6 Investigacion de anticuerpos irregulares

Parte 06 del Módulo IV del Diplomado en Hematología y Banco de Sangre.
Ponente: Dr. Carlos Esquerre Aguirre
Fecha: 13 de Setiembre de 2015. Trujillo - Perú.

1. DIPLOMADO EN HEMATOLOGÍA Y
BANCO DE SANGRE
MÓDULO IV (13 de Setiembre de 2015)
CLASE 6

2. 2
INVESTIGACIÓN DE
ANTICUERPOS IRREGULARES

3. GENERALIDADES
Losaloanticuerposantieritrocitarios,diferentes
delosAcnaturalesanti-Aoanti-Bse
denominaninesperadosoirregulares.
UnaloanticuerpoesaquélAcqueseproduce
comoresultadodelaexposicióndeun
organismoaAgextraños.
Desdeelpuntodevistadelamedicina
transfusional,losAccontralosAgsanguíneosse
clasificacomo: 3

4. GENERALIDADES
AccontraAloantígenos:Losqueseproducen
contraAgdeeritrocitos,leucocitosyplaquetas.
AccontralospropiosAgdelindividuo:
AutoanticuerposcontraAg.eritrocitariosy
plaquetasylosproducidosenenfermedades
autoinmunes.
Detalformaseconsideraalosanticuerpos
autoinmunes como anticuerposirregulareso
adquiridosyalosaloanticuerposlospodemosdividir
en:
4

5. GENERALIDADES
Regularesnaturales:producidosconel
SistemaABO(anti-Ayanti-B).
Irregularesnaturales:antiA1,anti-M,
anti-N,anti-P1,anti-E,entreotros.
Irregularesadquiridosoinmunes:
antisistemaRh-Hr(anti-D,anti-c,anti-C
yotros),anti-Kell,anti-Duffy.
5

6. GENERALIDADES
Ac naturalesregulares:
PreferentementeIgM.Fijan
demanera eficienteel
complemento. Pueden
provocarlisisintravascular
insuficienciarenaleincluso
lamuertedelpaciente.
6
Acadquiridosoinmunes:
Generalmente IgG.
Producen hemólisis
extravascularenelbazoo
enelhígado,mediante
fagocitosisdelcomplejo
eritrocito+Ac.

7. 7
Sonaquelloscapaces deinducirreacciónhemolíticacon
acortamiento“invivo”delavidadeloshematíesincompatiblesoen
laEHRN.
Sinónimo:Aloanticuerpos.
Porestimulaciónantigénica:
–Transfusión de hematíes
–Embarazos o abortos
–Mecanismos desconocidos
Incidencia:
–Población general 0,3 a 2,0%.
–Politransfundidos 9%.
¿Qué son Anticuerpos Irregulares?
¿Cómoseformanlosaloanticuerpos?
37°C C’

8. 8
¿Son importantes?
Ac.consideradosimportantesopotencialmente
peligrososdesignificadoclínico:
–Anti-D (D, C, c, E, e), Kell, Duffy, SsU, Diego
(Dl
a
)
Ac.quepuedenserdesignificadoclínicoo
importanciacuestionable:
–Anti-Le
a
, Le
b
, -M, -N, -P1, I, Cartwright.
Ac. que casi nunca presentan significado clínico
o sin importancia:
–Anti-Ch/Rg(Chido/Rodgers), York (yka),
Sda, Xga, Bg.

9. 9
¿Cuándo estudiarlos?
Suministrodesangrecompatible:Type&Screen
(GS+Detecciónanticuerpos).
Evaluaciónprenatal:MujerRh-sinanti-D
(inmunoprofilaxis)ó↑↑título(evaluaciónfetal).
EvaluacióndelaEHRN:Identificarlacausa.
Evaluacióndeanemiashemolíticas:Causa,
clasificar,sangrecompatible,aloanticuerpos
escondidos.
Resolucióndereaccionestransfusionalhemolítica:
Investigacióndelacausa,reaccióntardía(10
Ac/GR)

10. 17/09/2015 10
Objetivosde Investigar Anticuerpos
-Conocerlapresenciadeanticuerposclínicamente
significativofueradelsistemaABO.
-Obtenerlosconocimientosteóricosybásicosparala
realizacióndeestaprueba.
-Comprobarquelospacientesnotengananticuerpos
noesperados(anticuerposirregulares).Losúnicos
esperadosdebenserloscorrespondientesalSistema
ABO.
-Asegurarlasupervivenciadeloshematíesyminimizarlos
riegosparalasaluddelpaciente.

