Diagnóstico de Laboratorio en Reumatología

Dx Diagnóstico Reumatología

1. Una mirada al diagnóstico de laboratorio de las enfermedades autoinmunes Hospital de Especialidades CMN siglo XXI Laboratorio Central de A nálisis Clínicos Cristopher Luna Bañuelos

2. INDICE INTRODUCCIÓN 2. DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO PARA UNA EVALUACION INICIAL 3. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

3. Introducción El sistema inmunitario protege al organismo, contra infecciones por microorganismo, al detectarlos y eliminarlos, limita el crecimiento de ciertas neoplasias, y elimina las células . D ebe distinguir de forma fiable entre moléculas propias y ajenas. Cualquier trastorno en este proceso puede llevar a la aparición de autoinmunidad.

4. Las enfermedades autoinmunes (EA) son provocadas por un daño intrínseco del sistema inmunológico como consecuencia de la pérdida de la autotolerancia que condiciona respuestas anormales frente estructuras propias, lo que genera un daño tisular que perdura en el tiempo . En este caso, el sistema se conviertes en el agresor y ataca partes del cuerpo en vez de protegerlo.

5. Las causas son multifactoriales y la predisposición genética es poligénica , lo que provoca proteínas diferentes en las células inmunológicamente activas o en las orgánicas . La mayor contribución se debe a los genes del sistema principal de histocompatibilidad ya que estos genes pueden influir en la selección de los linfocitos autorreactivos y en el desarrollo de la autotolerancia.

6. Las influencias ambientales, principalmente causadas por infecciones, pueden predisponer para la autoinmunidad a través de varios mecanismos, entre ellos la estimulación de los coestimuladores en los tejidos y las reacciones cruzadas entre antígenos microbianos y autoantígenos frente a anticuerpos, al convertirlos en auto-anticuerpos.

7. Las Enfermedades autoinmunes se clasifican de acuerdo a su extensión en :

8. Actualmente, el apoyo por el laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades autoinmunes consiste en un gran numero de técnicas que permiten tanto identificar como confirmar el o los anticuerpo(s) específificos reconocidos. Además, este tipo de técnicas han evolucionado de manera importante en las úlltimas décadas, ya que se han desarrollado pruebas con mayor especificidad y sensibilidad .

9. DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO PARA UNA EVALUACIÓN INICIAL Las alteraciones más comunes encontradas en las pruebas iniciales de laboratorio, que en gran medida dependen del tipo de EA que afecta al paciente, son:

10. Coagulogramas alterados por incremento del tiempo de tromboplastina activada parcial, tiempo de protrombina, o ambos, como en el síndrome de anticuerpos anti-fosfolípidos ( aFL ). El incremento de los niveles en enzimas musculares como la creatinina cinasa (CK), alanino aminotransferasa (ALT o TGP) y aspartato aminotransferasa (AST o TGO), que se pueden encontrar en las miopatías inflamatorias autoinmunes, como la dermatomiositis , PM y la miositis con cuerpos de inclusión (MCI). McPherson RA, Pincus  MR. Henry's clinical diagnosis and management by laboratory methods . 21st ed. Philadelphia: WB Saunders; 2010.

11. Seshan SV, Jennette JC. Renal disease in systemic lupus erythematosus with emphasis on classification of lupus glomerulonephritis . Arch Pathol Lab Med. 2009.

12. En los análisis de orina se observan alteraciones asociadas a daño renal, como proteinuria, hematuria o sedimentos activos (leucocitos o eritrocitos), como en la glomerulonefritis y la nefritis intersticial. Seshan SV, Jennette JC. Renal disease in systemic lupus erythematosus with emphasis on classification of lupus glomerulonephritis . Arch Pathol Lab Med. 2009.

