ADN RECOMBINANTE,ENZIMAS DE RESTTRICCION, CROMOSOMAS ARTIFICIALES

ADN RECOMBINANTE: DEFINICIÓN, ETAPAS, CARACTERÍSTICAS-

1. ADN RECOMBINANTE. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN.
VECTORES. CLONACIÓN MOLECULAR.
CROMOSOMAS ARTIFICIALES.
GENOTECAS. HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS.
Dr. FRANS LEIVA CABRERA
GENÉTICA MÉDICA

2. TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
ADNRECOMBINANTE :Creacióndenuevascombinaciones
deSegmentosodemoléculasdeADNquenose
encuentranjuntasdemaneranatural.
Ingeniería Genética –Clonación molecular –tecnología del ADN Recombinante.
Se ORIGINA a necesidad de:
✓Obtener Genes
✓Conocer las secuencias de los genes
✓Estudiar las mutaciones
✓Analizar su función
✓Otros
FINES: Industriales y médicos
Y conservar el medio ambiente.

3. APLICACIONES EN
INVESTIGACIÓN Y
EN LA MEDICINA
•Diagnostico de
enfermedades.
•Producción
productos
farmacéuticos:
Insulina, otros.
•Medicina forense.
•Terapia génica.
APLICACIONES EN
AGRICULTURA –
GANADERÍA
•Animales
transgénicos.
•Plantas
transgénicas:
resistencia a
herbicidas, mejora
producto, plantas
farmacéuticas.
•Mejora genética de
los cultivos.
•Nuevos insecticida
das naturales.
APLICACIONES EN
MEDIO AMBIENTE
•Biorremediación
•Bioabsorción.
APLICACIONES

4. PRINCIPIOS DE LA TECNOLOGÍA DEL ADN
RECOMBINANTE / CLONACIÓN DE ADN
FUNCIONES ELEMENTOS
CLONAR UN GEN
EXPRESAR UNA
PROTEÍNA
INSERTO
VECTOR
HUESPED
DNA Foráneo (Secuencia que deseo
clonar)
Vector de Clonación
Organismo Huésped (E. Coli)
Selección de Vectores.
¿Vector Hibrido?

5. CLONACIÓN MOLECULAR
CLONACIÓN
CELULAR
•Procesodeaislar
unasecuenciade
ADNdeinterés,
insertarloenun
plásmidoyobtener
múltiplescopiasde
ella en un
organismo.
CLONACIÓN
ACELULAR
•Poraccióndela
DNApolimerasa.La
clonación se
empleafrecuente
paraamplificarADN
que contienen
genes,esencialen
elanálisis.

7. Objetivos
de la
clonación
Amplificación
Expresión
❑Secuenciación
❑Estudio de la estructura de ácidos nucleicos.
❑Estudio de homología entre especies.
❑Identificación de mutaciones: por ejemplo, asociadas a
enfermedad.
❑Estudio del proceso de transcripción y traducción.
❑Estudio de su regulación: Secuencias de control (por
ejemplo, promotores)
Producciónde
laproteínao
RNA (formas
normales o
alteradas)
❑Para su identificación.
❑Para su estudio (propiedades,
función….)
❑Para aplicarla (producción
comercial): diagnostico, terapéutica,
nutrición, industria….
❑Ingeniería de proteínas con
alteración de sus propiedades (para
estudio o aplicación)

8. PASOS DE LA CLONACIÓN CELULAR
1. Aislamiento del ADN foráneo: Enzimas de restricción
(Endonucleasas que van a cortar el ADN en sitios específicos) .
2. Preparación del Vector.
3. Unión del Fragmento de ADN foráneo a un Vector.
4-5. Introducción del Vector –DNA foráneo en la célula
hospedadora, por proceso de TRANSFORMACIÓN.
5.6. Propagación (Cultivarse) y Selección de los
transformantes.
7. Finalmente se genera la Estabilidad de la información
genética( Lo que hoy se conoce como GENOTECAS).

