785135371-BAI-GIẢNG-KIỂM-NGHIỆM-BUỔI-6-KN-THUỐC-BẰNG-PP-HOA-HỌC-HOA-LÝ.pdf

Kiểm nghiệm dược phẩm

1. BUỔI 6
KIỂM NGHIỆM THUỐC
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HOÁ HỌC , HOÁ LÝ
Mãhọcphần: PCHE239
Họcphần: Hóaphântích& kiểmnghiệmdượcphẩmII
(Analytical Chemistry & Quality Controlof Pharmaceuticals II)
ChươngtrìnhDượcsĩĐạihọc–Sinhviênnăm03
Buổihọc06–03tiết
Giảng viên: ThS.DS Trần Thị Vân Anh
HP họctrước/song hành: Hóa hữu cơ-hóa dược 1
Email: [email protected]
Điệnthoại: [phone]

2. TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu đọc chính
1. TrầnTửAn (2017). Kiểmnghiệmdượcphẩm. Nhàxuất
bảnY học, chương 2, Kiểmnghiệmthuốcbằngphương
pháphoáhọc, trang 37-57
2. TrầnTửAn (2017). Kiểmnghiệmdượcphẩm. Nhàxuất
bảnY học, chương 3, Kiểmnghiệmthuốcbằngphương
pháphoálý, trang 68-110
Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp hóa học, hóa lý
Hóaphântích& kiểmnghiệmdượcphẩmII
Trần Thị Vân Anh –ThS.DS
2

3. Mụctiêuhọctập
1. Môtả, phân tíchđượccôngtác kiểm nghiệm bằngcác
phươngpháphoá học và hoá lýtrongkiểmnghiệmdược
phẩm.
3
Trần Thị Vân Anh –ThS.DS
Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp hóa học, hóa lý
Hóaphântích& kiểmnghiệmdượcphẩmII

4. KIỂM NGHIỆM THUỐC
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC
Nội dung:
1.Các phản ứng định tính
2.Thử giới hạn các tạp chất trong thuốc
3.Chuẩn độ acid-base trong môi trường khan
4.Xác định hàm lượng nước bằng thuốc thử Karl Fisher
5.Định lượng một số chất hữu cơ đa chức bằng thuốc thử
periodat
6.Ứng dụng cặp ion trong kiểm nghiệm thuốc
4

5. 1.CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH
1.Phụ lục 8.1 DĐVNV
2.Chương 2 -Kiểm nghiệm thuốc bằng các phương pháp
hóa học.
5

6. 2. THỬ GIỚI HẠN CÁC TẠP CHẤT TRONG THUỐC
2.1. Mục đích: thử độ tinh khiết của thuốc.
Ảnh hưởng của tạp chất trong thuốc:
•Gây hại cho sức khỏe (As, Pb,...)
•Gây tương kỵ hóa học
•Xúc tác đẩy nhanh quá trình phân hủy (vết kim loại, độ ẩm).
•Một số tạp chất không thuộc các loại trên nhưng nó biểu thị
cho mức độ sạch của thuốc.
6

7. 2. THỬ GIỚI HẠN CÁC TẠP CHẤT TRONG THUỐC
2.2. Nguồn gốc của tạp chất trong thuốc
•Nguyên liệu, phụ liệu hoặc bán thành phẩm chưa đủ độ
tinh khiết.
•Quy trình sản xuất không được thực hiện nghiêm chỉnh
•Ảnh hưởng của dụng cụ
•Phương pháp sản xuất
•Quá trình bảo quản: môi trường, vệ sinh, chất bảo
quản,... làm phát sinh các tạp chất.
•Do dụng ý gian lận của người sản xuất.
7

8. 2. THỬ GIỚI HẠN CÁC TẠP CHẤT TRONG THUỐC
2.3. Phương pháp xác định giới hạn tạp chất trong thuốc
Mục đích: xác định xem các tạp chất có vượt quá giới hạn cho phép
hay không. Các phản ứng thử tạp chất có tính chất bán định lượng và
được thực hiện bằng pp so sánh.
Phương pháp: so sánh
Tiến hành: lấy 2 ống nghiệm
•Ống 1: dung dịch thử
•Ống 2: dung dịch mẫu (pl 2.4 DĐVNV). Dd mẫu là dd có chứa lượng
tạp chất cần thử với số lượng cho phép.
•Tiến hành song song phản ứng thử tạp chất với cùng 1 thuốc thử. So
sánh kết quả phản ứng ở 2 ống (so màu hoặc so độ đục) từ đó xác
định được giới hạn tạp chất cần thử có trong mẫu thuốc.
8

9. 2. THỬ GIỚI HẠN CÁC TẠP CHẤT TRONG THUỐC
Quy định chung khi tiến hành
•Nước, thuốc thử không được có tạp chất đang cần thử.
•Dung dịch mẫu khi pha phải pha chính xác.
•2 ống nghiệm dùng để so sánh phải giống nhau: bằng thủy tinh
không màu, cùng đường kính, cùng độ dày,...
•So màu: nhìn ngang trên nền trắng.
•So độ đục: nhìn dọc trục trên nền đen.
•Phải cho các thuốc thử vào 2 ống nghiệm giống nhau về: thời gian,
số lượng, thể tích cuối.
•Khi phân tích, nếu phát hiện được 1 tạp chất lạ thì phải ghi lại và
báo cáo.
9

10. 2. THỬ GIỚI HẠN CÁC TẠP CHẤT TRONG THUỐC
Pha dung dịch mẫu: pl 2.4 DĐVNV
Pha dung dịch thử: theo chuyên luận riêng
•Nguyên tắc: giả thiết mẫu đem kiểm có chứa tối đa lượng hoạt chất cho
phép, tính toán hệ số pha loãng phù hợp.
Vd: pha dd kiểm tạp Cl
-
trong paracetamol, tiêu chuẩn Cl
-
≤ 0,01 %
•Nồng độ dd mẫu Cl
-
khi đem thử là 0,0005 % = 0,0005 g/100ml (= 5 ppm)
•Tiêu chuẩn Cl
-
≤ 0,01 %=> 100 g paracetamol chứa 0,01 gCl
-
•Hệ số pha loãng của dd thử là 0,01/0,0005 = 20 lần
•Cách pha: cân 1,000 g paracetamol hòa tan với nước thành vđ 20 ml, lọc.
Lấy chính xác 10,00 ml dịch lọc đem thử và so sánh với 10,00 ml dd mẫu
chuẩn Cl
-
5 ppm.
10

11. 2. THỬ GIỚI HẠN CÁC TẠP CHẤT TRONG THUỐC
11

12. 2. THỬ GIỚI HẠN CÁC TẠP CHẤT TRONG THUỐC
12

13. Định lượng nước (phụ lục 10.3 DĐVN V) –Chuẩn độ Karl-Fischer
•ThànhphầnthuốcthửKarl Fischer 4 thànhphần: SO
2, I
2, pyridin(hoặc
imidazol, 2-methylaminopyridin), methanol phathành1 dung dịchhoặc
2 dung dịch.
•Trường hợp pha thành hai dung dịch:
–Dung dịch A: SO
2và pyridinpha trong methanol khan
–Dung dịch B:iod pha trong methanol khan
13
3. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NƯỚC
BẰNG THUỐC THỬ KARL -FISHER
Thiết bị chuẩn độ FischerOMNIS-Metrohm

14. Định lượng nước (phụ lục 10.3 DĐVN V) –Chuẩn độ Karl-Fischer
•Nguyên tắc: đây là phương pháp đo iod trong môi trường khan dùng để
định lượng nước có trong các chất.
•Để phản ứng xảy ra theo chiều thuận, thêm pyridin/methanol (thuốc thử
Karl –Fisher) để trung hòa các acid tạo thành.
14
3. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NƯỚC
BẰNG THUỐC THỬ KARL -FISHER

15. Nguyên tắc: dựa vào tính oxy hóa của cặp I
+7
/ I
+5
, thế chuẩn +1,6V,
periodat là chất oxy hóa mạnh.
•Có thể dùng thuốc thử periodat để định lượng nhiều chất hữu cơ như:
các α diol: etylenglycol, propradiol1,2, polyol
15
4. ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ CHẤT HỮU CƠ ĐA
CHỨC BẰNG THUỐC THỬ PERIODAT

16. •Cặp ion được hình thành do tương tác tĩnh điện giữa 2 ion mang điện trái
dấu: 1 ion dương và 1 ion âm.
•Thuyết liên hợp Bjerrum: 2 ion solvat hóa có điện tích trái dấu khi chuyển
động nhiệt trong dd sẽ tiến lại gần nhau do lực hút Couloms.
•Đến 1 khoảng cách gọi là ‘khoảng cách đặc trưng q” chúng tạo thành 1
tiểu phân động học chuyển động tự do như các ion (cặp ion).
•Với các chất điện ly đối xứng (1-1, 2-2,...) cặp ion tạo thành không mang
điện.
•Với các chất điện ly đối xứng (1-2, 1-3, 2-3...) cặp ion tạo thành có điện
tích nhỏ hơn điện tích của các ion ban đầu.
=> độ dẫn điện của dung dịch giảm xuống.
16
5. ỨNG DỤNG CẶP ION
TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC

17. •Khoảng cách q phụ thuộc vào điện tích z và hằng số ɛ: nếu điện tích z càng lớn
và ɛ càng nhỏ thì q càng tăng, cặp ion tạo ra càng nhiều.
•Vd: 2 ion K
+
và Cl
-
ở khoảng cách q < 3,6 A
0
sẽ tạo thành cặp ion. Chúng
chuyển động tự do trong dung dịch như các ion K
+
và Cl
-
và phân tử không điện
ly. Cặp ion trung hòa điện tích do va chạm làm giảm bớt lớp vỏ hydrat hóa trong
dung dịch nước nên dễ chuyển sang hòa tan trong dung môi hữu cơ.
17
5. ỨNG DỤNG CẶP ION
TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC

18. 18
5. ỨNG DỤNG CẶP ION
TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC
Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành cặp ion
•Ion càng lớn và càng sơ nước, càng ít bị hydrat hóa trong
nước thì càng dễ bị solvat hóa trong dung môi hữu cơ.
•pH của dung dịch nước: để tạo cặp ion từ các chất mang
tính acid, base thì pH dung dịch phải đảm bảo tồn tại cả
cation (từ base) và anion (từ acid).
Vd:
Để tạo cặp ion RNH
3
+-
OOCR cần có pH thích hợp.

19. 19
5. ỨNG DỤNG CẶP ION
TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC
Ứng dụng
•Phân tích thể tích
•Chiết đo quang
•HPLC

20. 20
KIỂM NGHIỆM THUỐC
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ
Nội dung:
1.Phương pháp quang phổ phân tử
2.Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

21. I. QUANG PHỔ PHÂN TỬ
•Phổ UV-VIS
•Phổ hồng ngoại
•Phổ huỳnh quang
21

22. 1. PHƯƠNG PHÁP UV-VIS
22
Hình: Cấu tạo máy Quang phổ UV-VIS
1.Nguồn sáng:
-Đèn D2
-Đèn Wolfram
2. Bộ phận đơn sắc hóa
-Lăng kính
-Cách tử
3. Cuvet:
-Thủy tinh
-Thạch anh
-Cuvet có nắp/không có nắp
4. Chế độ đo
-Quét phổ (time scan)
-Đo điểm (photometric)

23. 1. PHƯƠNG PHÁP UV-VIS
23Hình: Cấu tạo máy Quang phổ UV-VIS 2 chùm tia

24. 1. PHƯƠNG PHÁP UV-VIS
Máy quang phổ UV-VIS
•Nguồn sáng cho vùng tử ngoại: đèn deuteri hoặc hydro.
•Nguồn sáng cho vùng khả kiến: đèn tungsten.
•Hai cốc đo chứa dd thử và dd so sánh phải có đặc tính quang
học giống nhau.
•Ở máy 2 chùm tia, cuvet chứa dung môi được đặt ở bên
chùm tia so sánh đi qua.
•Cuvet thạch anh: dùng đo được ở vùng tử ngoại và khả kiến.
•Cuvet thủy tinh: chỉ đo ở vùng khả kiến.
24

25. 1. PHƯƠNG PHÁP UV-VIS
Định luật Lambert -Beer và hệ số hấp thụ
25

26. 1. PHƯƠNG PHÁP UV-VIS
Định luật Lambert -Beer và hệ số hấp thụ
•Trường hợp C tính bằng mol/lít, L tính bằng cm
ɛ là hệ số hấp thụ phân tử
•Trường hợp C tính bằng % (kl/tt), L tính bằng cm
E (1%, 1cm) là hệ số hấp thụ riêng
26

27. 1. PHƯƠNG PHÁP UV-VIS
Điều kiện áp dụng định luật Lambert –Beer
•Ánh sáng phải đơn sắc.
•Khoảng nồng độ phải thích hợp: định luật Lambert –
Beer chỉ đúng trong một giới hạn nhất định của nồng độ.
•Dung dịch phải trong suốt.
•Chất thử phải bền trong dung dịch và bền dưới tác dụng
của ánh sáng UV-VIS.
27

28. HIỆU CHUẨN MÁY QUANG PHỔ
•Kiểm tra thang độ dài sóng
•Kiểm tra độ hấp thụ
•Giới hạn ánh sáng lạc
•Độ rộng dải phổ nguồn
•Cuvet
28
1. Phương pháp UV-VIS

29. HIỆU CHUẨN MÁY QUANG PHỔ
Kiểm tra thang độ dài sóng
•Sử dụng cực đại hấp thụ của dung dịch holmium
perchlorate.
•Các cực đại hấp thụ của dung dịch holmium perchlorate
–Khi dùng đèn hydro: 379,79 nm; 456,13 nm; 656,28 nm.
–Khi dùng đèn deuteri: 486,02 nm; 656,10 nm.
•Dùng kính holmium có các cực đại hấp thụ: 279,4 nm;
287,5 nm; 333,7 nm; 360,9 nm; 460,0 nm; 484,5 nm;
536,1 nm; 637,5 nm.
29
1. Phương pháp UV-VIS

30. Kiểm tra độ hấp thụ
•Đa số các dược điển dùng dung dịch kali dicromat trong
acid sulfuric.
•Đo độ hấp thụ của dung dịchkali dicromat ở các bước
sóng chỉ định.
30
HIỆU CHUẨN MÁY QUANG PHỔ
1. Phương pháp UV-VIS

31. Kiểm tra độ hấp thụ
•Pha chế dd kali dicromat: DĐVN quy định hòa tan 57,0 đến 63,0 mg
kali dicromat đã sấy khô đến khối lượng không đổi ở 130
o
C trong
H
2SO
40,005 M/L với thể tích vừa đủ 1000 ml.
•DĐVN, EP cho bảng độ hấp thụ của dd kali dicromat chứa đúng 60,66
mg K
2Cr
2O
7chứa trong vừa đủ 1000 ml acid sulfuric 0,005 mol/l, dùng
cuvet dày 1 cm.
31
HIỆU CHUẨN MÁY QUANG PHỔ
1. Phương pháp UV-VIS

32. Giới hạn ánh sáng lạc
•Ánh sáng lạc là ánh sáng không đi vào mẫu thử mà đi
thẳng đến detector.
•Ánh sáng lạc có thể được phát hiện ở độ dài sóng đã
cho với kính lọc hoặc các dung dịch thích hợp.
•DĐVN quy định kiểm tra ánh sáng lạc như sau: Đo độ
hấp thụ của dung dịch KCl (TT) 1,2 % trong cuvet 1 cm
ở bước sóng 200 nm, so sánh với nước cất, phải lớn
hơn 2,0.
32
HIỆU CHUẨN MÁY QUANG PHỔ
1. Phương pháp UV-VIS

33. Độ phân giải (cho phân tích định tính)
•Ghi phổ của dd toluen (TT) 0,02 % trong hexan (TT) (tt/tt).
•Giá trị tối thiểu của tỷ số giữa cực đại hấp thụ ở 269 nm
và cực tiểu hấp thụ ở 266 nm được quy định trong chuyên
luận riêng.
33
HIỆU CHUẨN MÁY QUANG PHỔ
1. Phương pháp UV-VIS

34. Cuvet
•Dung sai của chiều dày lớp dung dịch của các cuvet là ±
0,005 cm.
•Khi được nạp đầy với cùng một dung môi, các cuvet dự
định đựng dd thử và dd so sánh phải có độ truyền qua
như nhau.
•Các cuvet phải được làm sạch và bảo quản cẩn thận,
tránh bị xước, có thể bảo quản trong cồn tuyệt đối để
tránh bị mốc.
35
HIỆU CHUẨN MÁY QUANG PHỔ
1. Phương pháp UV-VIS

35. ỨNG DỤNG PHỔ UV -VIS TRONG KIỂM
NGHIỆM THUỐC
Định tính và thử tinh khiết
•Dựa vào cực đại hấp thụ
•Vd:
36
1. Phương pháp UV-VIS

36. ỨNG DỤNG PHỔ UV -VIS TRONG KIỂM
NGHIỆM THUỐC
Định tính và thử tinh khiết
•Dựa vào tỷ số giữa các cực đại hấp thụ
37
1. Phương pháp UV-VIS

37. ỨNG DỤNG PHỔ UV -VIS TRONG KIỂM
NGHIỆM THUỐC
Định tính và thử tinh khiết
•Dựa vào hệ số match: hệ số này đánh giá sự tương đồng
giữa hai phổ, 1 phổ chuẩn và 1 phổ thử.
38
1. Phương pháp UV-VIS

38. ỨNG DỤNG PHỔ UV -VIS TRONG KIỂM
NGHIỆM THUỐC
Định lượng
Chọn điều kiện xây dựng quy trình định lượng
•Chọn bước sóng: ứng với các cực đại hấp thụ
•Chọn khoảng nồng độ thích hợp: khoảng nồng độ có quan
hệ tuyến tính với độ hấp thụ.
•Chọn các điều kiện khác:
+ Loại tạp chất ra khỏi mẫu, dùng mẫu trắng
+ Chọn pH và dung môi thích hợp
+ Thực hiện phản ứng màu: sự hấp thụ của các chất lạ,
thuốc thử có thể ảnh hưởng đến kết quả định lượng => cần
chú ý tới điều kiện và các thành phần tham gia p.ư.
39
1. Phương pháp UV-VIS

39. ỨNG DỤNG PHỔ UV -VIS
TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC
Định lượng
Phương pháp đo phổ trực tiếp: đo độ hấp thụ A của
dung dịch, tính nồng độ C của nó dựa vào độ hấp thụ
riêng.
•Để áp dụng pp này, cần phải chuẩn hóa máy quang phổ
cả về bước sóng và độ hấp thụ.
40
1. Phương pháp UV-VIS

40. ỨNG DỤNG PHỔ UV -VIS
TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC
Định lượng
Phương pháp gián tiếp: phương pháp đường chuẩn,
so sánh, thêm chuẩn.
•Phải có chất chuẩn để so sánh
•Có thể không cần chuẩn hóa máy
41
1. Phương pháp UV-VIS

41. ỨNG DỤNG PHỔ UV -VIS
TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC
Định lượng
Phương pháp gián tiếp -Phương pháp so sánh
•Đo độ hấp thụ của dd chuẩn so sánh (S) và dung dịch
mẫu thử (X).
•C
Xvà C
Scàng gần nhau, kết quả càng chính xác.
42
1. Phương pháp UV-VIS

42. ỨNG DỤNG PHỔ UV -VIS
TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC
Định lượng
Phương pháp gián tiếp -Phương pháp thêm chuẩn so
sánh
•Để loại trừ các yếu tố ảnh hưởng gây sai số cho quá trình
định lượng: xử lý mẫu, sai lệch do hóa chất, thuốc thử, thiết
bị,...
•Tiến hành:
+ Lấy 2 lượng giống nhau của 1 mẫu thử.
+ Thêm 1 lượng chất chuẩn đã biết vào 1 mẫu, tiến hành xử lý
2 mẫu trong cùng điều kiện (chiết xuất, pha loãng,...) thu được
2 dd: dd thử và dd thử đã thêm chuẩn
+ Đo độ hấp thụ của 2 dd, thu được
A
x: độ hấp thụ của dd thử;
A
’
X:độ hấp thụ của dd thử thêm chuẩn
43
1. Phương pháp UV-VIS

43. ỨNG DỤNG PHỔ UV -VIS
TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC
Định lượng
Phương pháp gián tiếp -Phương pháp thêm chuẩn so
sánh
A
x: độ hấp thụ của dd thử;
A
’
X:độ hấp thụ của dd thử thêm chuẩn
C
Slà nồng độ dd chuẩn
Tính nồng độ C
Xnhư sau:
44
1. Phương pháp UV-VIS

