11. Técnicas de manipulación genética.pptx

biología molecular técnicas de manipulación

1. TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA Dra. Carolina Flores Genética 2020

2. Índice

3. Introducción: la clonación molecular La clonación consiste en la obtención de un clon, entendido como un conjunto de elementos genéticamente iguales entre si e iguales a su precursor.

4. ... ¡¡ Dios mío, me han clonado... !!

5. Estrategia general del proceso de clonación 1. Aislamiento del ADN foráneo 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector-DNA foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

6. Estrategia general del proceso de clonación 1. Introducción: la clonación molecular 1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector-ADN foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética Cortar el ADN foráneo y el vector con las mismas enzimas de restricción

7. Vectores de clonación 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Son vehículos de ADN para ADN , capaces de recibir ADN foráneo y replicarlo. Características principales Se replican de forma autónoma ( origen de replicación ) Contienen regiones no esenciales para su multiplicación y estabilidad

8. Tipos de vectores Plásmidos Permiten insertar hasta 20 kb de ADN pero son más eficaces con insertos más pequeños (<10kb). Contienen genes de resistencia a antibióticos. Virus Permiten insertar 15-20 kb. El sistema de infección del virus permite la entrada del ADN en E. coli . Los virus de cadena sencilla tienen aplicaciones especiales para secuenciar y realizar mutagénesis . Vectores híbridos: cósmidos . Permiten insertar hasta 40 kb.

9. Tipos de vectores de clonación 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Plásmidos (bacterianos) Virus Cósmidos (laboratorio) YACs (levaduras)

10. Plásmidos 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN pBR322 -Control relajado -Fenotipo seleccionable -Cierto N º de sitios de restricción -Bajo PM (4 363 bp ) (transformación con plásmidos 10,000 bp es poco eficiente) ADN Plasmídico ADN ADN Plasmídico

11. Es un plásmido muy utilizado, ya que presenta unas características que son muy beneficiosas: Son derivados del pBR322. Es pequeño: puede transportar fragmentos de ADN relativamente grandes Tiene un origen de replicación y puede producir hasta 500 copias de los fragmentos de ADN insertado por célula. Se ha modificado para que presente muchas secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción que se han agrupado en una región denominada  polylinker  o  multiple cloning site . Contiene un fragmento del gen bacteriano  lacZ  que produce colonias de color azul. pUC18

12. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Para bacterias: Fago l y derivados, Fago M13 Para plantas: CaMV Para mamíferos: SV40 Virus: se emplea como vector, junto con la capacidad que poseen para introducir el ADN foráneo en la célula hospedadora

13. Virus 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN -El corte por los sitios cos y el empaquetamiento en la cápsida puede hacerse in vitro . La cápsida admite entre 38 y 53 Kb (-20% y + 10% del DNA l). Se introduce en la bacteria hospedadora por transducción Fago λ

14. Adsorción de particulas virales a una bacteria

15. SIDA

16. Tipos de vectores de clonación 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Plásmidos (bacterianos) Virus Cósmidos (laboratorio) Mezcla plásmido y virus YACs (levaduras), contienes sitios característicos de la funcionalidad de los cromosomas V

17. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN COSMIDO Un plásmido que posee el sito cos del fago l S ecuencias plasmídicas necesarias para la replicación y genes de resistencia a antibióticos  50 kb de ADN insertado

18. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Levaduras Vector YAC 100- 1000 kb T elómeros en sus extremos Un origen de replicación Un centrómero Genes marcadores de selección Enzimas de restricción para insertar ADN exógeno

19. Estrategia general del proceso de clonación 1. Introducción: la clonación molecular 1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector-ADN foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética Cortar el ADN foráneo y el vector con las mismas enzimas de restricción Vector de clonación

20. Estrategia general del proceso de clonación 1. Introducción: la clonación molecular 1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector-ADN foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

21. Formación de ADN recombinante: unión ADN foráneo-vector 3. Vectores de clonación y unión del framento de ADN

22. 3. Vectores de clonación y unión del framento de ADN Enzimas de restricción Vector ADN

23. Estrategia general del proceso de clonación 1. Introducción: la clonación molecular 1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector-ADN foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

24. Transformación. Transducción

25. Estrategia general del proceso de clonación 1. Introducción: la clonación molecular 1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector-ADN foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