9. ETAPAS DE LA CLONACIÓN DE DNA
1. Aislamiento de ADN
2. Digestión del ADN
3. Ligación del DNA.
4. Clonación del gen de interés
específico.
❑Elección del Vector
❑Formación del DNA recombinante
❑Transformación (El ADN debe incorporarse en la
bacteria).
❑Amplificación. (Cultivar las Bacterias).
5. Aislamiento de Clonas de DNA recombinante.
6. Construcción de GENOTECAS
OJO : No todas las Bacterias
Van a llevar el DNA
recombinante, entonces ???

10. 1. AISLAMIENTO DEL ADN FORÁNEO
❑ADN genómico.
❑ADNc
❑ADN sintético.

11. EXTRACCIÓN DE ARN
ARN inestable
ARNasas
ARN de ADN
ARN puro
ARN solución
Buffer
ARN Almacena congelado
Inhibir las ARNasaspor lo que es un ARN monocatenario es muy sensible.
Tratamiento con Etanol para purificar y luego almacenar en Soluciones Buffer.

12. DIGESTIÓN POR ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Propias de Bacterias (Enzimas para Degradar ácidos nucleicos
de los virus que puedan atacar estas bacterias)
Endonucleasas (Tipo II) : Se usan en la
Clonación Molecular.
Reconocer secuencias de renacimiento: 4 –8
pb palindrómicas de DNA
5´AAGCTT 3´
3´TTCGAA 5´
HindIII

13. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

17. 2. SELECCIÓN DEL VECTOR DE CLONACIÓN –FORMACIÓN DEL ADN
RECOMBINANTE
Son agentes o vehículos de ADN para ADN, capaces de recibir ADN foráneo y replicarlo. VECTOR
Características:
Se replican de forma autónomo: origen de
replicación.
Portar marcadores seleccionables (1 o
mas)
Contienen regiones no esenciales para su
multiplicación y estabilidad.

18. CONDICIONES DE UN VECTOR

19. CONDICIONES DE UN VECTOR

20. CONDICIONES DE UN VECTOR

21. CONDICIONES DE UN VECTOR

22. CONDICIONES DE UN VECTOR

23. TIPOS DE VECTORES

24. TIPOS DE VECTORES EN FUNCIÓN DE:

25. TIPOS DE VECTORES

26. PLÁSMIDO
Son moléculas ADN circular de doble cadena que se
replica fuera de cromosoma en bacteria o levadura.
Permite inserta hasta (10) 20 kb de ADN pero son más
eficaces con insertos más pequeños (<10kb).
Sistemas más comunes.
Presentan:
❑Origenesde Replicación.
❑1 o + sitios de restricción
❑1 o + genes marcadores.

27. BACTERIÓFAGO LAMBDA
❑Virus bacteriano, con ADN doble cadena.
❑El sistema de infección del virus, inyecta ADN en
E.Coli.

28. Tipo 1 o T1
Lambda
P1

30. COSMIDOS
SonVectoreshíbridos,quiméricos:
❑Fragmentoplasmídico(5–7)contieneORIC,sitiosderestriccióndondesevainsertarelADN,
marcadoresseleccionables,circular,ysepropagaenbacterias.
❑FragmentodelfagoLAMBDApresentalasecuenciacos(delinglesCohesivesite),necesarioparael
empaquetadoencápsides(comofago).
❑CapacidaddeinsercióndeADN:Hasta45kb.
Componentes:
❑OrigendeReplicación.
❑Sitiosderestricción.
❑Marcadoresseleccionables.
❑Sitiocos.

32. CROMOSOMAS ARTIFICIALES
❖Puede aceptar grande fragmentos de ADN.
❖Adaptados para:
-Casos de Genoma humano /mamíferos.
-Clonación en células eucariotas.
TIPOS
Cromosomas artificiales bacterianos BACs
Cromosomas artificiales de levadura YACs
PAC
HAC

33. BAC : CROMOSOMA ARTIFICIAL BACTERIANO
❑Son plásmidos bacterianos especializados.
❑Capacidad: 100 –300 kb.
COMPONENTES
✓Oris del Factor F
✓repe: Control de la replicación d.
✓para, B: Control de la replicación.
✓CMr: gen de resistencia a Clorafenicol.
✓LacZ´: MCS o polilynkeren su interior.

