Western blot

Cuantificacion de proteinas.

1. Western blot Ma. Elisa Carrión B. Viviana Lliguicota Nancy Riera Vanessa Llerena Israel Rivera Karla Tenesaca José David Terán.

2. técnica analítica usada para detectar una proteína específica en un extracto crudo mediante el uso de anticuerpos. Los anticuerpos son proteínas producidas por el sistema inmune  ( INMUNOGLOBULINAS  capaces de detectar proteínas ajenas  ( ANTÍGENOS ) y unirse específicamente a ellas Western blot

3. COMIENZA CON UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA EN GEL DE POLIACRILAMIDA PARA SEPARAR LAS PROTEÍNAS DE LA MUESTRA LAS PROTEÍNAS YA SEPARADAS SON TRANSFERIDAS A UNA MEMBRANA DE NITROCELULOSA LAS UNE CON FIRMEZA

4. UNA VEZ QUE LAS PROTEÍNAS FUERON SEPARADAS EL GEL SE RECUBRE CON UNA HOJA DE NITROCELULOSA SE CUBRE CON UNA CAPA GRUESA DE TOALLAS DE PAPEL SE COMPRIME CON UNA PLACA PESADA. EL LÍQUIDO EN EL GEL SE TRANSFIERE A TRAVÉS DE LA NITROCELULOSA. otra posibilidad: EMPLEAR LA ELECTROTRANSFERENCIA  APLICAR UNA CORRIENTE ELÉCTRICA Y LA UTILIZACIÓN DE UN TAMPÓN DE TRANSFERENCIA PARA LLEVAR LAS PROTEÍNAS DESDE EL GEL A LA MEMBRANA.

5. SE APILAN EN FORMA DE SÁNDWICH LOS SIGUIENTES ELEMENTOS: ESPONJA, PAPELES EMPAPADOS CON BUFFER DE TRANSFERENCIA, GEL, MEMBRANA, PAPELES EMPAPADOS CON BUFFER Y ESPONJA, Y LUEGO SE LE APLICA UNA CORRIENTE ELÉCTRICA A TODO EL MONTAJE PARA QUE LAS PROTEÍNAS CORRAN AL POLO POSITIVO Y SE ATRAPEN EN LA MEMBRANA .

6. ELECTROBLOTTING

7. Procedimiento

8. La electroforesis

9. Variantes de la electroforesis

10. TIPOS Según el tipo de detección de las proteínas.

11. Directo

12. Indirecto

13. MEMBRANAS EN LA UTILIZACION DE WETR BLOG ventajas sobre el emplearlas dentro del gel

14. 1 . Inmovilización de proteínas sobre la membrana, generalmente mediante electro-transferencia .

15. 2. Bloqueo o saturación de todos los lugares de unión de proteínas de la membrana no ocupados para evitar la unión no específica de anticuerpos . Riesgo de backround Proteínas no específicas

16. 3. Incubación del ' blot ' con anticuerpos primarios contra la/s proteína/s de interés . Unión Respuesta inmune Incubación en disolución 30 min a una noche entera

17. 4 . Incubación del ¨ blot ¨ con anticuerpos secundarios, o reactivos que actúan de ligando para el anticuerpo primario unido a enzimas u otros marcadores.

18. 5. Sistema de revelado delas bandas de proteínas marcadas con el complejo de anticuerpos.

19. Elección del sistema de relevado

20. 6. Lavado de membrana

21. Western Blot Se usa principalmente para determinar la presencia o ausencia de una proteína concreta en una muestra, los niveles y tamaño de este. Enfermedades inflamatorias Aplicación Prueba del VIH Enfermedades infecto contagiosas Enfermedades de citoquinas en modelos experimentales Factores de crecimiento Proteínas de secreción Técnicas relacionadas Detección en el propio gel (“ UnBlot ® In-Gel Detection”) Far -Western Blot Detection Permite la detección de proteínas que no se transfieren con eficiencia desde el gel a la membrana Evita las perdidas de proteínas durante el proprio paso de transferencia Su utilización es para la búsqueda de interacciones entre proteínas. Utiliza una proteína marcada en lugar de un anticuerpo como sonda en la membrana

22. Western Blot Ventajas Desventajas Sensibilidad: Detecta un mínimo de 0,1ng de proteína de una muestra Alto costo : Costo individual de anticuerpos marcados, analistas y equipos de laboratorio Especificidad: Detección del tamaño de la proteína Especificidad antígeno – anticuerpo Detector selectivo de una proteína Cuestiones Técnicas: Requiere de precisión Un pequeño error del reactivo es desastroso

23. Procedimiento Electroforesis en gel de poliacrilamida para separar las proteínas de la muestra Se realizará un SDS-PAGE en un gel 7%. Ejemplo Western Blot

24. 10 muestras conteniendo 1 µl de diluciones 1/2 de suero de ratón, partiendo desde una dilución 1/10.

25. Retirar el gel entre los vidrios con cuidado y realizar un lavado con TBS .

26. .

27. SOLUCIÓN 1: SOLUCIÓN 2 : 100 µL DE LUMINOL 6,1 µL DE H2O2 44 µL DE ÁCIDO P-CUMÁRICO 1ML DE TRIS-HCL 1M PH 8.5 1 ML DE TRIS- HCL 1M PH 8.5 LLEVAR A VOLUMEN FINAL 10 ML COM H 2 O

28. En obscuridad :

29. Gracias