26. MÉTODOS DE SELECCIÓN

27. Resistencia a antibióticos La resistencia la confieren genes que porta el vector, en este caso a ampicilina y a tetraciclina Plásmido pBR322 El ADN foráneo se inserta en el gen de resistencia a Ampicilina

28. Sin plásmido Sin inserto 5. Métodos de selección Resistencia a antibióticos La resistencia la confieren genes que porta el vector Con ampicilina y tetraciclina Con plásmido Sin inserto Con plásmido Con inserto Con tetraciclina

29. 5. Métodos de selección MÉTODOS DE SELECCIÓN Resistencia a antibióticos Genes marcadores (gen b-galactosidasa) GFP ( green fluorescent protein ) Hibridación de colonias

30. 5. Métodos de selección Genes marcadores (ej: gen b-galactosidasa) 5-Br-4-Cl-3-indolil-b-galactósido  Br-Cl-indol + galactosa (X-gal) (Azul) Inactivación insercional (introducir el DNA foraneo en el medio del marcador) Inserción génica positiva (Unir el gen marcador al DNA foraneo) Amp Gal Ori pUC19

31. 5. Métodos de selección Genes marcadores ( gen b-galactosidasa) Plasmido pUC19 Amp Gal Ori Plasmido pUC19 Amp Gal + inserto Ori

32. 5. Métodos de selección Genes marcadores b-galactosidasa

33. 5. Métodos de selección b-galactosidasa b-galactosidasa + ADN foráneo pUC19 = plásmido X

34. 5. Métodos de selección GFP ( green fluorescent protein )

35. 5. Métodos de selección 510 488 Tubulina GFP-TUB 530 515 Retículo endoplásmico YFP-ER 510 488 Peroxisomas GFP-PEROXI 530 515 Núcleo YFP-NUC 475 420 Mitocondria CFP-MITO 600 550 Mitocondria RFP-MITO 510 488 Membrana M-GFP 510 488 Endosomas GFP-ENDO 475 420 Ap. De Golgi CFP-GOLGI 510 488 Actina GFP-ACTIN Emisión (nm) Excitación (nm) Localización Vector GFP ( green fluorescent protein )

36. Estrategia general del proceso de clonación 1. Introducción: la clonación molecular 1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector-ADN foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

37. Genotecas Genoteca : colección de clones que contiene todo el genoma de un organismo . Tipos de genotecas : Genómicas Parciales ADNc . Colección de ARNm Tipos de vectores : Plásmidos ( Genotecas parciales ) Fagos ( Genotecas genómicas pequeñas y de ADNc ) Cósmidos , BAC ( genotecas genómicas complejas )

38. 6. Obtención de genotecas Utilizando un virus Utilizando un plásmido

39. 5. Métodos de selección Hibridación de colonias Consiste en detectar secuencias de DNA en colonias transformadas mediante hidridación “in situ” con sondas marcadas Obtención de la sonda marcada: marcaje radioactivo: ( 32 P) marcaje desoxinucleótidos fluorescentes

40. ¿CÓMO SE HACE UNA PLANTA TRANSGÉNICA? 1 . técnicas indirectas: transformación de células mediada por Agrobacterium tumefaciens . 2. técnicas directas: electroporación, microinyección, liposomas y métodos químicos. Aplicaciones de la ingeniería genética

41. APLICACIONES DE LAS PLANTAS TRANSGÉNICAS Resistencia a herbicidas, a insectos y a enfermedades microbianas . Ej. Bacillus thuringiensis (toxina - Bt ) Incremento del rendimiento fotosintético transfieren los genes de la ruta fotosintética de plantas C4 que es más eficiente. Mejora en la calidad de los productos agrícolas Tal es el caso de la colza y la soja transgénicas que producen aceites modificados, que no contienen los caracteres indeseables de las plantas comunes. Síntesis de productos de interés comercial Existen ya plantas transgénicas que producen anticuerpos animales, interferón, e incluso elementos de un poliéster destinado a la fabricación de plásticos biodegradables. Asimilación de nitrógeno atmosférico se ensaya la transfección del gen nif responsable de la nitrogenasa .

42. ¿Cómo se hace un animal transgénico? La transgénesis puede efectuarse siguiendo dos estrategias distintas: Transgénesis por microinyección de zigotos Transgénesis por manipulación de células embrionarias