Cromatografia fase normal - Artigo_20251006_151210_0000.pdf

Resumo do artigo sobre análises de polifenóis em licor de cacau, cacau e chocolate por HPLC de fase normal e reversa

1. ANÁLISES DE POLIFENÓIS EM LICOR
DE CACAU, CACAU E CHOCOLATE POR
HPLC DE FASE NORMAL E REVERSA
1/26

2. 1. INTRODUÇÃO
As semente de cacau são ricas em polifenóis antioxidantes, compostos
naturais presentes em plantas que, ao serem consumidos, podem oferecer
diversos benefícios à saúde, como a redução do risco de doença coronariana e
a redução da incidência de aterosclerose (testes em laboratório).
Um dos mecanismos responsáveis ​​por esses efeitos fisiológicos envolve a
inibição da oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDL).
Alguns componentes antioxidantes do licor de cacau são: flavan-3-óis e
oligômeros de procianidina.

3. 2. OBJETIVO
Examinar, por meio de análises qualitativas e quantitativas por HPLC e LC-
MS, os oligômeros de proantocianidina e os polifenóis individuais em várias
preparações de licor de cacau derivadas de grãos de cacau, o qual foram
importados de seis países diferentes, e produtos (chocolate e cacau) feitos
a partir dessas preparações de licor de cacau.

4. 3. METODOLOGIA
O licor de cacau foi isolado e preparado da seguinte forma:
1 Kg de Licor foi preparado a partir de 1,9 Kg de grãos de cacau originários
do Equador.
Isso foi tratado com um volume quíntuplo de n-hexano para remover
gorduras.
O licor de cacau desengordurado (875 g) foi então extraído com 6 L de
acetona 70%, a qual foi foi removida por evaporação sob pressão reduzida.
A solução aquosa resultante foi extraída com um volume 9 vezes maior de
n-butanol.

5. 3. METODOLOGIA
O licor de cacau foi isolado e preparado da seguinte forma:
1 Kg de Licor foi preparado a partir de 1,9 Kg de grãos de cacau originários
do Equador.
Isso foi tratado com um volume quíntuplo de n-hexano para remover
gorduras.
O licor de cacau desengordurado (875 g) foi então extraído com 6 L de
acetona 70%, a qual foi foi removida por evaporação sob pressão reduzida.
A solução aquosa resultante foi extraída com um volume 9 vezes maior de
n-butanol.

6. A solução resultante foi colocada em uma coluna Di-aion HP-2MG
(Mitsubishi Kagaku Co. Ltd.) de 15 cm x 10 cm de diâmetro interno.
A coluna foi lavada com 15% (v/v) de etanol contendo 0,1% de ácido
trifluoroacético em H₂O para remover a teobromina.
3. METODOLOGIA

7. A eluição ocorreu com 80% (v/v) de metanol.
Isso produziu uma fração rica em proantocianidina (17 g), denominada aqui
como "proantocianidina do licor de cacau (CLPr)".
10 mg de CLPr foram adicionados à fase normal utilizando uma coluna
Supelcosil LC-Si (Supelco, Bellfonte, PA, EUA, 25 cm × 21,2 mm de diâmetro
interno, 5 µm).
3. METODOLOGIA

8. A eluição produziu quatro frações, cada uma contendo flavan-3-óis, dímeros,
trímeros e tetrâmeros de proantocianidina.
Os compostos isolados foram identificados ou por comparação direta com
espécies autênticas ou por comparação com dados relatados na literatura.
3. METODOLOGIA

9. 4. MOLÉCULAS ANALISADAS

10. 3. METODOLOGIA
A preparação da solução polifenólica (PS) a partir de licor de cacau, cacau puro e
chocolate amargo aconteceu da seguinte forma:
Seis tipos de licor de cacau foram preparados por uma empresa utilizando
grãos de cacau importados de seis países diferentes: Equador, Venezuela,
Gana, Colômbia, Costa do Marfim e Brasil.
O cacau puro e o chocolate amargo, foram feitos com licor de cacau, açúcar,
manteiga de cacau e lecitina.

11. 3. METODOLOGIA
10,00g de cada licor de cacau foi triturado 3 vezes com um volume de n-
hexano 5 vezes maior que o descrito anteriormente, para remover a maior
parte da gordura.
O licor de cacau desengordurado (0,5000 g) foi extraído 3 vezes com um
volume de 100 vezes de acetona a 80% (v/v).
Essa solução aquosa de acetona, que continha quase todos os polifenóis
(catequinas e proantocianidinas), foi diluída para 200 ml com acetona a 80%
em um balão volumétrico, a fim de passar na coluna e ser lida pelo
equipamento.

