Ap15 - Tipagem HLA

Aula prática: Tipagem HLA

1. Aula 15
Trabalho realizado pelos acadêmicos de Medicina da UFBA Adriana
Campos, Nivaldo Cardozo Filho, Sabrina Oliveira e Silvana Asfora, sob
orientação dos Professores Roberto Meyer, Ivana Nascimento, Robert
Schaer, Cláudia Brodskyn, Songelí Freire e Denise Lemaire, do
Laboratório de Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA.

Atualizado em outubro de 2003

2. Para aumentar ao máximo o tempo de sobrevida do Para aumentar ao máximo o tempo de sobrevida do
enxerto, os receptores e os doadores potenciais devem enxerto, os receptores e os doadores potenciais devem
ser histocompatíveis. A tipagem tecidual é feita com o ser histocompatíveis. A tipagem tecidual é feita com o
auxílio de uma bateria de anticorpos monoclonais anti-HLA auxílio de uma bateria de anticorpos monoclonais anti-HLA
ou com o uso de seqüências de DNA específicas. Assim, é ou com o uso de seqüências de DNA específicas. Assim, é
possível determinar as especificidades HLA expressas por possível determinar as especificidades HLA expressas por
cada indivíduo e o grau de compatibilidade entre o cada indivíduo e o grau de compatibilidade entre o
receptor e o potencial doador.receptor e o potencial doador.
O ideal é que o receptor não reconheça o tecido a ser O ideal é que o receptor não reconheça o tecido a ser
enxertado como estranho, não desenvolvendo reação enxertado como estranho, não desenvolvendo reação
imunológica. Sendo as moléculas HLA os alvos principais da imunológica. Sendo as moléculas HLA os alvos principais da
reação de rejeição, a compatibilidade HLA entre receptor reação de rejeição, a compatibilidade HLA entre receptor
e doador, diminui a chance de acontecer rejeição ao e doador, diminui a chance de acontecer rejeição ao
enxerto. O grau de compatibilidade mínima necessária enxerto. O grau de compatibilidade mínima necessária
entre receptor e doador depende do tipo de transplante.entre receptor e doador depende do tipo de transplante.

3. A probabilidade de encontrar indivíduos HLA-A probabilidade de encontrar indivíduos HLA-
compatíveis é muito maior entre membros de uma compatíveis é muito maior entre membros de uma
mesma família do que entre indivíduos não mesma família do que entre indivíduos não
aparentados. Isto deve-se a uma característica aparentados. Isto deve-se a uma característica
importante do HLA, o polimorfismo. Contudo, ainda importante do HLA, o polimorfismo. Contudo, ainda
que a probabilidade de dois indivíduos não que a probabilidade de dois indivíduos não
aparentados serem HLA-compatíveis seja muito aparentados serem HLA-compatíveis seja muito
pequena, ela existe. Assim, pacientes que precisam de pequena, ela existe. Assim, pacientes que precisam de
um transplante de medula óssea e não encontra um um transplante de medula óssea e não encontra um
Doador HLA-compatível na família podem encontrar Doador HLA-compatível na família podem encontrar
um doador após a busca em um banco de doadores um doador após a busca em um banco de doadores
voluntários de medula óssea (quanto maior for este voluntários de medula óssea (quanto maior for este
banco, maior será a chance de encontrar um doador).banco, maior será a chance de encontrar um doador).
Nos Nos slidesslides a seguir, você será apresentado (ou a seguir, você será apresentado (ou
relembrará) a alguns importantes conceitos erelembrará) a alguns importantes conceitos e
conhecimentos na área dos transplantes.conhecimentos na área dos transplantes.

4. Transplante Clínico
Órgãos / Tecidos mais Transplantados
- Rim
- Coração
- Fígado
- Córnea
- Medula óssea
- Pele, etc...

5. Barreiras aos Transplantes
•Autotransplante
•Isotransplantes
 Tolerância
•Alotransplantes
•Xenotranplantes
 Rejeição

6. 1944 - Medawar,P.: publicação dos resultados de
experimentos realizados em animais:
 “A rejeição do enxerto é resultante de uma
resposta imunológica, específica e com memória,
ao tecido ou órgão transplantado”.
Mecanismos de rejeição

7. Kuby, 2000
Linfócito Th
Macrófago
ativado
Linfócito TDTH
Linfócito B
Plasmócito
Célula NK
ou macrófago
Linf.
citotox.
Enzimas
líticas
Expressão
MHC
citotoxicidade
lise
lise
ADCC
Receptor
de Fc
MecanismosHumoraise
Celulares
Aloantígeno
MHC classe I
Aloantígeno
MHC classe II
ENXERTO
Mecanismos Imunológicos

da reação de rejeição

8. Alvos da rejeição:
antígenos de histocompatibilidade
Antígenos de
Histocompatibilidade no Homem
•HLA - Antígenos Leucocitários
Humanos (Dausset e Payne,1960)

9. A Compatibilidade HLA
•Glicoproteínas HLA - presentes
na membrana de todas as
células nucleadas do organismo.
•Pessoas compatíveis - possuem
as mesmas moléculas HLA

10. Moléculas HLA
•Grupos de proteínas HLA
importantes para os
transplantes:
HLA-A / HLA-B / HLA-DR
•Designação numérica. Ex:
HLA-A2; HLA-B7; HLA-
DR8

11. Moléculas HLA
•Para cada tipo de
molécula HLA há
várias proteínas
diferentes
(polimorfismo)
•Veja:
HLA-A : 124
HLA-B: 258
HLA-DR: 221

12. HLA - Genética
•Os genes estão
localizados no
cromossomo N
o
6.
•Nós somos diplóides:
Ý dois cromossomos 6;
Ýdois conjuntos de genes
do HLA
(dois haplótipos).

13. Herança do HLA
•O HLA é herdado
em conjunto
(haplótipo).
•Um haplótipo do pai
e um da mãe.
•Existem portanto um
total de 4
combinações
diferentes dos
haplótipos dos pais.

14. (0,25)
HLA - Herança
(0,25) (0,25)(0,25)
Pais
Filhos
(0,5 / 0,5) (0,5 / 0,5)
uma das permutações possíveis

15. Herança do HLA - Probabilidade
•Chance que você tem de ter um irmão:
1. HLA-idêntico = 25%
2. HLA-distinto = 25%
3. HLA-haplo-idêntico = 50%

16. HLA e Rejeição de Enxerto
•Rejeição:
– Hiperaguda - dentro de 48 h após o enxerto
– Aguda acelerada - até 7 dias após o enxerto
– Aguda - após 7 dias
– Crônica (Doença crônica do enxerto) - vários meses ou
anos após o enxerto
•A Rejeição pode ser devida a:
–Pré-sensibilização do receptor a antígenos HLA do doador
(transfusão de sangue, gravidez, transplante etc.)
–Ativação primária da resposta imune anti-enxerto após o
transplante.

17. Prevenção da rejeição
•Provas Cruzadas (Cross-Match)
 Previne, principalmente, a “Rejeição hiperaguda e
a aguda acelerada”.
•Tipagem tecidual (Determinação dos
antígenos HLA do doador e do receptor)
 Permite selecionar os pares Receptor-Doador
histocompatíveis.
•Imunossupressão inespecífica
 Pode controlar as reações de rejeição.
•Imunossupressão específica
 Reduz as respostas anti-enxerto sem aumentar a
susceptibilidade às infecções.

18. Provas Cruzadas (Crossmatch)
•Indica se o receptor tem anticorpos pré-formados
contra o potencial doador.
•Mistura-se uma pequena quantidade de soro do
receptor com linfócitos do provável doador e adiciona-se
uma fonte de proteínas do sistema complemento.
•Se o paciente tiver anticorpos contra o HLA do
doador, a membrana das células do doador será lesada
pelo complemento e este crossmatch é chamado de
positivo.
• Um crossmatch positivo representa uma forte contra-
indicação ao transplante, pois significa que o receptor
poderá ter uma forte rejeição ao enxerto (rejeição
hiperaguda)

19. Testes de Histocompatibilidade no
Transplante de Órgãos - Provas Cruzadas
•Soro do receptor
•+ Linf. totais (T+B) do
doador
•+ Complemento
•+Corante vital
•+Formol
Prova Cruzada (Cross-Match) clássica
Teste de Microlinfocitotoxicidade
(Terasaki e McClelland)

20. •As células do possível doador são
incubadas com o soro do paciente
(receptor):
–As células usadas são, normalmente, linfócitos
T ou B, obtidos a partir de sangue periférico
(doador vivo) ou linfonodos (doador cadáver).
–As células são purificadas por gradiente de
densidade e aderência à lã de nylon ou com o
uso de esferas magnetizadas contendo
anticorpos anti-T ou anti-B.

21. linfócito teste
HLA-A3
linfócito teste
HLA-A3
anti-HLA-B5anti-HLA-A3
Complemento
(Ativação)
Complemento
(Não ativação)
Corante vital
(penetra na
célula
lesada)
Corante
não pene-
tra na célula
intacta
Veja a reação de microlinfocitotoxicidade:
Linfócito com membrana lesada Linfócito intacto

22. Veja o resultado ao microscópio de contraste de fase:
a: Linfócitos não lisados
(reação de citotoxicidade negativa)
b: Linfócitos lisados
(reação de citotoxicidade positiva)
Kuby, 2000

23. A reação de microlinfocitotoxicidade
é realizada em placas de Terasaki,
apresentada a seguir:

24. •Provas mais sensíveis e específicas:
–CM-T (HLA Classe I)
–CM-B (HLA Classe II)
–Tratamento do soro com agente redutor de IgM
•(Ditiotreitol [DTT])
–Adição de Anti-Gamaglobulina (AGH)
–Citometria de fluxo...
•Análise da Reatividade contra Painel de Linfócitos
(PRA)
Testes de Histocompatibilidade no
Transplante de Órgãos - Provas Cruzadas

25. Tipagem MolecularTipagem Molecular

Sonda seqüência-específica (PCR-SSO)Sonda seqüência-específica (PCR-SSO)
Envolve a amplificação a amplificação pela “Reação em Cadeia da Envolve a amplificação a amplificação pela “Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR)” de um éxon do gene do HLA, utilizando Polimerase (PCR)” de um éxon do gene do HLA, utilizando
““primers” primers” de oligonucleotídios que hibridizam com regiões do de oligonucleotídios que hibridizam com regiões do locuslocus
HLA que são conservadas entre diferentes alelos. A seqüência HLA que são conservadas entre diferentes alelos. A seqüência
amplificada é então hibridizada com diferentes sondasamplificada é então hibridizada com diferentes sondas de de
oligonucleotídios, cada uma com seqüências específicas de um alelo oligonucleotídios, cada uma com seqüências específicas de um alelo
ou grupo de alelos HLA.ou grupo de alelos HLA.
• Esses ensaios visam a definição das especificidades (baixa Esses ensaios visam a definição das especificidades (baixa
resolução) ou dos alelos (alta resolução) HLA de um indivíduo, a resolução) ou dos alelos (alta resolução) HLA de um indivíduo, a
partir de amostra de DNA e com o uso de “primers” e sondas partir de amostra de DNA e com o uso de “primers” e sondas
específicas.específicas.
•Dois desses métodos cada vez mais utilizados: Dois desses métodos cada vez mais utilizados:

26. Amplificação seqüência-específica (PCR-SSP)Amplificação seqüência-específica (PCR-SSP)
Esse método consiste em colocar o DNA de uma amostra em Esse método consiste em colocar o DNA de uma amostra em
diferentes tubos com dois diferentes tubos com dois primersprimers PCR. Um dos primers hibridiza PCR. Um dos primers hibridiza
uma região conservada do uma região conservada do locuslocus HLA que está sendo tipado, HLA que está sendo tipado,
sendo adicionado a todos os tubos (ex. HLA-DRB1). O segundo sendo adicionado a todos os tubos (ex. HLA-DRB1). O segundo
primerprimer PCR hibridiza com uma região polimórfica do PCR hibridiza com uma região polimórfica do locuslocus HLA – HLA –
cada tubo contém um cada tubo contém um primerprimer de especificidade diferente. A de especificidade diferente. A
amplificação do DNA só será observada no tubo contendo um amplificação do DNA só será observada no tubo contendo um
segundo segundo primerprimer específico que corresponde ao alelo (alta específico que corresponde ao alelo (alta
resolução) ou grupo de alelos (baixa resolução) do HLA na resolução) ou grupo de alelos (baixa resolução) do HLA na
amostra de DNA O produto gênico amplificado poderá ser amostra de DNA O produto gênico amplificado poderá ser
detectado em gel de agarose corado com Brometo de Etídio.detectado em gel de agarose corado com Brometo de Etídio.
FIM