34. ❑Genes reguladores de replicación asegura
que este proceso sea adecuado.
❑Vector adecuado → GENOTECA EUCARIOTA
BAC

35. YAC : CROMOSOMA ARTIFICIAL DE LEVADURA
YAC: Yeastartificial chromosome
Capacidad: DNA de 100 a 1000 kb.
COMONENTES:
❑ARS –CEN –TEL
❑Genes marcadores
seleccionables.
❑Sitio de clonación múltiple
que admite 1MB.

36. VECTORES DE EXPRESIÓN
Utilizados para producir una proteína.
Secuencias adicionales:
1)Promotor
2)Secuencia de DNA que transcriba un sitio de fijación al ribosoma bacteriano.
3)Secuencia de iniciación y de terminación de la transcripción.
4)Secuencia de control de la iniciación de la transcripción.

37. 3. INCLUSIÓN DE ADN RECOMBINANTE EN LA CÉLULA HUÉSPED
❑Crecimiento rápido.
❑No ser patógena.
❑Capacidad de captar molécula de ADN del
medio externo e incorporarlos a la célula.

38. 3. INCLUSIÓN DE ADN RECOMBINANTE EN LA CÉLULA HUÉSPED

39. CÉLULA HUÉSPED MAMÍFERO
ENDOMITOSIS
ENCAPSULACIÓN DE CROMOSOMA ARTIFICIAL Y FUSIÓN
DE MEMBRANAS.
UTILIZANDO YAC
VECTORES EN RETROVIRUS
VECTOR YAC
CÉLULA MADRE DE
EMBRIÓN DE
RATÓN
RATÓN TRANSGÉNICO
+
DIFERENTES MÉTODOS

40. 1. Aislamiento del ADN
foráneo y del ADN Vector.
2. Uniòndel fragmento de
ADN foráneo a un Vector. .
3.Introduccióndelvector–
ADNforáneoenlacélula
hospedadora..
4. Selecciònde los
Transformantes. .
5. Estabilidad de la
información genética. .

41. GENOTECAS
Es una colección aleatoria de fragmentos individuales de DNA que en conjunto
representan una parte o el genoma completo de un organismo.

43. TIPOS DE GENOTECAS

44. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN DE ÀCIDOS NUCLEICOS
UTILIDAD:
❑Cribado de Genotecas.
❑Análisis de ADN, ARN
en células /Tejidos.
SONDA
ADN –ADN
ADN -ARN

45. HIBRIDACIÓN DE ÀCIDOS NUCLEICOS

47. SONDA
Fragmento de ADN o ARN de
secuencia conocida, marcada con:
•Radioactivos: 32P
•Colorantes fluorescentes.
Procedencia
•Clones de DNA genòmicoo cDNA.
•Fragmento ADN aislados por PCR.
•Fragmentos sintéticos.
Tamaño variable

48. ELECTROFORESIS
Se utiliza para separar ácidos nucleicos o
proteínas de diferentes tamaños y carga.
Un gel o tamiz molecular
Poliacrilamida Agarosa
Mediante
A través de:
Un campo eléctrico.

49. SOUTHERN BLOT
❑Edwin M. Southern(1975). Desarrollòla técnica “SouthernBlot”
empleada para el estudio de la estructura génica.
❑Southern → Apellido del Investigador.
❑Blot(ingles) → Significa traspasar.
DEFINICIÓN:
Es un método molecular que permite la identificación de
secuencias específicas de ADN en una mezcla del ácido
nucleico.

50. ELEMENTOS PARA SOUTHERN BLOT
ACIDOS NUCLEICOS
SONDAS DE ADN
ENZIMAS DE
RESTRICCIÓN

51. ETAPAS PARA SOUTHERN BLOT
1.Aislamiento del DNA total.
2.Disgestióndel DNA por medio de enzimas de
restricción (Endonucleasas)

52. 3. Separación de los Fragmentos de DNA por electroforesis en gel agarosa
Estemétodoconsisteen
aplicaruncorriente
eléctricadeungel,de
modoqueelADN,que
tienecarganegativa,
migrehaciaelelectrodo
positivo,lavelocidad
dependerádeltamañode
casafragmento.

53. 4. Desnaturalización del DNA

54. 6. Transferencia –Hibridación con sonda molecular radioactiva.
7. Detección y revelado de Secuencias.

56. APLICACIONES DE SOUTHERN BLOT
Permite identificar los constituyente estructurales
del ADN y ARN.
Medicina Legal para el análisis de la huella dactilar
también conocido como análisis de perfil de ADN.
Analizar mutaciones y enfermedades: Análisis de
RFLP
❑Leucemia Linfoblástica crónica.
❑Anemia falciforme.
❑Fibrosis quística.
❑Corea de Huntington
❑DxPrenatal.

57. NORTHERN BLOT
❑James Alwine, David Kemp y George Stark (1975). Universidad de
Stanford.
❑Toma su nombre debido a la similaridadcon el Southernblot.
PERMITE:
❖Identificar un secuencia de ARN especifica en una mezcla
compleja.
❖Determinar el tamaño y cantidad de ARN derivado de una
muestra.

58. ELEMENTOS PARA NORTHERNBLOT
1. ÁCIDO NUCLEICO ARN
2. GELES DE AGAROSA PARA LA ELECTROFORESIS DEL RNA
3. MEMBRANAS
4. SONDAS MARCADAS
En condiciones desnaturalizantes (Formaldehido/formamida)
a)NITROCELULOSA
Baja capacidad de unión de àcidosnucleicos (80ug/cc
2)
frágil carga negativa.
b)NYLON
Mayor capacidad de unión (400 –500 ug/cc
2)
> resistencia carga neutra`o+ .
1.Radioactivida.
2.No radioactivida.
❑El gel es teñido con bromuro de etidio y el RNA visualizado en un transiluminadorUV.

59. PROCEDIMIENTO NORTHERNBLOT
AISLAMIENTO DEL ARN
ELECTROFORESIS
TRANSFERENCIA A SOPORTE SÒLIDO
HIBRIDACIÓN CON SONDA MOLECULAR
DETECCIÓN

60. AISLAMIENTO DEL ARN
❑Obtención de ARN INTACTO.
❑Técnica: Lisis celular, Destrucción de membrana.
Buffer de lisis
caotrópicos
•Sustancias de
desnaturalizan
proteínas,
ADN y ARN.
•Se necesita
centrifugación
(por densidad)
Buffers de lisis
suave.
•Son buffers no
iónicos e
hipotónicos.
•No es muy
caotròpico.

61. ELECTROFORESIS
Las muestras de RNA son sometidas a electroforesis en Gel de Agarosa.

62. TRANSFERENCIA A SOPORTE SÒLIDO
Luego las muestras, por su fragilidad son pasadas a una lámina de NYLON,
logrando una transferencia cuantitativa.
Una vez que la muestra es transferida, es
inmovilizadas por enlaces covalentes a la
lámina de NYLON por calor o por luz UV.

63. HIBRIDACIÓN CON SONDA MOLECULAR y DETECCIÓN

64. APLICACIONES DE NORTHERNBLOT
Diferentes Tejidos (Expresiòn
espacial).
Diferentes etapas del desarrollo
(expresión temporal).
Se utiliza frecuente para realizar estudios de EXPRESIÓN GÉNICA con la finalidad de conocer qué
genes están activos formando ARN mensajero en:

66. APLICACIONES DE NORTHERNBLOT
Conocer la sobreexpresión de oncogenes y supresores tumorales en células
cancerosas.
Conocer la expresión génicas en el rechazo a los órganos transplantados.
Conocer nuevas secuencias génicas.
Conocer errores en la transcripción de ARNm
Observar la reacción de células frente a la presencia de hormonas.
Determinar algunas patologías genéticas en el cuerpo humano, como:
1.Distrofia muscular de Duchenne.
2.Deficiencia de glicerol –quinasa (Hiperglicerolemia)
3.Mutaciones en células B de leucemia linfoblástica crónica.
4.Hipoplasia adrenal congénita.
5.Distrofia miotónica severa.