Análise de Fibra Bruta por diferentes Metodologias

Diferentes Metodologias para Análise da Fibra Bruta e de seus componentes

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUI CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL DISCIPLINA: ANÁLISE DE ALIMENTOS   FIBRA BRUTA KALLIANY KELLZER DA SILVA

2. SISTEMA DE WEENDE PROPOSTO POR HENBERG EM 1864

3. A FB é a porção dos carboidratos totais resistente ao tratamento sucessivo com ácido e base diluídos. Engloba as frações de CELULOSE e lignina insolúvel

4. Esquema de análise proximal dos alimentos, com especificação dos componentes químicos das frações FONTE: Adaptado de Nunes, 1998

5. O método de Weende não é satisfatório para se obter informações sobre os carboidratos, pois inclui no grupo da fibra bruta a celulose e apenas a lignina insolúvel em álcali . Por outro lado, no grupo dos extratos não nitrogenados, encontram-se frações de naturezas diversas, como: amido, hemicelulose , pectina, lignina solúvel em álcali e os carboidratos solúveis em água .

6. A solubilização da lignina dos alimentos, em proporções variáveis, é um sério defeito no método da FB , pois esta lignina torna-se parte do conteúdo do ENN, que deveria ser o componente mais digestível do alimento. Esta divisão parece insatisfatória do ponto de vista nutricional, pois é conhecido que a hemicelulose , pectina e lignina solúvel em álcali não apresentam as mesmas características nutricionais dos outros componentes englobados sob o termo extratos não nitrogenados.

7. FIBRA DIETÉTICA Fibra dietética : Não contém polissacarídeos do tipo amido, mas contém lignina. A digestão clássica da fibra descrita como “fibra bruta” dá um sentido que tem uma relação incerta e variável com o valor nutritivo . O método clássico considera uma porção da proteína da planta, e parte da lignina é gelatinizada ou dissolvida e perdida . O método ideal seria aquele que separa a lignina, celulose e hemicelulose

8. APLICAÇÕES Avaliação nutritiva de rações Eficiência na moagem e refinação de farinhas Verificação da maturação de frutas e vegetais Adulterações do tipo de casca em nozes moídas, sementes em frutas processadas e serragem em alimentos em geral

9. Métodos para análise da Fibra

10. DETERMINAÇÃO DA FIBRA BRUTA SEGUNDO O MÉTODO DA AOAC (MÉTODO BA 6A-05 , 2009 ) A concentração da FB é determinada pelo sistema de análise proximal ou Weende , padronizado por Hennerberg e Stohmann . A Fibra bruta (FB) é obtida através da digestão ácida e alcalina da amostra seca e desengordurada durante 30 minutos em cada digestão. O resíduo orgânico é recebido em cadinho de porcelana . Calcula-se a FB pela diferença de peso do cadinho antes e após a queima do resíduo em mufla .

11. EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS 1.Balança analítica 2.Extrator de fibra 3.Bomba de vácuo 4.Estufa a 105ºC 5.Mufla a 600ºC 1 2 3 5 4

12. EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS: 6.Funil de buchner 7.Kitazato 8.Becker

13. REAGENTES:   Ácido sulfúrico (H2SO4) 0,255 N ou 1,25 % Hidróxido de sódio ( NaOH ) 0,313 N ou 1,25 % Álcool etílico Éter etílico Água quente Papel de filtro qualitativo Espátula Papel tornassol

14. DETERMINAÇÃO DA FIBRA BRUTA SEGUNDO O MÉTODO DA AOAC (MÉTODO BA 6A-05, 2009) PROCEDIMENTO: Preparação da amostra Moer a amostra e misturar bem. Se a amostra não pode ser moída, reduzir a mais fina condição possível. Não se deve triturar a alimentação de melaço. Principio A fibra bruta é a perda por ignição do resíduo seco remanescente após a digestão da amostra com 1,25% H2SO4 e 1,25% de NaOH sob condições específicas.

