clase 9 plasmidios y tecnologia de clonaje.pptx

tecnologia del DNA recombinante

1. TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE

2. PROCESAMIENTO DEL DNA Extracción: Sacar el DNA desde un compartimento celular. Purificación: Separación del DNA Lisar las células que contienen el DNA de proteínas solubles Inactivación de nucleasas ( Dnasa , Rnasa ) de otros ácidos nucléicos no deseados Clarificación: separación del DNA de los restos celulares ( debris ). Ej : centrifugación, filtración. de lípidos y carbohidratos de sales y otros compuestos orgánicos

3. Lisis alcalina : Este método explota las diferencias en las propiedades de denaturación y renaturación entre el DNA plasmidial y el DNA cromosómico. La alcalinización con NaOH en presencia de un detergente fuertemente aniónico (SDS), provoca la lisis celular, la denaturalización del DNA cromosómico y de las proteínas, y la liberación de los plásmidos. La neutralización con una alta concentración de acetato de potasio, provoca la precipitación de las proteínas y del DNA cromosómico. Los agregados de proteínas y DNA cromosómico se separan por centrifugación del DNA plasmidial , que queda en el sobrenadante y conserva mayoritariamente su estructura nativa. Purificación de DNA plasmidial

4. Determinación de la concentración y grado de pureza de la muestra de DNA plasmidial Determinar la concentración de DNA plasmidial de la muestra midiendo la A 260 en un espectrofotómetro. Se considera que una unidad de absorbancia a 260nm, equivale a una concentración de 50 µg/ml de DNA de doble hebra. Se cuantifica el grado de pureza de la muestra determinando la razón entre la absorbancia a 260 nm y a 280 nm . Experimentalmente, la razón de A 260 /A 280 de una solución de ADN puro se encuentra entre 1.8 y 2.0. Cuando aumenta la contaminación con proteínas, esta relación disminuye.

5. La absorción a 260 nm del DNA de doble hélice es menor que la del DNA desnaturalizado en estado de simple hebra.

6. El plasmidio tiene una forma espacial como un círculo cerrado (CCC) o plásmido superenrollado . Si la molécula es dañada mecánicamente puede suceder que: 1.- Se forme un nick al romperse sólo una de las dos cadenas de ADN. Esto trae como consecuencia que el plásmido se desenrolle y se forme un círculo abierto (OC). 2.- Se rompan enlaces de las dos cadenas de tal manera que el plasmidio se corte quedando de forma lineal. Las moléculas de ADN plasmidial del tipo CCC migran más rápido que la forma lineal del plasmidio y éstas, a su vez, migran más rápido que las moléculas en configuración OC. Electroforesis de DNA plasmidial

7. Velocidad de migración del DNA plasmidial en geles de agarosa

8. Velocidad de migración del DNA plasmidial en geles de agarosa

9. Clonación La clonación consiste en insertar un segmento de DNA foráneo en una molécula capaz de replicarse en forma autónoma. A ése tipo de molécula de ADN se lo denomina vector de clonaje. Los plásmidos son excelentes vectores de clonaje. Pueden ser "cortados" con una ó dos enzimas de restricción puede incorporársele un fragmento de ADN que ha sido previamente cortado usando mas mismas enzimas de restricción. Los plásmidos así modificados se los denomina plasmidios recombinantes . En éste estado, se los introduce entonces en una bacteria donde serán replicados.

10. Clonación es insertar un segmento de ADN foráneo en un vector, transformar las bacterias con este vector y seleccionar las bacterias transformadas.

11. Transformación bacteriana Transformación genética literalmente significa cambio causado por genes e involucra la inserción de uno o más genes en el organismo en orden de cambiar las características del organismo.

12. Selección de las bacterias tranformadas

13. Preparación de células competentes y transformación CaCl 2 + choque térmico : Consiste en tratar las bacterias con 0.1M CaCl 2 en frío por 1h y posteriormente someterlas a un breve choque térmico (42°C) durante 30 segundos. Las células competentes se pueden guardar casi indefinidamente en 10% (v/v) glicerol estéril. Mezclar y conservar en hielo por 30 min, después guardar a -70  C

14. Electroporación Consiste en someter las bacterias a un shock eléctrico, generando una diferencia de potencial elevado que perforar á temporalmente la pared celular.