11. Aglutinación en medio macromolecular
(albúmina,dextrán,gelatina,polivinilpirrolidona-
PVP);laalbúminaincrementalaconstante
dieléctricadelagua,loquedisminuyeelpotencial
Z.EldextrányelPVPpotencializanlareaccióncon
puentesdepolímeros.
PruebaCoombs;esútilparaponerdemanifiesto
anticuerposincompletososensibilizantes.
Solucionesdebajafuerzaiónica;reducenla
barreraelectroestáticafacilitandolareacciónAg-
Ac.
11
ELEMENTOS QUE INFLUYEN ENLA REACCIÓN
Ag-Ac EN LA BÚSQUEDA DE ANTICUERPOS
IRREGULARES

12. Enzimas;potencializanlareacciónAg-Acreduciendola
superficiedecargayremoviendoestructurasqueinterfierenen
elaccesodelasmoléculasdelAc.
Centrifugación;aceleralareacciónAg-Ac,porlafuerzaque
producelamisma.
Temperatura;afectalareacciónAg-AcdeacuerdoalaT°
óptimadereacción:4a22°CparalosAcfríos,o37°Cparalos
Accalientes.
ProporcióndeAg-Ac;importanteenlabúsquedadelazona
deequivalenciadelareacciónAg-Ac.
12
ELEMENTOS QUE INFLUYEN ENLA REACCIÓN
Ag-Ac EN LA BÚSQUEDA DE ANTICUERPOS
IRREGULARES

13. 13
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS
POR CÉLULAS PANTALLA
Reactivos:
NaCl9%
SuspensióndeGRdel
donante5%
CélulaPantallaI
CélulaPantallaII
Albúmina22%
Antiglobulina humana
poliespecífico
CélulaControldeCoombs
IDENTIFICACIÓN DE
ANTICUERPOS POR CÉLULAS
PANEL
Reactivos:
NaCl9%
SuspensióndeGRdel
donante5%
CélulasPanel
Albúmina22%
Antiglobulina humana
poliespecífico
CélulaControldeCoombs
Sinónimos:
Detección,pantalla,escrutinio,pesquisa,rastreo,
screening,tamizaje,Coombsindirecto.

14. 17/09/2015 14
Célulasqueseutilizanpara
deteccióndeanticuerpos
antieritrocitarios.
Generalmente vienen
identificadasconnúmeros
romanosI,II,III.
Sonpreparadasapartirde
sangre donada por
individuos de grupo
sanguíneoO.
CÉLULAS PANTALLA CÉLULAS PANEL
Son glóbulos rojos
seleccionadosconantígenos
de grupo sanguíneo
conocidos.
Provienen de distintos
individuos.
Paraserfuncionalelpanelde
glóbulosrojosdebeidentificar
con certeza los
aloanticuerpossignificativos.

15. Panel

16. 17/09/2015 16
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS POR
CÉLULAS PANTALLA

17. 17
Técnica en Tubo
EnumerarlostuboscomoI,II,IIIsegúnseaelcaso2ó3células.
FaseSalina
2gotasdesuero+1gotadeGR,
centrifugaryleer.
FaseTérmicaoAlbúmina
2gotasdeAlbúminaal22%eincubar
(37°Cx30’).
Centrifugaryleer.
FaseCoombsoAGH
Lavar3vecesconSSF0.9%.Decantar.
2gotasdesueroCoombs(AGH).
Centrifugar,leereinterpretar.
Siennegativoadicionar1gotade
CélulaControlCoombs.

18. 18
Técnica en Gel
En un microtubo
(LISS/Coombs):
-50uldeGR
-25uldesuero/plasma
-Incubar37°Cx15
minutos
-Centrifugaryleer.

19. 19
InterpretacióndelosResultados:
CélulasPantalla
Negativo:
Lareacciónnegativaentodaslascélulasindica
laausenciadeanticuerposirregulares.
Positivo:
Unareacciónpositivaen1ó2célulasyun
autocontrol(-)hacepensarlapresenciadeun
aloanticuerpo.
Dondehayunareacciónpositivaentodaslas
célulasdelapruebayunautocontrol(+),puede
serdebidoaunautoanticuerpo.