15. Pesar aproximadamente 2 g de amostra em papel de filtro qualitativo e transferir para um becker de 500 ml de forma alta. Adicionar 200 ml de solução de H2SO4 a 1,25 % aquecido à fervura, e levar ao aparelho digestor por 30 minutos Filtrar o líquido ainda quente no papel de filtro adaptado ao funil de buchner , lavar com água destilada quente, usando bomba de vácuo . Fazer o teste com papel tornassol para indicação da retirada de todo o resíduo do ácido (Tornassol + Ácido = Vermelho). Transferir a amostra do filtro para o becker , lavando com 200 ml de solução de NaOH 1,25 % e levar ao aparelho digestor por 30 minutos Etapas :

16. Filtrar o conteúdo do becker no mesmo papel de filtro , retirando por meio de água destilada quente todo o material existente no becker . Lavar bem com água destilada quente e fazer o teste com papel tornassol para indicação da retirada de todo o resíduo do álcali (Tornassol + Álcali = Azul). Lavar duas vezes com álcool etílico e duas vezes com éter etílico . Embrulhar o papel de filtro com o resíduo e colocar no cadinho. Secar em estufa a 105ºC por duas horas . Esfriar por 30 minutos em dessecador e pesar . Incinerar por quatro horas em forno mufla a 600ºC . Esfriar em dessecador por 40 minutos e pesar. Etapas :

17. DETERMINAÇÃO DA FIBRA BRUTA SEGUNDO O MÉTODO DA AOAC (MÉTODO BA 6A-05, 2009) CÁLCULOS: Onde: A= massa do cadinho+resíduo (g); B= massa do cadinho+cinza (g); C= massa da amostra (g).

18. DETERMINAÇÃO DA FIBRA BRUTA SEGUNDO O MÉTODO DA AOAC (MÉTODO BA 6A-05, 2009) CÁLCULOS:

19. DETERMINAÇÃO DA FIBRA BRUTA SEGUNDO O MÉTODO DA AOAC (MÉTODO BA 6A-05, 2009) LIMITAÇÕES DO MÉTODO Acaba solubilizando a maior parte da hemicelulose e uma quantidade variável de lignina, apresentando resultados subestimados. Substâncias da parede celular são arbitrariamente divididas em duas partes: fibra bruta e extrato livre de nitrogênio ( ENN) Alguma porção da lignina é dissolvida durante a hidrólise é contabilizada no ENN;

20. Gravimétricos Método de Van Soes (FDN ) Para resolver o problema da fibra bruta do método de Weende , tem sido proposto ultimamente o método de Van Soest O qual divide os componentes da amostra analisada em carboidratos não fibrosos e carboidratos fibrosos, essa chamada de fibra em detergente neutro (FDN) e inclui a proteína insolúvel, a hemicelulose e a lignocelulose . Sob o aspecto nutricional, o método Van Soest separa melhor os diversos componentes da fração fibrosa. Portanto, é desejável a substituição da tradicional fibra bruta pela fibra em detergente neutro (FDN ).

21. Gravimétricos Método de Van Soes (FDN) A fibra é separada dos outros componentes do alimento por ebulição com solução detergente em pH neutro. Determina a celulose, a hemicelulose e a lignina Ideal para a determinação de fibra crua M étodo oficial para a determinação da fibra dietética em grãos de cereais Método de Goering e Van Soest (FDA) A fibra é específica e quantitativamente separada por solução detergente em pH ácido . Determina a celulose e a lignina

22. Método Enzimático-Gravimétricos O MÉTODO ENZIMÁTICO envolve inicialmente a remoção do amido, seguido de uma hidrólise para retirar o restante de constituintes que não fibras , como açúcares e ácido urônico . A fração de fibra dietética medida neste processo inclui os amidos resistentes, assim como as fibras totais, fibras solúveis e insolúveis. Método da fibra detergente neutra enzimática (FDN enzimático) Método de fibra detergente ácida (FDA) Método de determinação de lignina e celulose Método para determinação de Pentose Método de fibra alimentar total

23. Método Enzimático-Gravimétricos 1.Método da fibra detergente neutra enzimática(FDN enzimático) Modificações do método proposto por Van Soest Introduziu-se uma etapa de digestão enzimática após a etapa de filtração O método foi adotado pela AACC International , na qual a enzima é adicionada junto com a solução detergente. Estima a fibra alimentar total em produtos de cereais . Inadequado para frutas, folhas e raízes. Há diversas variações de procedimento no método FDN-enzimático: variações na enzima utilizada, bem como nas condições de tempo e temperatura de digestão. AACC: American Association of Cereal Chemists

24. Método Enzimático-Gravimétricos 2 . Método de fibra detergente ácida (FDA ) Usa-se o resíduo obtido no método FDN enzimático, que é adicionado de solução detergente ácida.

