clase 5 Electroforesis y radiactividad.pptx

analisis de electroforesis y utilizacion de tecnicas radioactivas

1. Western Blotting : Proteínas separadas en PAGE se transfieren a una membrana de nitrocelulosa y se tiñen con un anticuerpo específico .

2. Ejemplo 1

3. Ejemplo 2 EGFP EGFP- Ng

4. Ejemplo 3

5. Electroforesis No- Denaturante La zimografía es una técnica electroforética que permite medir actividad de proteasas.

6. Técnica electroforética en poliacrilamida (sin SDS) La polimerización de la poliacrilamida se realiza en presencia de gelatina soluble (sustrato de la enzima). Luego de realizar la corrida electroforética de las muestras, el gel se incuba en un buffer apropiado que favorece la actividad de las proteasas . Gel de caseína teñido con azul de Coomassie Gel normal teñido con azul de Coomassie

7. El resultado de este tipo de geles, es que en la zona donde se ubicó una proteasa la gelatina habrá sido degradada. Esta degradación se revela tiñendo el gel con azul de Coomassie , observándose una zona blanca en el sitio donde hubo degradación.

8. 1 2 3 4 Ejemplo 1: MMP-2 tratada con un inhibidor de su a ctividad por distintos tiempos

9. Ejemplo 2

10. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL (2D PAGE) La electroforesis bidimensional permite la separación de mezclas complejas de proteínas, la separación se hace en dos etapas consecutivas. En la “primera dimensión”, las proteínas son separadas en función de su carga a lo largo de un gel con gradiente de pH ( Isoelectroenfoque ). Cada proteína avanza en el campo eléctrico hasta alcanzar un valor de pH igual a su punto isoeléctrico. Dependiendo del pH del medio en el que se encuentra, una proteína tendrá carga positiva o negativa o no estará cargada. El valor de pH en el que una proteína presenta carga neta 0 es conocido como “punto isoeléctrico” y es característico de cada proteína.

11. ISOELECTROENFOQUE OH - OH - OH - OH - OH - OH - OH - OH - OH - OH - OH - OH - OH - OH - OH - H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+

12. En l a “segunda dimensión” las proteínas son separadas en función de su masa molecular. La visualización del resultado de estas dos electroforesis muestra el conjunto de proteínas presentes en la mezcla inicial.

13. GEL BIDIMENSIONAL

14. DETECCION DE PROTEIINAS FOSFORILADAS EN GELES BIDIMENSIONALES

15. USO DE RADIOISOTOPOS EN LAS TECNICAS BIOQUIMICAS

16. TIPOS DE RADIACION

17. CURVA DE CRECIMIENTO CON [H 3 ]-TIMIDINA Se miden las cpm en cada muestra en un contador de centelleo Determinación de la proliferación celular Lisar las células las celulas cpm incorporadas (%) = cpm de la muestra x 100 cpm totales

18. Cinética de proliferación Curva Dosis-Respuesta

19. IDENTIFICACION DE PROTEINAS FOSFORILADAS CON ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

20. Análisis de fosforilación en gel bidimensional