20. 20
IDENTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS POR
CÉLULAS PANEL

21. 21
Técnica en Tubo
Enumerartantostuboscomomuestrastengaelpanel(1,2,3,4,hasta
11osegúnseaelcasomáscélulas).
FaseSalina
2gotasdesueroproblema+1gotadeGRdelreactivopanel,encadauno
delostubosrotulados.
Eneltuboparaelautocontrolcolocar1gotadeGRal5%delpropio
paciente,mezclar,centrifugaryleer.
FaseTérmicaoAlbúmina
2gotasdeAlbúminaal22%eincubar(37°Cx30’).
Centrifugaryleer.
FaseCoombsoAGH
Lavar3vecesconSSF0.9%.Decantar.
2gotasdesueroCoombs(AGH).
Centrifugar,leereinterpretar.
Siennegativoadicionar1gotadeCélulaControlCoombs.

22. 22
InterpretacióndelosResultados:
CélulasPanel
POSITIVO:
Laaglutinaciónpresenteen1omástubosdelpanelcon
autocontrol(-).Nosindicalapresenciade1omásAcde
losAgpresentesenelpanel.
NEGATIVO:
Ningunaaglutinaciónentodoslostubosindicala
ausenciadeAcperceptiblesalosAglistadosenelpanel.
AUTOCONTROL POSITIVO:
Indicapresenciadeautoanticuerpo.
TÉCNICASESPECIALES:
Comoautoabsorción(elución)puedenserrequeridas
pararevelarelaloanticuerposubyacente.

23. 23
Ejemplo:
INVESTIGACIÓN DE ANTICUERPOS
IRREGULARES
I II III

24. 24
DETECCION DE ANTICUERPOS IRREGULARES
4 posibilidades
F
S
F
A
F
3
7
°
F
C
--++
----

25. 25ENESTEPANELSEIDENTIFICAQUEELANTICUERPO TIENEACTIVIDADENFASE37°CY
CONELSUEROANTIGLOBULINA HUMANO:ESTIPOIgG.
descartados
F
S
F
A
F
3
7
FC
--++
--++
----
----
--++
----
----
----
--++
--++
----
----
----
----
----
----

26. ¿ES LO MISMO UN AUTOANTICUERPO QUE
UN ALOANTICUERPO ?
Un autoanticuerpo: anticuerpo que esta
dirigido contra antígenos propios del paciente,
pueden ser específicos (el paciente presenta
un fenotipo Rh: EeCy presenta anti-e, anti-E) e
inespecíficos (panaglutininas: aglutinan todo
con una característica homogénea).
Un aloanticuerpoes un anticuerpo que esta
dirigido contra un antígeno que el paciente
no posee. (El paciente presenta un fenotipo
Rh: ECcy presenta un anti-e)

27. REALIZAR LA PRUEBA DE COOMBS DIRECTO
(CD)
Esto es para discernir entre la presencia de un
posible autoanticuerpoo un aloanticuerpo.
CD (+): Posibilidad de estar frente un
autoanticuerpoo un aloanticuerpo+ autoac
¿De que dependerá?
Historia transfusional del paciente¿Ha recibido
unidades de sangre?
Sí (no descartar los aloanticuerpos, siempre y
cuando el tiempo de la transfusión no exceda de
los 90 días)
No (descartar los aloanticuerpos)

28. FINALIDAD
* Detección de AnticuerposIncompletos (IgG)
dirigidos contra antígenos del Glóbulo Rojo.
LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA

29. FINALIDAD
* Detección de Fracciones de Complemento
Fijados en la membrana del Glóbulo Rojo.
LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA
C3d
C3b
C3d
C3b
C3d

30. En resumen:
El principio de la prueba de
A.G.H es detectar
inmunoglobulinas de la clase
Ig G y/o fracciones del
Complemento unidos a los
glóbulos rojos.

31. LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA
PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA (PAD)
o TEST DE COOMBS DIRECTO (TCD)
FINALIDAD
* Detección de GR sensibilizados “in vivo”
-Anticuerpos y/o Complemento fijadosen la
membrana del GR en el torrente sanguíneo.

32. LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA
PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA (PAD)
o TEST DE COOMBS DIRECTO (TCD)
=
GR sensibilizados
“in vivo”
Suero de Coombs
poliespecífico
(Anti-IgG
Anti-C3d) REACCIÓN
POSITIVA

33. LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA
PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA (PAD)
o TEST DE COOMBS DIRECTO (TCD)
APLICACIONES DEL TEST DE COOMBS DIRECTO (TCD)
1.-Investigación de Reacc. Hemolíticas Transf.
2.-Investigación de E. H. R. N.
3.-Investigación de A. H. A. I.
4.-Investigación de Anemias Hemolíticas
inducidas por Drogas.