25. Método Enzimático-Gravimétricos 3.1 Lignina O resíduo de detergente ácido enzimático é tratado com solução de permanganato . Resíduo de FDA – resíduo de permanganato = LIGNINA 3.2 Celulose O resíduo detergente permanganato, obtido no item anterior, é tratado com H2SO4 a 72%, por 3 horas. Resíduo de permanganato – Resíduo de H2SO4 = CELULOSE 3.Método de determinação de lignina e celulose

26. Método Enzimático-Gravimétricos 4.Método para determinação de Pentose O resíduo de FDN é tratado com 20 mL de H2SO4 1M (2,5h a 100°C), Usa reação de FeCl3-HCl e solução de orcinol alcóolico com pentoses. Há formação de cor, que é lida a 600nm. Procedimento de Roe (1955). Quantificação colorimétrica de açúcares totais , através do uso da antrona , que reage com hexoses produzindo coloração azul e com pentoses, produzindo coloração verde amarelada .

27. Método Enzimático-Gravimétricos Método de fibra alimentar total (adotado pela AOAC International em 2005) Amostras em duplicata são tratadas com Termamil (amilase termo estável ), sendo, em seguida, enzimaticamente digeridas com protease e amiloglucosidase . Nesta solução, estão contidas as fibras solúveis e as insolúveis. Para a precipitação das fibras solúveis , adicionam-se 4 volumes de etanol a 95% . O resíduo total é separado por filtração , lavado com álcool a 95%, com acetona, seco em estufa e pesado. Uma das duplicatas é analisada para se determinar o teor de proteína e, a outra, o teor de cinzas.

28. A fibra alimentar total corresponde ao resíduo menos o percentual de proteína e cinzas .

29. Métodos Enzimáticos-Químicos Separação dos componentes da fibra, por intermédio da hidrólise dos polímeros, seguida da determinação de seus resíduos por Espectrofotometria ou Cromatografia . Método de Englyst Medida colorimétrica rápida de NSP ( polissacarídeos não amido) total Método Uppsala cromatografia gasosa . Método de determinação por pirólise Cromatografia Gasosa ou Espectrometria de Massa Método de determinação de fibra detergente neutra e proteína por espectrofotometria de refletância no infra vermelho próximo - NIR

30. Métodos Enzimáticos-Químicos Método de Englyst Conceito de fibra alimentar : polissacarídeos não amido (NSP) do trato digestivo de humanos Obtém valores de NSP total, solúvel e insolúvel, assim como o conteúdo de celulose, ácidos urônicos e açúcares neutros A amostra é tratada com dimetil sulfóxido em banho-maria em ebulição por 30 minutos, seguida de hidrólise do amido por incubação com enzimas . O resíduo livre de amido é precipitado com etanol, hidrolisado com H2SO4 12M durante 1 hora a 100°C. Os açúcares resultantes da hidrólise são medidos por GLC . Ácidos urônicos são medidos por método colorimétrico . Os polissacarídeos não amido totais são calculados como a soma de açúcares simples e ácidos urônicos .

31. Métodos Enzimáticos-Químicos Medida colorimétrica rápida de NSP total O procedimento é o mesmo do Método de Englyst até a etapa da hidrólise com H2SO4 e incubação por 1 hora a 100°C. O hidrolisado é neutralizado com NaOH , adiciona-se o reagente dinitrosalicilato e a mistura é aquecida por 15 minutos a 100°C . A Leitura da absorbância da amostra e dos padrões é realizada a 530 nm . O valor do NSP total é obtido diretamente como açúcar reduzido medido no hidrolisado.

32. Métodos Enzimáticos-Químicos Método Uppsala Caracterização dos açúcares constituintes da fibra alimentar total por cromatografia gasosa . O teor de fibra equivale à soma de açúcares neutros, ácidos urônicos , amido resistente e lignina Método de determinação por pirólise/GLC/MS Análise de “ lignina de Klason ” Pirólise significa degradação pelo calor em presença de atmosfera inerte. Ocorre fissão térmica da amostra, em fragmentos de massa menor Determinada por Cromatografia Gasosa ou Espectrometria de Massa

33. Métodos Enzimáticos-Químicos Método de determinação de fibra detergente neutra e proteína por espectrofotometria de refletância no infra vermelho próximo - NIR A amostra preparada é colocada dentro do amostrador do NIR. As respostas são convertidas em logaritmo Por comparação da transmitância ou reflectância de uma amostra padrão. Uso de modelos matemáticos estatísticos em programas computacionais. Espectrômetro de absorção no infravermelho por meio da transformada de Fouri FONTE : http://www.ifsc.usp.br/ccmc/index.php/pt/infraestrutura

34. DETERMINAÇÃO DE FIBRA BRUTA, DETERGENTE E ENZIMÁTICA EM DIFERENTES ALIMENTOS E A IMPORTÂNCIA NA DIETA GONÇALVES, L. et al. 5º Simpósio de Segurança Alimentar, Alimentação e Saúde- Bento Gonçalves-RS, 2015

35. Objetivo deste trabalho: Determinar fibra em diversos alimentos, utilizando diferentes metodologias. A determinação de fibra bruta foi de acordo com a AOCS (2009), para fibra detergente (FDN e FDA) foi utilizada a metodologia de Silva (2002) e para a determinação enzimática foi utilizada a metodologia da AOAC (2005).

36. RESULTADOS E DISCUSSÕES A Tabela 1 apresenta os resultados obtidos a partir das análises realizadas nas matrizes alimentares estudadas. Observa-se que para todas as amostras o percentual de fibra obtida pelo método de fibra bruta foram subestimados, quando comparados às outras metodologias. Tabela 1 – Resultados das determinações de fibra por diferentes metodologias   Amostra   FB (%) Fibra detergente   Enzimático FDN (%) FDA (%) Abóbora 0,52±0,11 3,09±0,73 1,61±0,06 0,42±0,04 Banana 0,30±0,03 7,58±0,82 0,41±0,07 1,09±0,02 Cenoura 0,67±0,08 4,37±1,23 1,71±0,56 0,85±0,38 Maçã 0,50±0,11 1,92±0,25 1,33±0,28 2,05±0,03 Repolho 0,70±0,06 3,45±0,26 1,37±0,15 3,86±0,03

37. RESULTADOS E DISCUSSÕES Ao observar a Tabela 2 é possível verificar que os resultados obtidos pelo método de fibra bruta são menores para todas as amostras, quando comparados aos valores de literatura. É importante ressaltar que as tabelas de composição de alimentos são geralmente compilações de pesquisas realizadas em diversas regiões do país e do exterior.

38. RESULTADOS E DISCUSSÕES Tabela 1 – Resultados das determinações de fibra por diferentes metodologias   Amostra   FB (%) Fibra detergente   Enzimático FDN (%) FDA (%) Abóbora 0,52±0,11 3,09±0,73 1,61±0,06 0,42±0,04 Banana 0,30±0,03 7,58±0,82 0,41±0,07 1,09±0,02 Cenoura 0,67±0,08 4,37±1,23 1,71±0,56 0,85±0,38 Maçã 0,50±0,11 1,92±0,25 1,33±0,28 2,05±0,03 Repolho 0,70±0,06 3,45±0,26 1,37±0,15 3,86±0,03

39. RESULTADOS E DISCUSSÕES Desta forma, percebe-se a importância da escolha da metodologia para a determinação de fibra nos alimentos. A fibra alimentar é uma fração complexa , composta de polissacarídeos e lignina que se origina, principalmente, da parede celular e do cimento intercelular de tecidos vegetais. Esta complexidade torna difícil a análise da fração fibra existindo diversas metodologias para sua determinação, porém nenhuma totalmente satisfatória.

40. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AOAC. Crude Fiber Analysis in Feeds by Filter Bag Technique Ba 6a-05 . 2009 CECCHI, H. M. Fundamentos teóricos e práticos em análise de alimentos- 2ªed.rev. - Campinas, SP: Editora da UNICAMP, 2003. Freitas, S. C. et al. Coletânea de métodos analíticos para determinação de fibra – Rio de Janeiro: Embrapa Agroindústria de Alimentos , 2011. GONÇALVES, L. et al. Determinação de fibra bruta, detergente e enzimática em diferentes alimentos e a importância na dieta. 5º Simpósio de Segurança Alimentar, Alimentação e Saúde- Bento Gonçalves-RS, 2015. LOPES, L. H. et al. Determinação de fibra bruta em diferentes matrizes alimentares . VII MICTI. Mostra Nacional de Iniciação Científica e Tecnológica Interdisciplina . Instituto Federal Catarinense - Campus Concórdia, 2014. RODRIGUES, R. C. Métodos de análises bromatológicas de alimentos: métodos físicos, químicos e bromatológicos . Pelotas-RS: Embrapa Clima Temperado , 2010. SABIONI, J. Métodos de determinação da fibra alimentar . Boletim do Centro de Pesquisa de Processamento de Alimentos, v. 7, n. 1, 2009. SILVA, D. J. Análise de Alimentos: Métodos químicos e biológicos . Viçosa, UFV, Imprensa Universitária, 1981.