44. ỨNG DỤNG PHỔ UV -VIS
TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC
Định lượng
Phương pháp gián tiếp -Phương pháp đường chuẩn
•Chuẩn bị 1 dãy chuẩn có khoảng 5 dung dịch có các C
Skhác
nhau.
•Đo độ hấp thụ A
Scủa dãy chuẩn và lập đồ thị A = f(C).
•Đo độ hấp thụ A
Xcủa mẫu thử, dựa vào đường chuẩn xác
định được nồng độ mẫu thử C
X .
Chú ý: khi xây dựng đường chuẩn nên khảo sát khoảng tuyến
tính của nồng độ với độ hấp thụ. Trường hợp đường chuẩn
không tuyến tính => làm thêm một số điểm chuẩn nữa với các
nồng độ gần nhau hơn (khác nhau không quá 10%).
R
2
≥ 0,995.
45
1. Phương pháp UV-VIS

45. ỨNG DỤNG PHỔ UV -VIS
TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC
Định lượng
Phương pháp gián tiếp -Phương pháp đường chuẩn
46
1. Phương pháp UV-VIS

46. ỨNG DỤNG PHỔ UV -VIS
TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC
Định lượng
Phương pháp gián tiếp -Phương pháp thêm đường chuẩn
•Thêm những thể tích giống nhau của dd thử vào dãy chuẩn chứa những
lượng khác nhau và chính xác của chất chuẩn.
•Đo độ hấp thụ của cả dãy rồi vẽ đường chuẩn A = f(C).
•Giao điểm của đường chuẩn với trục hoành (nồng độ) cho biết nồng độ
của chất cần định lượng.
47
1. Phương pháp UV-VIS

47. ỨNG DỤNG PHỔ UV -VIS
TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC
Định lượng
Phương pháp gián tiếp –Kỹ thuật đo quang vi sai theo bước sóng
•Kiểm nghiệm thành phẩm, cần chiết hoạt chất ra khỏi tá dược. Dịch chiết
có thể mang theo tạp chất gây sai số cho quá trình định lượng => để loại
trừ sai số này dùng pp đo quang vi sai.
•Trên phổ của chất thử, chọn 2 bước sóng λ1 và λ2, ở đó hiệu số độ hấp
thụ ∆A là lớn nhất.
•Chuẩn bị 1 dãy các dd chuẩn với các nồng độ khác nhau và đo độ hấp
thụ ở 2 bước sóng λ1 và λ2.
•Vẽ đồ thị ∆A = f(C), suy ra nồng độ chất thử trong mẫu.
48
1. Phương pháp UV-VIS

48. ỨNG DỤNG PHỔ UV -VIS
TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC
Định lượng
Phương pháp gián tiếp –Phương pháp định lượng hỗn hợp
•Dựa trên tính cộng tính của độ hấp thụ (nếu 1 dd có n chất thì độ hấp thụ
của hỗn hợp bằng tổng độ hấp thụ của n chất riêng rẽ).
•Cần xác định λ
maxcủa từng chất và hệ số hấp thụ riêng của từng chất tại
mỗi bước sóng được đo. Đo độ hấp thụ của hỗn hợp tại từng bước sóng.
Giải hệ phương trình để tìm ra nồng độ các thành phần.
49
1. Phương pháp UV-VIS

49. 2. QUANG PHỔ HỒNG NGOẠI
Ứng dụng: định tính, dựa trên nguyên tắc:
•So sánh sự phù hợp giữa phổ chất thử với phổ của chất
chuẩn được ghi trong cùng điều kiện.
•So sánh sự phù hợp giữa phổ chất thử với phổ chất chuẩn
có sẵn trong sách tra cứu hoặc thư viên phổ lưu giữ trong
máy tính.
50

50. 2. QUANG PHỔ HỒNG NGOẠI
Ứng dụng: định tính, dựa trên nguyên tắc
•So sánh sự phù hợp giữa phổ chất thử với phổ của chất
chuẩn được ghi trong cùng điều kiện.
Chuẩn bị mẫu thử và mẫu chuẩn rồi đo phổ của chúng từ
4000 cm
-1
đến 670 cm
-1
trong cùng điều kiện. Các cực đại hấp
thụ ở phổ của chất thử phải tương ứng với phổ của chất
chuẩn về vị trí và trị số.
51

51. 2. QUANG PHỔ HỒNG NGOẠI
Ứng dụng: định tính, dựa trên nguyên tắc
•So sánh sự phù hợp giữa phổ chất thử với phổ chất chuẩn
có sẵn trong sách tra cứu hoặc thư viện phổ lưu giữ trong
máy tính.
•Cần chuẩn hóa máy quang phổ về độ phân giải và thang số
sóng.
•Chuẩn hóa độ phân giải: ghi phổ của phim polystyren dày
0,05 mm.
52

52. 3. QUANG PHỔ HUỲNH QUANG
•Là quang phổ phát xạ phân tử, sau khi phân tử hấp thụ
năng lượng của bức xạ tử ngoại, khả kiến (bức xạ kích
thích), phân tử bị kích thích sẽ trở lại trạng thái cơ bản và
giải phóng năng lượng dưới dạng bức xạ (bức xạ huỳnh
quang).
•Cường độ huỳnh quang F của dd loãng (C < 10
-4
) tỷ lệ
thuận với nồng độ mol/l trong điều kiện xác định khi cường
độ và bước sóng của bức xạ kích thích là hằng số.
53

53. 3. QUANG PHỔ HUỲNH QUANG
54
Máy quang phổ huỳnh quang
•Nguồn sáng: thường dùng đèn xenon (λ= 200 –800 nm),
đèn laser.
•Đèn xenon cho phổ bức xạ không đều nên kém nhạy hơn
nguồn laser.
-Bộ đơn sắc: dùng cách tử
-Cuvet: thường dùng thạch anh có 4 mặt trong suốt

54. 3. QUANG PHỔ HUỲNH QUANG
55
Phương pháp đo
•Mẫu thử luôn được so sánh với mẫu chuẩn.
•Kiểm tra vùng tuyến tính của cường độ huỳnh quang, độ
nhạy của thiết bị với độ pha loãng của dd thử.
•Ghi cường độ huỳnh quang của dd thử, dd chuẩn, mẫu
trắng. Tính nồng độ dd thử.

55. 3. QUANG PHỔ HUỲNH QUANG
56
Phương pháp đo
•Ghi cường độ huỳnh quang của dd thử, dd chuẩn, mẫu
trắng. Tính nồng độ dd thử.
•Vùng trong đó cường độ huỳnh quang tỷ lệ thuận với nồng
độ của chất thường rất hẹp =>
0,50 < < 2,0
•Nếu tỷ số không nằm trong khoảng này thì phải điều chỉnh
nồng độ và đo lại.

56. QUANG PHỔ HUỲNH QUANG
57
Phương pháp đo
•Độ tinh khiết của dung môi có thể ảnh hưởng đáng kể đến
cường độ huỳnh quang. Nếu cần, nên cất lại trong máy
cất bằng thủy tinh trước khi dùng.
•Sự có mặt của các tiểu phân keo có thể gây nên sự tán xạ
ánh sáng => cần loại bỏ bằng ly tâm hoặc lọc bằng màng
lọc thủy tinh xốp.
•Oxy hòa tan trong dung dịch làm giảm cường độ huỳnh
quang rất mạnh => đuổi oxy bằng cách sục khí trơ qua
dung dịch.

57. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
58
Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký
Hệ số phân bố K (partition coeffcient)
•Xác định tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh
C
s : nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh
C
M : nồng độ mol của chất tan trong pha động
K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm.
Nếu các chất trong hỗn hợp có K khác nhau càng nhiều, càng dễ tách.
•Khi nồng độ chất tan không quá cao, K là 1 hằng số chỉ phụ thuộc vào
bản chất các pha, chất tan và nhiệt độ.
K=
CS
CM

58. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
59
Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký
Hệ số dung lượng k’
Mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích A qua cột

59. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký
Hệ số dung lượng k’
•Mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích A qua cột.
•k’
A phụ thuộc vào bản chất của chất A, bản chất 2 pha, tỷ
lệ
VS
VM
•Nếu k’
A << 1, quá trình rửa giải diễn ra quá nhanh => khó
xác định chính xác thời gian t
R.
•Nếu k’
Aquá lớn (20 -30) => quá trình rửa giải quá dài.
•Cần chọn cột, pha động,... sao cho 1 ≤ k’ ≤ 8 .
60
II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

60. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
61
Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký
Hệ số chọn lọc 
Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B.
Quy ước B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên > 1
Để tách riêng 2 chất, cần α> 1, thường chọn 1,05 < α< 2,0
Nếu αcàng lớn, thời gian phân tích càng kéo dài.

61. Tính đối xứng của pic sắc ký
•Trên sắc ký đồ, pic đối xứng có dạng tương tự đường
cong phân bố chuẩn Gaussian là dạng lý tưởng.
•Thực tế, pic thường bị giãn ra và chỉ gần đối xứng.
Hệ số đối xứng
BC: nửa chiều rộng phía sau của pic đo ở 1/10 chiều cao
của pic
AC: nửa chiều rộng phía trước của pic đo ở 1/10 chiều
cao của pic.
Hệ số kéo đuôi
•A
scàng > 1, pic càng kéo đuôi nhiều, càng mất cân đối
62
Source: F.W.Fifield(2000), Principles and
practice of analytical chemistry, chapter 4,
page 88
II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

62. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
63
Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký
Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N
•Hiệu lực cột được đo bằng thông số: số đĩa lý thuyết

63. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
64
Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký
Độ phân giải R
s
•Yêu cầu R
s> 1, giá trị tối ưu R
s= 1,5.

64. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
65
Máy HPLC

65. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
66
Các kỹ thuật HPLC
•Thường dùng sắc ký phân bố hiệu năng cao.
•Pha tĩnh: các nhóm chức hữu cơ liên kết với bề mặt của các tiểu
phân silica qua các nhóm silanol.
•Tính phân cực của pha tĩnh phụ thuộc vào tính phân cực của các
nhóm chức liên kết.
•Sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực.
•Sắc ký pha đảo: pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực.

66. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
67
Sắc ký pha thuận:
•Pha tĩnh: chất mang gắn với nhóm phân cực như alkylnitril [-
(CH
2)
nCN)] và alkylamin [-(CH
2)
nNH
2)].
•Pha động: không phân cực, thường dùng hỗn hợp hydrocarbon
mạch thẳng: pentan, hexan, heptan, isooctan. Các halogen dãy
béo: diclorometan, dicloroetan, butylclorid, cloroform.
Thêm 1-2 % acid acetic hoặc acid phosphoric để ngăn cản
sự ion hóa các phenol, acid carboxylic.
Thêm amoniac hoặc amin khác 0,1 –1% để ngăn cản sự
ion hóa của base yếu.
•Chất không phân cực được rửa giải ra sớm.
•Thứ tự rửa giải chậm dần theo chiều tăng độ phân cực của các
thành phần trong mẫu thử.

67. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
68
Sắc ký pha thuận:
•Vd: tách hỗn hợp steroid

68. 69
1.
2.
3.
6. 5.
7.
8.
4.

69. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
70
Sắc ký pha đảo:
•Pha tĩnh: chất mang gắn với nhóm không phân cực như
octadecyl (C18), octyl (C8), phenyl (C
6H
5).
•Pha động: phân cực như nước, methanol (MeOH), ethanol,
acetonitril (ACN), tetrahydrofuran (THF), dimethylformamid.
•Cặp dung môi pha động thường dùng: nước: methanol; nước:
acetonitril. Methanol nhớt hơn acetonitril nên thời gian lưu khi
dùng methanol sẽ dài hơn so với ACN cùng nồng độ. Methanol
cũng làm giảm hiệu lực cột.
•Chất phân cực được rửa giải ra sớm.
•Thứ tự rửa giải chậm dần theo chiều tăng độ KHÔNG phân cực
của các thành phần trong mẫu thử.

70. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
71
Sắc ký pha đảo:
Vd: tách hỗn hợp morphin, codein và heroin.
3. heroin
2.
1. morphin

71. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
72
Sắc ký cặp ion (Ion-Pair Chromatography IPC):
Dựa trên cơ sở sự tạo thành cặp ion từ ion cần phân tích mang
điện và tác nhân tạo cặp ion mang điện trái dấu (đối ion).
•Thực chất IPC là HPLC pha đảo
•Dung môi: là dung môi trong pha đảo H
2O-MeOHvàH
2O-ACN.
Cần đảm bảo thuốc thử tạo cặp ion đã tan hết trong pha động
để tránh kết tủa trong hệ thống.
•Đối ion: thường là các amin bậc 4 hoặc các muối amoni sulfonat:
Muối sodium 1-pentane sulfonate hoặc sodium octane sulfonate
là hai muối alkyl sulfonate thường được sử dụng làm chất ghép
cặp ion đối với những hợp chất có tính base; Tetrabutyl
ammonium hydroxide được dùng làm ion ghép cặp với những
hợp chất mang tính acid.
•Cột: C2, C8, C18,...
•VD: tách hỗn hợp vitamin tan trong nước bằng HPLC cặp ion
pha đảo

72. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
73
Sắc ký cặp ion (Ion-Pair Chromatography IPC):
•VD: tách hỗn hợp vitamin tan trong nước bằng HPLC cặp ion pha đảo
1.
2.
3.
4.

73. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
74
Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao (liquid-solid chromatography LSC)
•Pha tĩnh: silicagel, nhôm oxyd,.. silicagel được dùng nhiều nhất.
•Pha động: dung môi ít phân cực, không phân cực.
•Rửa giải: chất không phân cực ra trước, càng phân cực càng ra chậm
Vd: tách hỗn hợp steroid acetat bằng HPLC hấp phụ.

74. 75
1. 2.
3.
4.
5.

75. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
76
Sắc ký trao đổi ion
•Dùng để tách các thành phần ion hóa tan trong nước, phân
tử lượng < 1500.
•Pha tĩnh là các nhựa trao đổi ion có dạng bột mịn. Là chất
hữu cơ cao phân tử có chứa nhóm có khả năng trao đổi.
•Nhựa có nhóm hoạt động mang điện tích âm: dùng để tách
các chất base như các amin.
•Nhựa có nhóm hoạt động mang điện tích dương: dùng để
tách các chất có nhóm mang điện âm như nhóm phosphat,
sulfonat, carboxylat.

76. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
77
Sắc ký loại cỡ (size exclusion chromatography SEC)
•Ứng dụng để tách các chất có phân tử lượng lớn > 2000.
•Pha tĩnh là những hạt xốp của silicagel hay polyme.
•Các phân tử của các chất được tách theo khối lượng phân tử
•Các phân tử có MW quá lớn, chạy nhanh qua cột, không bị
lưu giữ.
•Các phân tử có MW nhỏ hơn bị lưu giữ trên cột. => rửa giải
phân tử càng nhỏ càng ra chậm.

77. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
78
Hướng dẫn chọn kỹ thuật HPLC
Dựa vào các đặc tính lý, hóa học của các chất thành phần:
•Tính tan: tan / không tan trong nước
•Phân tử lượng
•Tính phân cực: ion hóa / không ion hóa.
Nếu phân tử lượng > 2000: nên sử dụng sắc ký rây phân tử
Nếu phân tử lượng < 2000: đầu tiên xác định xem mẫu có tan trong
nước không
•Nễu mẫu tan hoặc ít tan trong nước: có thể dùng SK trao đổi ion, SK
phân bố pha đảo.
•Nếu độ tan tăng lên khi thêm acid hoặc kiềm: dùng SK trao đổi ion
•Nếu độ tan không bị ảnh hưởng bởi acid hoặc kiềm và dd nước của
chất tan trung tính: SK phân bố pha đảo.
•Nếu mẫu không tan trong nước: SK phân bố pha thuận hoặc LSC.
•Tách các đồng phân: LSC
•Tách các đồng đẳng: SK phân bố

78. 79
(size exclusion chromatography SEC)

79. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
80
Chuẩn hóa cột HPLC
•Mục đích: kiểm tra hiệu năng của cột HPLC, và xác định xem khi
nào chúng cần phải thay thế.
•Tất cả các cột pha đảo C8, C18 và các cột silica mới và cũ đều cần
được chuẩn hóa.
•Các thông số cần chuẩn hóa:
–Hệ số dung lượng k’
–Hiệu lực cột (số đĩa lý thuyết) N
–Hệ số đối xứng F
•Đối với cột mới: cần chuẩn hóa ngay khi mới nhận để khẳng định chất
lượng.
•Đối với cột đang sử dụng: nếu đang trong quá trình sử dụng, nhận thấy
hình dạng pic xấu hơn trước và hiệu lực cột không thỏa mãn cho việc
phân tích => chuẩn hóa lại cột và ghi ngày tháng thực hiện vào bảng
theo dõi.

80. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
81
Chuẩn hóa cột HPLC
Cột HPLC pha đảo

81. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
82
Chuẩn hóa cột HPLC
Cột HPLC pha thuận

82. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
83
Định lượng bằng phương pháp HPLC
Phương pháp chuẩn ngoại
•Mẫu thử và mẫu chuẩn được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện.
•So sánh diện tích pic của mẫu thử với diện tích pic của mẫu chuẩn để
tính được nồng độ mẫu thử.
•Có thể sử dụng pp chuẩn hóa 1 điểm hoặc nhiều điểm
•Chuẩn hóa 1 điểm: pha mẫu chuẩn có nồng độ xấp xỉ với nồng độ
mẫu thử. Tính nồng độ mẫu thử

83. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
84
Định lượng bằng phương pháp HPLC
Phương pháp chuẩn nội
•Thêm vào cả mẫu thử và mẫu chuẩn lượng bằng nhau của
1 chất tinh khiết, tiến hành SK trong cùng điều kiện. Chất
được thêm gọi là chất chuẩn nội.
•Yêu cầu của chuẩn nội:
–Trong cùng điều kiện SK, chuẩn nội phải được tách hoàn toàn và có thời
gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử
–Có cấu trúc hóa học tương tự chất thử
–Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử
–Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử
–Có độ tinh khiết cao và dễ kiếm.
•Vì đáp ứng của chất chuẩn và chuẩn nội với detector
không cùng độ nhạy => cần xác định hệ số đáp ứng F
Xđể
tính kết quả.

84. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
85
Định lượng bằng phương pháp HPLC
Phương pháp chuẩn nội
•Xác định hệ số đáp ứng F
X
•Chuẩn bị 1 hỗn hợp có chứa những lượng (hoặc nồng độ)
đã biết của chất chuẩn và chuẩn nội, chạy SK thu được
diện tích pic.

85. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
86
Định lượng bằng phương pháp HPLC
Phương pháp chuẩn nội
•Chuẩn nội 1 điểm: chuẩn nội được thêm vào cả 2 mẫu chuẩn và thử rồi
tiến hành SK.
•Chuẩn nội nhiều điểm: chuẩn bị 1 dãy chuẩn có chứa những lượng
(hoặc nồng độ) chất chuẩn khác nhau nhưng tất cả cùng chứa 1 lượng
(hoặc nồng độ) chuẩn nội. Chạy SK
-Vẽ đồ thị đường chuẩnS
S/ S
IS= f (C
S/ C
IS)
-Mẫu thử cũng được thêm cùng nồng độ
chuẩn nội. Tiến hành SK, tìm được nồng độ
mẫu thử.

86. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
87
Định lượng bằng phương pháp HPLC
Phương pháp thêm chuẩn
•Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của các chất
chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử.
Tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký trong cùng điều kiện.
Nồng độ mẫu thử C
Xđược tính:

87. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
88
Định lượng bằng phương pháp HPLC
Phương pháp thêm đường chuẩn
•Chuẩn bị 1 dãy hỗn hợp gồm các lượng mẫu thử giống nhau và các
chất chuẩn (tương ứng với các thành phần cần xác định) với lượng
tăng dần. Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký.
•Vẽ đường chuẩn S = f(C)
•Giao điểm của đường chuẩn kéo dài tới trục hoành chính là nồng độ
của chất cần xác định.

88. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
89
Định lượng bằng phương pháp HPLC
Phương pháp chuẩn hóa diện tích
•Hàm lượng phần trăm của 1 chất trong hỗn hợp nhiều thành phần
được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện
tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ.
•Phương pháp này yêu cầu tất cả các thành phần đều được rửa giải và
được phát hiện. Tất cả các thành phần đều có đáp ứng detector như
nhau.
•Kỹ thuật này được sử dụng nhiều trong GC vì thường có đáp ứng như
nhau ở detector ion hóa ngọn lửa. Ít áp dụng trong HPLC.
•VD: tách 1 hỗn hợp 3 thành phần X, Y, Z.

89. II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
90
Định lượng bằng phương pháp HPLC
Phương pháp chuẩn hóa diện tích
•Nếu xét đến đáp ứng khác nhau của detector thì cần xác định hệ số
đáp ứng đối với mỗi chất.
•Hệ số đáp ứng liên hệ với chất chuẩn
•Hàm lượng % của X là
Pp này có thể ứng dụng để định lượng các tạp chất trong thuốc.