34. Interpretacion:
Si la prueba muestra aglutinación , se
interpreta POSITIVA, significa que
hubo sensibilización IN VIVO de los
eritrocitos y se informa:
PAD Positiva , señalando en cruces la
intensidad de la reacción, por ej. 4 +
Si no hubo aglutinación, la prueba es
NEGATIVA, y significa que no hubo
sensibilización IN VIVO

35. LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA
TÍTULO Y SCORE DEL TEST DE COOMBS
EQUIVALENCIA ENTRE EL
GRADO DE AGLUTINACIÓN Y EL SCORE
Grado de Aglutinación Score
4 + 10
3 + 8
2 + 6
1 + 4
1/2 + visibles a simple vista3
1/2 + visible al microscopio1
0 o ausencia de aglutinación 0

36. LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA HUMANA
TÍTULO Y SCORE DEL TEST DE COOMBS
IMPORTANCIA DEL TÍTULO Y SCORE
TÍTULO del test
de Coombs (Anti-
IgG)
2 4 8 16 32 64 SCORE
4+ 4+ 3+ 3+ 2+ 1+ 46MUESTRA 1
3+ 3+ 2+ 1+ 0 0 26MUESTRA 2
TÍTULO del test
de Coombs (Anti-
IgG)
2 4 8 16 32 64 SCORE
4+ 4+ 4+ 3+ 2+ 1+ 48MUESTRA 1
4+ 4+ 3+ 3+ 1+ 1+ 44MUESTRA 2
Caso 1
Caso 2

37. CD: 2+
CD Monoespecífico
IgG IgA IgM C3c C3d Ctl
2+ 0 0 0 0 0

38. Existen una serie de técnicas que permiten
realizar procedimientos que proporcionan
ayuda en ciertas determinaciones.
Las uniones Ag Ac se rompen por medios
físicos óquímicos (éter,xileno,digitonina)
Elución por calor (Físico).
Elución por glicina ácida (químico).
Elución por cloroquina(químico).
Absorción

39. Eluciónporcalor:
Consisteendisociarlosanticuerpos
adosadosalhematíeaplicandocalor(56°C)
poruntiempode10min.Loshematíesse
incubanenunasolucióndealbuminaal6%v/v
enuntubodevidrioenconstanteagitación,
luegosecentrifugapor5mina3500rpmyel
sobrenadanteobtenidosedenominaeluato.
Ventajas:sepuedetrabajareleluatoa
maneradesuerosepuedeenfrentara
pantallaparadeterminarqueacesytambién
sepuedetrabajarconloshematíestratados.
Desventajas:ocasionahemólisisdelos
hematíesysecorreelriesgodeperdersitios
antigénicos.

40. Elusión por Cloroquina
Mediante esta técnica se puede realizar el
desprendimiento de los anticuerpos y
despejarlos de los hematíes, se agrega un
volumen de hematíes lavados frente a
cuatro de cloroquinay se deja a T°ambiente
por una hora.
Ventajas: los hematíes no son sometidos
al calor y se trabajaría con ellos.
Desventajas: No se puede trabajar con el
eluato

41. CD de los hematíes

42. ¿Cómo saber que tipo de técnica de
elución utilizar?
Dependerá de lo que se quiera realizar y
con lo que se desee realizar.
Si se desea realizar autoabsorciones
utilizando los hematíes del paciente:
elución por calor/ cloroquina.
Si sólo deseo trabajar con el eluato:
elución por calor.

43. ¿Qué es una autoabsorción?
Consiste en enfrentar el plasma del paciente
con los hematíes eluidoscon la finalidad de
disminuir la cantidad de autoanticuerposdel
plasma (plasma autoabsorbido).
Tiene como finalidad dejar limpio el plasma de
autoanticuerpospara poder evidenciar la
presencia o ausencia de aloanticuerposen el
paciente.
En px, Si al exponer a la pantalla es( +): se trata
sólo de autoac+ aloanticuerpos; si es (-), sólo
se trató de autoanticuerpos.

44. LadeteccióndeunAcysuidentificación,
constituyenunadelasprácticasmás
interesantesenelcampo dela
Inmunohematología.
Muchos deéstosAcsonproblemas
complejos,querequierenciertasfacilidades
enellaboratorioparasuresoluciónyde
partedelinvestigador,exigentiempoy
experiencia.
44
CONCLUSIONES: