo 2 – 90% 0,0162 0,463 C2 0,069 0,394 Tubo 3 – 100% 0,0179 0,516 C3 0,071 0,445 Tubo 4 – 110% 0,0197 0,553 C4 0,076 0,477 Tubo 5 – 120% 0,0215 0,615 C5 0,08 0,535 Fonte: Acervo próprio, 2012 .

17. RESULTADOS E DISCUSSÕES LINEARIDADE Figura 4. Curva de Calibração Fonte: Acervo próprio, 2012.

18. RESULTADOS E DISCUSSÕES PRECISÃO REPETIBILIDADE Quadro 6. Resultados do ensaio de repetibilidade no período da manhã. AMOSTRA ABSORBÂNCIA CONTROLE ABSORBÂNCIA ABS TUBON - ABS CN CONC. NA AMOSTRA (mg/mL) QUANTIDADE (mg) TEOR (%) Tubo 1 0,528 C1 0,119 0,409 0,0971 0,4856 0,486 Tubo 2 0,523 C2 0,121 0,402 0,0957 0,4786 0,479 Tubo 3 0,522 C3 0,121 0,401 0,0955 0,4776 0,478 Tubo 4 0,519 C4 0,121 0,398 0,0949 0,4746 0,475 Tubo 5 0,515 C5 0,120 0,395 0,0943 0,4716 0,472 Tubo 6 0,529 C6 0,120 0,409 0,0971 0,4856 0,489 Fonte: Acervo pr ó prio, 2012.

19. RESULTADOS E DISCUSSÕES PRECISÃO REPETIBILIDADE Quadro 7. Resultados para o ensaio de repetibilidade no período da tarde. AMOSTRA ABSORBÂNCIA CONTROLE ABSORBÂNCIA ABS TUBON - ABS CN CONC. NA AMOSTRA (mg/mL) QUANTIDADE (mg) TEOR (%) Tubo 1 0,520 C1 0,127 0,393 0,0939 2,3487 0,470 Tubo 2 0,522 C2 0,123 0,399 0,0951 2,3785 0,476 Tubo 3 0,527 C3 0,123 0,404 0,0961 2,4034 0,481 Tubo 4 0,521 C4 0,122 0,399 0,0951 2,3785 0,476 Tubo 5 0,517 C5 0,122 0,395 0,0943 2,3586 0,472 Tubo 6 0,523 C6 0,121 0,402 0,0957 2,3934 0,479 Fonte: Acervo próprio, 2012.

20. RESULTADOS E DISCUSSÕES PRECISÃO Quadro 8. Comparação dos resultados no período da manhã e tarde para o ensaio de repetibilidade . PERÍODO AMOSTRA TEOR (%) MÉDIA DPR MANHÃ Tubo 1 0,486 0,477 1,023 Tubo 2 0,479 Tubo 3 0,478 Tubo 4 0,475 Tubo 5 0,472 Tubo 6 0,489 TARDE Tubo 1 0,470 Tubo 2 0,476 Tubo 3 0,481 Tubo 4 0,476 Tubo 5 0,472 Tubo 6 0,479 Fonte: Acervo próprio, 2012.

21. RESULTADOS E DISCUSSÕES PRECISÃO INTERMEDIÁRIA Fonte: Acervo próprio, 2012. ANALISTA AMOSTRA TEOR (%) MÉDIA DPR ANALISTA 1 Tubo 1 0,486     0,483       2,069   Tubo 2 0,479 Tubo 3 0,478 Tubo 4 0,475 Tubo 5 0,472 Tubo 6 0,486   ANALISTA 2 Tubo 1 0,461 Tubo 2 0,491 Tubo 3 0,496 Tubo 4 0,492 Tubo 5 0,494 Tubo 6 0,490 Quadro 9 . Resultados para o ensaio de precisão intermediária .

22. RESULTADOS E DISCUSSÕES EXATIDÃO AMOSTRA PADRÃO CINARINA CONCENTRAÇÃO CINARINA (mg/ mL ) PESADO (mg) PUREZA (%) PESO CORRIGIDO CONC. SOL. MÃE (mg/ mL ) 80% 100% 120% Sol. Mãe Padrão de Cinarina 2,75 99,49 2,74 0,10944 0,01523 0,01903 0,02284 Quadro 10. Concentração das soluções para o ensaio de exatidão. Fonte: Acervo próprio, 2012.

23. RESULTADOS E DISCUSSÕES EXATIDÃO AMOSTRA ABSORBÂNCIA CONTROLE ABSORBÂNCIA ABS TUBON -ABS CN CONC. (mg/mL) MÉDIA (mg/mL) MÉDIA CORRIGIDA (mg/mL) Placebo- 1 0,006 C1 0,003 0,003 0,0028 0,0028 0,0001 Placebo - 2 0,006 C2 0,003 0,003 0,0028 Placebo - 3 0,006 C3 0,003 0,003 0,0028 80% - 1 0,41 C1 0,067 0,343 0,0146 0,0149 0,0148 80% - 2 0,42 C2 0,067 0,353 0,0150 80% - 3 0,426 C3 0,067 0,359 0,0152 100% - 1 0,506 C1 0,074 0,432 0,0177 0,0180 0,0179 100% - 2 0,52 C2 0,074 0,446 0,0182 100% - 3 0,518 C3 0,074 0,444 0,0181 120% - 1 0,63 C1 0,067 0,563 0,0222 0,0220 0,0219 120% - 2 0,622 C2 0,067 0,555 0,0219 120% - 3 0,622 C3 0,067 0,555 0,0219 Quadro 11 . Resultados obtidos no ensaio de exatidão. Fonte: Acervo próprio, 2012.

24. RESULTADOS E DISCUSSÕES EXATIDÃO Quadro 12. : Recuperações obtidas no ensaio de exatidão para os 3 níveis avaliados. AMOSTRA CONC. TEÓRICA (mg/ mL ) CONC. PRÁTICA (mg/mL) RECUPERAÇÃO (%) RECUPERAÇÃO MÉDIA (%) 80% - 1 0,01523 0,01450 95,26 97,23 80% - 2 0,01523 0,01485 97,53 80% - 3 0,01523 0,01506 98,89 100% - 1 0,01903 0,01758 92,65 94,23   100% - 2 0,01903 0,01801 95,20 100% - 3 0,01903 0,01800 94,84 120% - 1 0,02284 0,02212 100,50 99,66   120% - 2 0,02284 0,02184 99,24 120% - 3 0,02284 0,02184 99,24 Fonte: Acervo próprio, 2012.

25. RESULTADOS E DISCUSSÕES ROBUSTEZ Quadro 13. Resultados obtidos no ensaio de robustez . PARÂMETRO MODIFICADO MÉDIA ABS. TESTE MÉDIA ABS. CONTROLE TEOR (%) DPR Tempo de extração (min) 8 0,518 0,124 0,52 0,00 10 0,512 0,119 0,52 - 12 0,505 0,110 0,52 0,00 Tempo de reação do nitrito de sódio (min) 2 0,505 0,115 0,52 1,30 3 0,523 0,120 0,53 - 4 0,532 0,121 0,54 1,30 Tempo de leitura no uv -vis (min) Imediatamente 0,523 0,120 0,53 - 5 0,56 0,121 0,57 5,10 10 0,55 0,109 0,58 6,40 Marca do nitrito de sódio Fmaia 0,523 0,120 0,53 - Synth 0,524 0,126 0,52 1,30 Marca do hidróxido de sódio Vetec 0,523 0,120 0,53 - Synth 0,530 0,125 0,53 00 Temperatura das soluções ( ºc ) 23 0,512 0,119 0,52 - 15 0,520 0,120 0,53 1,30 Fonte: Acervo próprio, 2012.

26. RESULTADOS E DISCUSSÕES ADEQUABILIDADE DO SISTEMA Quadro 14. Resultados conforme o dia de análise . REAGENTES AMOSTRA ABSORBÂNCIA CONTROLE ABSORBÂNCIA CONC. NA AMOSTRA (mg/mL) TEOR (%) DPR Soluções preparadas no dia Tubo 1 0,489 C1 0,116 0,0900 0,477 0,562 Tubo 2 0,517 C2 0,122 0,0943 Tubo 3 0,56 C3 0,127 0,1019 Soluções após 24 h do preparo Tubo 1 0,485 C1 0,112 0,0900 0,471 Tubo 2 0,511 C2 0,118 0,0939 Tubo 3 0,543 C3 0,124 0,0991 Fonte: Acervo próprio, 2012.

27. CONCLUSÃO Segundo a RE nº 899 da ANVISA uma validação analítica tem como objetivo demonstrar que o método é apropriado para a finalidade pretendida, ou seja, a determinação qualitativa, semi-quantitativa e/ou quantitativa de fármacos e outras substâncias em produtos farmacêuticos Com os resultados aqui demonstrados é possível afirmar que o método desenvolvido utilizando espectrofotômetro UV-VIS, é confiável na determinação do teor. O método desenvolvido e validado mostrou resultados positivos na seletividade, linearidade, precisão exatidão e robustez, que são critérios para que um método possa ser validado .

28. AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus, por toda força e determinação para realizar este trabalho. Aos meus pais, pelo apoio e confiança à mim depositada durante todos estes anos. À orientadora de estágio, Professora Maria Ana Pignatel , pela dedicação durante a realização deste trabalho . À supervisora de campo, Letícia Rechia, pela dedicação e ajuda durante o período de estágio. À empresa Airela Indústria Farmacêutica por me proporcionar a realização desta pesquisa e por fim, a elaboração deste método . À todos meus colegas, de trabalho e do próprio curso, que me apoiaram e me ajudaram nesta etapa.

29. REFERÊNCIAS ANVISA . Guia Para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos . Resolução N o 899 de 29 de maio de 2003. CALIXTO; J.B. Medicamentos Fitoterápicos. In: YUNES, R. A. & CALIXTO, J. B. (Orgs.). Plantas medicinais sob a ótica da química medicinal moderna. Chapecó : Argos, 2001. p.297-315 CARVALHO, J.C.T.; GOSMANN, G.; SCHENKEL, E.P. Compostos fenólicos simples e heterosídicos . In: Farmacognosia: da planta ao medicamento . 5 ed. rev. ampl ., primeira reimpressão. Porto Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS/Editora da UFSC, 2004. p. 371-400. MIGUEL, M.D.; MIGUEL, O.G. Desenvolvimento de fitoterápicos . Ribeirão Preto : Tecmedd , 2004. 115p. NOLDIN, F.V.; CECHINEL, V. et al. Composição química e atividades biológicas das folhas de  Cynara scolymus  L. (alcachofra) cultivada no Brasil. Química Nova:  vol.26 no.3 São Paulo May/ June   2003. Disponível em:http :// www.scielo.br/ scielo.php?pid =S0100-40422003000300008&script= sci_arttext . Acesso em: 11 jun , 2012.

30. REFERÊNCIAS PINTO, A.C.; SILVA, D.H.S.; BOLZANI, V.S. et al. Produtos naturais: atualidade, desafios e perspectivas. Quím. Nova , São Paulo, v. 25, supl. 1, p.45-61, 2002. VEIGA JUNIOR, V.F.; PINTO, A.C.; MACIEL, M.A.M. Plantas medicinais: cura segura ? Quím. Nova , São Paulo, v. 28, n. 3, p.519-528, 2005. SIANI, A.C. (Coord.). Desenvolvimento tecnológico de fitoterápicos: plataforma metodológica . Rio de Janeiro: Scriptorio , 2003. 97p. RIBEIRO, C.A.F. Justifica-se o uso de extractos de plantas medicinais na terapêutica da ansiedade e da depressão? Revista Saúde Mental , v. II, n.4 , p. 9- 14, 2000. MARTIN BAUER GROUP: Encarte de apresentação MARTINEZ, Marina. Materiais de Laboratório. Espectrofotômetro. Publicado em: 21/07/2010. Disponível em:http :// www.infoescola.com/materiais-delaboratorio/espectrofotometr Acesso em: 11 jun , 2012.

31. VALIDAÇÃO ANALÍTICA DA CINARINA ACADÊMICA: SILVIA DOS SANTOS NEVES ORIENTADORA.:Dra MARIA ANA PIGNATEL MARCON MARTINS UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA UNISUL CURSO DE QUÍMICA INDUSTRIAL JUNHO, 2012