12. 3. METODOLOGIA - ANÁLISE DO HPLC
O teor total de polifenóis dos derivados do licor de cacau, cacau puro e
chocolate amargo foram medidos pelo método do azul da Prússia, utilizando
epicatequina como padrão.
O aparelho de HPLC utilizado foi o Tosoh
(bomba CCPM, detector UV-8020)
conectado a um integrador Waters
Maxima (Milford, MA, EUA).
Os compostos eluídos foram detectados
monitorando a absorbância UV a 280 nm

13. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) semipreparativa:
Coluna Supelcosil LC-Si (25 cm × 21,2 mm de diâmetro interno, 5 µm).
Sistema solvente: CH₂Cl₂–MeOH–HCOOH–H₂O
Proporções: (A) 5:43:1:1 (v/v) e (B) 41:7:1:1 (v/v).
Gradiente linear: de 0 a 20% de A em 40 min e de 20 a 100% de A em 5 min
(vazão de 20 ml/min), utilizando uma bomba Tosoh CCPP-M.
3. METODOLOGIA - CLAE SEMIPREPARATIVA-CH₂Cl₂: Diclorometano
-MeOH: Metanol
-HCOOH: Ácido fórmico
-H₂O: Água

14. Os oligômeros de proantocianidina foram analisados ​​pelo método de Rigaud
et al., modificado pelos autores.
2 mL de licor de cacau, cacau puro e chocolate amargo foram concentrados
para correr na coluna Supelcosil, utilizada no estudo.
Eluição:
Sistema solvente: CH2Cl2-MeOH-HCOOH-H2O
Proporção: (A) 5:43:1:1 (v/v) e (B) 41:7:1:1 (v/v)
Gradiente linear: 0 a 20% A em 30 min, e de 20 a 100% A em 10 min,
seguido por eluição isocrática com 100% A por 5 min (vazão, 1,3 ml/min).
3. METODOLOGIA - ANÁLISE DE PROANTOCIANIDINAS

15. Análise de catequinas (polifenóis) por HPLC de fase reversa (RP-LC).
3. METODOLOGIA
Análise
Coluna Deverosil ODS HG-5 (Nomura Chemical Co. Ltd., Aichi, Japão; 250 mm
× 4,6 mm de diâmetro interno, 5 µm) .
Solventes: (A) 0,1% de ácido trifluoroacético em CH CN e (B) 0,1% de
ácido trifluoroacético em água.
Gradiente linear: 10% de A em 5 min, de 10 a 25% de A em 25 min e de 25 a
100% em 5 min (vazão de 0,8 ml/min).
Análise de proantocianidinas por HPLC de fase reversa foi feita com
espectrometria de massas (RP-LC/MS).3

16. 3 4. RESULTADOS
(Padrão)

19. A abundância relativa de cada tipo de oligômero (NP-LC),
exceto no caso dos grãos de cacau da Venezuela, foi a
seguinte:
monômeros > trímeros > dímeros > tetrâmeros.
A abundância relativa dos componentes individuais, medida
por RP-LC, foi a seguinte:
epicatequina > cinamtanina A2 > procianidina B2 >
procianidina C1 > catequina > Gal-EC-EC.
4. RESULTADOS

23. O teor de polifenóis totais dos cacaus foi superior ao dos
chocolates, enquanto as quantidades de oligômeros de
proantocianidina, exceto o monômero presente nos cacaus, foi
menor do que nos chocolates.
As proporções relativas de catequinas e proantocianidinas nos
cacaus foram diferentes daquelas encontradas nos licores de
cacau ou nos chocolates.
4. RESULTADOS

25. A análise NP-LC feita nas condições descritas no artigo pode
servir para distinguir cada tipo de polifenóis de baixo peso
molecular (flavan-3-óis), dímeros, trímeros, tetrâmeros e
oligômeros de proantocianidina, enquanto a análise por RP-LC é
adequada para a identificação e medição de polifenóis
individuais nos produtos.
As proporções relativas dos componentes proantocianidina em
cada licor de cacau foram quase as mesmas, mas a quantidade
de cada componente proantocianidina foi diferente
4. DISCUSSÃO

26. Os autores analizaram chocolate amargo e cacau em pó puro.
Mas quase todos os produtos de cacau disponíveis no mercado
contêm leite, que interfere na análise de polifenóis, devido à
ligação entre as proteínas do leite e os polifenóis, estudos
adicionais devem ser realizados para esclarecer melhor esse
aspecto.
4. DISCUSSÃO