13. Los A utoanticuerpos

14. Los anticuerpos reconocen :

15. PRINCIPALES AUTOANTICUERPOS EN REUMATOLOGÍA GRUPOS ESTRUCTURAS ANTIGÉNICAS AUTOANTICUERPOS A. Factor reumatoideo  Fragmento Fc de IgG Ig anti IgG (generalmente IgM) B. Anticuerpos antinucleares 1) Nucleosoma Anti ADN Anti histonas Anti DPN o complejo ADN -Histona (fenómeno LE)   2) Proteínas no histonas asociadas al ADN  Anticentrómero Anti Scl 70 Anti Ku Antiláminas nucleares   3) Proteínas no histonas asociadas al ARN Anti Sm Anti U1 RNP Anti U2 RNP Anti-hm RNP Anti Ro/SSA Anti La/SSB Anti Jo 1   4) Nucléolos Antinucleolares C. Anticuerpos anticitoplasma  de neutrófilo (ANCA) Gránulos azurófilos de los neutrófilos Antiproteasa serina y otros (C-ANCA) Antimieloperoxidasa  y otros (P-ANCA) D.Anticuerpos antifosfolípidos Fosfolípidos Anticardiolipinas Anticoagulante lúpico Reaginas causantes de serología luética falsamente positiva.

16. GRUPOS  AUTOANTICUERPOS  ENFERMEDADES A. Factor reumatoideo  IgM anti IgG  Artritis reumatoidea (AR) a títulos altos / Conectivopatías Vasculitis B. Anticuerpos anti- nucleares Anti ADN nativo  Lupus Eritematoso Sistémico (LES)    Anti Histonas  LES inducido por fármacos / LES / AR / Artritis crónica juvenil   Anti RNP Enfermedad mixta del tejido conectivo (EMTC) / LES   Anti SM LES   Anti RO/SSA Síndrome de Sjögren / LES / Lupus neonatal LES cutáneo subagudo / LES asociado a déficit de Complemento   Anti LA/SSB Síndrome de Sjögren / LES   Anti SCL 70 Esclerodermia difusa   Anti centrómero  Esclerodermia forma CREST   Anti JO 1 Polimiositis (PM) con enf. pulmonar intersticial   Antinucléolo Esclerodermia C. Anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos  C -ANCA P-ANCA Predictivo en Granulomatosis de Wegener (GW) Predictivo en otras vasculitis ANCA positivos D. Anticuerpos Antifosfolípidos Anticoagulante Lúpico Anticardiolipina  Anti U1 RNP Síndrome antifosfolípido primario / LES  EMTC / LES

17. Correlación clínica  de los autoanticuerpos   FACTOR REUMATOIDE (FR ) En general se trata de una IgM anti IgG . Su principal indicación es para diagnóstico de AR . Es un anticuerpo poliespecífico que puede activar el complemento y que puede reaccionar con diferentes determinantes antigénicos del fragmento Fc de la IgG Con neoantígenos formados por la IgG en inmunocomplejos Con antígenos nucleares

18. Se detecta por pruebas:  

19. Las AR seropositivas tienen con mayor frecuencia :

20. Las enfermedades reumáticas con FR usualmente negativo son :

21. ANTICUERPOS ANTIPEPTIDO CITRULINADO Es especialmente importante en la Artritis Reumatoide (AR), en la que se han producido avances significativos en el tratamiento, con mejores resultados dependiendo de la precocidad del diagnóstico. El descubrimiento de los anticuerpos anti- péptido citrulinado cíclico o anti-CCP ha marcado un gran avance en este sentido. Éstos son, a la fecha, los anticuerpos más específicos identificados para AR y la precocidad de su aparición en los enfermos hace hoy en día su uso casi rutinario . Van Venrooij WJ, Zendman AJ, Pruijn GJ. Autoantibodies to citrullinated antigens in ( early ) rheumatoid arthritis . Autoimmun Rev 2006; 6(1):37-41.

22. La citrulinación no es un evento específico de la membrana sinovial, sino que se puede ver en diversos tejidos asociada a inflamación, como en músculos de pacientes con polimiositis , tejido colónico en pacientes con enfermedades inflamatorias intestinales y amígdalas en pacientes con tonsilitis crónica. Caspi D, et al. Synovial fluid levels of anti- cyclic citrullinated peptide anti- bodies and IgA rheumatoid factor in rheumatoid arthritis , psoriatic arthri - tis , and osteoarthritis . Arthritis Rheum 2006; 55(1):53-6. En cambio, es específica la respuesta humoral a la citrulinación, con producción de autoanticuerpos sólo en AR. Estos anticuerpos serían producidos localmente por células plasmáticas contra proteínas citrulinadas de la sinovial inflamada.

23. La citrulinación no es un evento específico de la membrana sinovial, sino que se puede ver en diversos tejidos asociada a inflamación, como en músculos de pacientes con polimiositis, tejido colónico en pacientes con enfermedades inflamatorias intestinales y amígdalas en pacientes con tonsilitis crónica. Caspi D, et al. Synovial fluid levels of anti- cyclic citrullinated peptide anti- bodies and IgA rheumatoid factor in rheumatoid arthritis , psoriatic arthri - tis , and osteoarthritis . Arthritis Rheum 2006; 55(1):53-6. En cambio, es específica la respuesta humoral a la citrulinación, con producción de autoanticuerpos sólo en AR. Estos anticuerpos serían producidos localmente por células plasmáticas contra proteínas citrulinadas de la sinovial inflamada.

24. Estos anticuerpos se pueden encontrar tanto en líquido sinovial como en la sangre; los valores en ambos fluidos se correlacionarían. Se le ha atribuido a la citrulinación un papel patogénico , vinculándola al epítope compartido del HLA. En la presentación antigénica a las células T la presencia de alelos HLA-DRB1 confiere especial susceptibilidad para el desarrollo de la AR.

25. Los resultados se expresan en unidades/mililitro (U/mL), y los valores de corte dependen del kit usado. En aquellos de mayor uso en nuestro país, se considera positivo sobre 25 U/mL y definitivamente positivo sobre 50 U/mL, por lo que el rango entre 25 y 50 U/mL debe ser interpretado por el médico en el contexto clínico del paciente.

26. Las modificaciones postraduccionales (MPT) son cambios químicos que sufren las proteínas después de ser sintetizadas. Una de las MPT es la citrulinación (conversión del residuo arginina a citrulina), la cual es catalizada por la enzima peptidil arginina deiminasa (PAD ). Dentro de los procesos fisiológicos, se incluye la diferenciación terminal de células epiteliales, la regulación en la expresión de genes y la apoptosis; en tanto que en los procesos patológicos, las proteínas citrulinadas se han relacionado con la progresión de la enfermedad en AR, esclerosis múltiple y Alzheimer, entre otros.

27. La conversión de arginina en citrulina es capaz de activar la respuesta inmune. Dicha conversión da como resultado un cambio en la carga del aminoácido. Trabajos posteriores mostraron que tanto la cadena alfa como la beta de la fibrina citrulinada son los antígenos reconocidos por los anticuerpos APC y que están presentes en pacientes con AR.

28. Anticuerpos anti-RA-33 Son anticuerpos que reaccionan de forma específica con la ribonucleoproteína heterogénea nuclear A2 (hnRNP-A2) y sus isoformas (B1 y B2), así como la forma homóloga, A1, del núcleo de las células HeLa . Su presencia en suero, sin la aparición concomitante de anticuerpos anti-U1-RNP o Sm, es altamente específica para la AR.

29. La detección de anticuerpos anti-RA33 se ha propuesto como marcador serológico de AR temprana, con una sensibilidad del 27- 28,6%. Asimismo se ha descrito la pérdida de positividad cuando se alcanza la remisión clínica . También se han descrito en pacientes con LES en su forma erosiva asociados a anticuerpos anti-Sm . En la enfermedad mixta del tejido conectivo se asocian a los anticuerpos anti-U1 RNP.

30. Anticuerpos anti- Sa Sa es una proteína de 48-50 kDa presente en la placenta, el bazo y el tejido sinovial de articulaciones de pacientes con AR . La presencia de anti- cuerpos anti- Sa en pacientes con AR, la sensibilidad de estos anticuerpos en el diagnóstico de la AR llega al 40%, mientras que la especificidad es del 99 %.

31. Un estudio reciente mostró que la presencia de estos anticuerpos en suero se asociaba con una subpoblación de varones con AR y curso agresivo. Sa es un antígeno transportador de haptenos donde la vimentina es el transportador y la citrulina es el hapteno. L a citrulinación de la vimentina está estrechamente relacionada con la apoptosis, dado que la vimentina citrulinada es extremadamente sensible a la digestión por las caspasas, enzimas fundamentales en el proceso de apoptosis. Med Clin ( Barc ) 2003;121(16):619-24

32. ANTICUERPOS ANTINUCLEARES Son un G rupo de autoanticuerpos no especie específicos dirigidos contra componentes del núcleo celular . Los títulos mayores a 1/160 sobre tejido congelado y a 1/640 sobre células Hep-2, suelen verse en pacientes con enfermedades reumáticas sistémicas . Los diferentes autoanticuerpos producen imágenes (patrones de tinción que les son característicos) estos patrones pueden sugerir la presencia de autoanticuerpos específicos que pueden diferenciarse entre sí por patrones de tinción. 

33. Reacción positiva Una muestra es considerada positiva si la imagen nuclear específica observada es mayor que la del control negativo.

34. Patrones de ANA detectados mediante IFI A continuación se describen las características de los patrones que con mayor frecuencia se detectan por IFI en células HEp-2 en sueros de pacientes con enfermedades autoinmunes. García Hernandez JL, et al. Caracterización inmunoquímica de los patrones de inmunofluorescencia (IFI) moteado fino y moteado grueso en pacientes con enfermedades autoinmunes. Reumatol Clin . 2009;5:55.

35. El patrón homogéneo se caracteriza por una tinción homogénea en el núcleo , cuya intensidad puede variar dependiendo de la concentración de los anticuerpos presentes en le suero . La placa de la cromatina en células en división puede estar teñida de manera compacta , delineada o difusa y los nucléolos pueden o no estar teñidos.

36. El patrón periférico se caracteriza por tinción regular alrededor del núcleo ; el centro de este patrón muestra menos tinción. La placa de la cromatina se tiñe de forma delineada o compacta.

37. Los patrones de ANA que se observan con mayor frecuencia son los moteados, tanto fino como grueso. La descripción de estos patrones ha generado confusión , en el sentido de que varios autores definen el patrón moteado grueso como aquel en el que el núcleo se observa teñido con gránulos gruesos y el patrón moteado fino lo definen como núcleo teñido con gránulos finos .

38. E l patrón moteado grueso se debe definir como tinción en el núcleo con gránulos finos o gruesos, los nucleolos están teñidos y la placa de la cromatina en células en división no se tiñe , es decir, no hay reconocimiento de los componentes de la cromatina.

39. E l patrón moteado fino , este se caracteriza por tinción del núcleo con gránulos finos o gruesos, los nucleolos no se tiñen así como tampoco se tiñe la placa de la cromatina en células en división.

40. El patrón centromérico tiene como características que los núcleos se tiñen con puntos finos distribuidos de manera homogénea en el citoplasma de las células en interfase . La tinción en las células en división muestra un punteado fino localizado en la placa de la cromatina.

41. El patrón nucleolar tiene como característica una tinción intensa de los nucleolos . La placa de la cromatina en las c élulas en división se tiñe de manera difusa debido a reactividad cruzada de los anticuerpos dirigidos contra los RNA nucleolares con el ADN de la cromatina.

42. El patrón de la lámina nuclear o laminar es aquel en el que se observa tinción concentrada alrededor del núcleo y no se extiende hacia el citoplasma. A diferencia del patrón periférico , la placa de la cromatina en las células en división es negativa.

43. El patrón centriolar se identifica por la tinción intensa de los centriolos en células en división . Las estructuras teñidas se pueden identificar desde la fase G2, donde se ven dos puntos muy juntos, y en metafase, donde se localizan en los polos de la célula.

44. Cuando se tiñen los centriolos, los filamentos del huso acromático y las células en interfase tienen un patrón moteado fino . El patrón se define como NuMA-1(del inglés , nuclear mitotic apparatus ) B . La tinción de los centriolos y del huso mitótico sin tinción del citoplasma en células en interfase se define como NuMA-2 C .

45. El patrón citoplásmico que se conoce como patrón de filamentos intermedios o de músculo liso y se caracteriza por tinción en forma de hilos en el citoplasma. Un patrón de filamentos intermedios con título mayor a 1:160, se debe interpretar como un resultado positivo para anticuerpos antimusculo liso.

46. Se considera con títulos positivos si éstos son mayores a 1/20. Se informa como positivo o negativo. La presencia de Ac anti ADN nativo se considera como patognomónica de LES. Se detecta en 60 - 70 % de casos. Este porcentaje puede aumentar si se considera sólo en enfermedad activa.  ANTICUERPOS ANTI ADN NATIVO

47. Su presencia se correlaciona con:

48. ANTICUERPOS ANTIHISTONAS Pueden reaccionar con fracciones aisladas del complejo ADN histonas o con el octámero formado por los dímeros H1, H2A, H2B, H3, H4. Son característicos del LES inducido por fármacos en un 90 %. En lupus inducido por procainamida y en lupus espontáneo predominan los anticuerpos dirigidos contra H1 y H2A-H2B y en el lupus inducido por hidralazina suelen reaccionar con H3-H4.

49. Es frecuente la reacción cruzada entre anticuerpos anti-histona y FR. Puede dar positivo en AR y Síndrome de Felty ocasionalmente .

50. ANTI Ku El antígeno correspondiente está formado por dos proteínas ligadas covalentemente formando un heterodímero que une DNA, con un posible papel en la activación transcripcional , replicación del DNA y proliferación celular. Aparece en LES y en las enfermedades musculares.

51. ANTICUERPOS CONTRA ANTÍGENOS NUCLEARES EXTRAIBLES (ENA) Dirigidos contra antigenos nucleares , o sea su blanco son antígenos nucleares no histonas o complejos RNA proteínas: SSA/RO SSB / LA Mi 2 RNP Scl 70 Jo-1

52. ANTICUERPOS ANTI-SM Y ANTI-RNP Los antígenos Sm y RNP están muy relacionados. Pueden diferenciarse mediante digestión enzimática, ya que el Sm es resistente a ARNsa y tripsina y el RNP es sensible.  Están compuestos por ribonucleoproteínas nucleares de pequeño tamaño "SMALL NUCLEAR RIBONUCLEO PROTEIN" (snRNP). Los anticuerpos anti Sm precipitan snRNP que contienen varios tipos de ARN (U1, U2, U4, U5 y U5-ARN ).

53. Reaccionan con una fracción libre del antígeno Sm y con otra asociada al antígeno RNP. Los anticuerpos anti-Sm son específicos en un 99 % para LES y forman parte de los criterios diagnósticos.  Se relacionan con actividad de la enfermedad.  Los anticuerpos anti-RNP se detectan en un 95 -100 % de pacientes con EMTC, pero no son específicos . La Nefropatía es poco frecuente.

54. ANTICUERPOS ANTI SCL - 70 Y ANTICENTRÓMERO El antígeno Scl-70 es una proteína cromosómica identificada como la enzima ADN topoisomerasa 1 . U na enzima nuclear que actúa en el ADN rompiendo transitoriamente el esqueleto fosfodiéster del ADN y recomponiendo los finales del ADN libre . Son específicos para esclerodermia y aparecen en hasta un 40 % en la esclerodermia difusa y en un 10 - 15 % en el síndrome de CREST.  

55. Se asocian con la esclerosis cutánea difusa y con mayor riesgo de fibrosis pulmonar. Estos anti cuerpos dan lugar al patrón nuclear difusamente granular en la IF. La positividad de estos anticuerpos implica un peor curso ( difuso ) de la enfermedad, con afectación cutánea más grave y mayor frecuencia de afección articular y pulmonar.

56. Los anticuerpos anticentrómero reconocen proteínas laminares del cinetocoro cromosómico . Son responsables de un patrón moteado característico en la IFI Se detectan en pacientes con: 

57. ANTICUERPOS ANTI-RO/SSA Y ANTI-LA/SSB Los antígenos Ro/SSA y La/SSB son complejos ribonucleoproteicos de pequeño tamaño que se localizan en el núcleo y en citoplasma ( scRNPs ). Los anticuerpos anti Ro producen IFI nuclear . Los anticuerpos anti La precipitan los mismos ARN y otros de origen humano y vírico. Reconocen una proteína muy susceptible a la degradación proteolítica.

58. Los anticuerpos anti Ro detectan: Síndrome de Sjögren primario (60 - 70 % ) LES (30 - 40 %)  Otras conectivopatías Son característicos del: Lupus neonatal Lesiones cutáneas  Bloqueo cardíaco congénito  En recién nacidos cuya madre presenta  anticuerpos anti Ro. Lupus cutáneo subagudo 

59. Los anticuerpos anti Ro se han asociado a LES con mayor frecuencia de lesiones cutáneas fotosensibles, trombocitopenia, FR y vasculitis cutánea . Los anticuerpos anti La pueden aparecer junto a los anticuerpos anti Ro.

60. ANTICUERPOS ANTI Jo 1 En pacientes con polimiositis se han identificado diferentes anticuerpos: • anti PM1 • anti Mi 1 y 2 • anti Jo 1 La mayoría reconocen enzimas sintetasas t-ARN y se asocian con miositis y enfermedad intersticial pulmonar . Los más frecuentes son los anticuerpos anti-Jo 1, que reconocen una subunidad de la enzima histidil -t ARN sintetasa .

61. Se asocian con una mayor incidencia de:

62. Anticuerpos Antinucleares Anti Mi-2 Está dirigida contra un antígeno nuclear y asociado casi exclusivamente con Dermatomiositis . También se ve este autoanticuerpo en 10% de los pacientes con Dermatomiositis juvenil. Los pacientes con anti Mi-2 suelen tener inicio agudo de la enfermedad y una buena respuesta al tratamiento.

63. Anticuerpos anti-mitocondriales ( AMA) Estos anticuerpos son marcadores de diagnóstico para CBP y están dirigidos contra el complejo enzimático de las 2-oxo-ácido deshidrogenasas. Los AMA en los pacientes con CBP son los anticuerpos con mayor sensibilidad de todas las enfermedades hepáticas y su especificidad para distinguir pacientes con CBP de pacientes con hepatitis autoinmune es de 92 %.

64. Los antígenos blanco son la dihidrolipoamida aciltransferasa (subunidad E2) del complejo enzimático piruvato deshidrogenasa e incluyen las subunidades E2 de la piruvato deshidroge - nasa (PDC-E2), 2-oxo-ácido deshidrogenasa (OADC-E2) y la 2-oxoglutamato deshidrogenasa (OGDC-E2).

65. Algunas consideraciones sugieren que los AMA no son patogénicos , ya que estos auto-anticuerpos presentan reactividad contra las mitocondrias de todos los tejidos y no solo las que se encuentran en el epitelio biliar. Es posible que el estímulo inicial para la producción de anticuerpos, sea una infección que provoque una modificación de los antígenos mitocondriales, lo que podría contribuir a la inducción de la enfermedad. