VDRL - TPHA

Sérodiagnostic de la syphilis

1. Sérodiagnostic de la Syphilis VDRL-TPHA Par : S / Abdessemed

2. INTRODUCTION Le diagnostic sérologique repose sur la mise en évidence des anticorps induits par l’infection et retrouvés dans le sérum. Le sérum est traité pour retirer certaines substances qui peuvent gêner la technique ce qui aboutit à une certaine dilution Le patient doit être de préférence à jeun

3. Les réactions sérologiques Réaction à antigène non tréponémique (Ag cardiolipidique ) Réaction à antigène tréponémique

4. : VDRL( veneral disease research laboratory ) Principe : Réaction d’agglutination passive sur lame en verre. Antigène utilisé est d’origine cardiolipidique constitué de microcristaux de cholestérol sur lesquels sont adsorbés les molécules de cardiolipide = Haptène de Wasserman . Des particules de charbon sont piégés dans la combinaison Ac -Ag pour faciliter la lecture.

5. Matériel et réactifs Sérum frais. Eau physiologique. Antigène VDRL près à l’emploi. Matériel: Centrifugeuse Micropipettes réglables ( 5-50µL) Plaques en verre Portoir pour tubes à hémolyse Agitateur rotatif de Kline Container de déchets contaminés Eau de Javel

6. Mode opératoire: Réaction qualitative Réaction quantitative ( dépistage) (dépistage positif) Deux types de réactions

7. Réaction qualitative Distribuer 50µL de sérum sur chaque puit de la plaque en verre. Ajouter 16µL d’Antigène VDRL. Placer la plaque sur l’agitateur de Kline pendant 8mn. Lire immédiatement au microscope.

8. Puits Témoin  + Témoin  - Témoin  Ag VDRL Sérum inconnu Sérum 50 µl de S + 50 µl de S - 50µL d’eau physiologique 50 µl de sérum  inconnu. Antigène VDRL     16µl    16µl    16µl    16µl   Placer sur un plateau rotatif (agitateur de kline ) pendant 8 minutes. Lecture  +  -  -  

9. Pas d‘agglutination   Agglutination : + Lecture

10. Lecture Agglutination : +++   Agglutination : ++

11. Réaction quantitative Lorsque la réaction qualitative est positive on réalise la même réaction avec une série de dilution du sérum au (1/2, 1/4, 1/8, 1/16,1/32…) avec de l’eau physiologique. Le titre d’anticorps est exprimé par l’inverse de la dernière dilution donnant une réaction positive nette.

12. Puits 1 2 3 4 5 Eau physiologique 50µl 50µl 50µl 50µl 50µl Dilution    1 / 2   1 / 4 1 / 8  1 / 16  1 / 32 Sérum à analyser En µl 50 reporter reporter 50   reporter 50   reporter 50 jeter 50µl dans l’eau de Javel Ag VDRL   16µl    16µl    16µl    16µl    16µl   agitation pendant 8 minutes. Lecture          

13. TPHA: ( Treponema pallidum hemagglutination assay) Principe: Réaction d’ hemmagglutination passive réalisée sur des microplaques. L’Antigène utilisé est un lysat de tréponema pallidum adsorbé sur des hématies. Le dépistage consiste à tester le sérum à la dilution de 1/80. Des dilutions sont effectuées pour le titre dans le cas du dépistage positif.

14. Matériel et réactifs Sérum frais Coffret de réactif pour TPHA: Hématies tests Hématies contrôles Diluant Témoin positif Témoin négatif

15. Centrifugeuse Micropipette réglable (5 -50 µL),( 50 – 200 µL) Pipette multicanaux Plaque de microtitration à fond en U Portoir pour tubes à hémolyse Container de déchets contaminés

16. Mode opératoire : Deux types de réactions Réaction qualitative Réaction quantitative ( dépistage) (dépistage positif)

17. Technique qualitative   1. chaque échantillon va utiliser 3 puits de la plaque . 2. Déposer 190µl de diluant et 10 µl de sérum dans le puit 1. 3. Avec une pipette, mixer le contenu du puit 1 et en transférer 25µl aux puits 2 et 3. 4. Homogénéiser complètement le réactif TPHA et le contrôle TPHA. Ajouter 75 µl de contrôle TPHA au puit 2 et 75 µl de réactif TPHA au puit 3.

18. 5-Agiter doucement la plaque jusqu’ à obtenir un mélange homogène de manière à être sur d’éviter une contamination croisée. 6. incuber la plaque pendant 45 à 60 minutes à 18-25°C. Pendant l’incubation, garder la µplaque bien à l’abri de sources de chaleur, des rayons solaires et de toutes vibrations. 7. Lire et consigner les résultats ; les résultats sont stables 24 heures si la plaque est couverte et les précautions ci-dessus respectées.

19. Cupule A B C Diluant en   µl   190 Sérum   en   µl 10 25 * 25 * HS  en   µl 75 HNS  en   µl 75 Lecture + + +

20. Puit 1  : voile uniforme couvrant tout le puit → Fortement positif. Puit 2  : voile couvrant le 2/3 du puit → Moyennement positif. Puit 3  : voile couvrant le 1/3 du puit → Faiblement positifs. Puit 4  : Anneau très serré à bord nets (absence de voile) → Négatif. Lecture des résultats

21. Résultats Cupules échantillons Cupules de contrôle Fortement positif Aspect de voile couvrant uniformément le fond de la cupule Pas d’agglutination ; aspect de bouton compact Faiblement positif Aspect de voile couvrant approximativement 1/3 du fond de la cupule Pas d’agglutination ; aspect de bouton compact indéterminé Aspect de voile montant clairement un anneau central distinct (voile non uniforme) Pas d’agglutination ; aspect de bouton compact Négatif Aspect de bouton compact montrant clairement un petit anneau central clair Pas d’agglutination ; aspect de bouton compact Non spécifique Réaction positive Réaction positive Interprétation des résultats  

22. Technique quantitative 1. Chaque échantillon va utiliser 8 puits de la plaque labellisés de A à H. 2. Déposer 25µl de diluant dans les puits de B à H uniquement. 3. Transférer 25µl de sérum dilué au 1/20 dans les puits A et B uniquement. 4. Prendre 25 µl du sérum dilué du puit B et effectuer des doubles dilutions du sérum des puits B et H inclus et éliminer les 25 µl de sérum du puit H.

23. Ajouter 75µl de réactif TPHA au puit A à H inclus. 6. Agiter doucement la plaque jusqu’à obtenir un mélange homogène. 7. Incuber la plaque pendant 45 à60 minutes à 18-25°C. pendant l’incubation, garder la plaque bien à l’abri des sources de chaleur, des rayons solaires et de toutes vibrations. 8. Lire et consigner les résultats ; les résultats sont stables 24 heures si la plaque est couverte et les précautions ci-dessus respectées.

24. Cupule A B C D E F G H Diluant en   µl   25 25 25 25 25 25 25 Sérum 1/20  en  µl 25 25 * 25 * 25 * 25 * 25 * 25 * 25 ** HS  en  µl 75 75 75 75 75 75 75 75 Dilution 1 / 80 1 / 160 1 / 320 1 / 640 1 / 1280 1 / 2560 1 / 5120 1 / 10240 Lecture + + + + + - - - Titre retenu 1280 ( dernière cupule présentant une hémagglutination nette ).                       * :   reporter 25 µl dans la cupule suivante à gauche.                     * *:    jeter 25 µl dans l'eau de javel. 25

25. Absorption non spécifique 1. Déposer 100µl de l’échantillon dans un petit tube et ajouter 400µl de contrôle TPHA. 2. Bien mélanger le tube 3 . Centrifuger le tube 15 minutes à 1000 rpm et tester le surnageant par la méthode qualitative.

26. 4. Remarque : l’échantillon est maintenant à 1/5 ; ceci doit être pris en compte lors de la préparation des dilutions. 5 . Si le résultat est de nouveau non spécifique, l’échantillon doit être testé par une autre technique telle que le FTA-ABS.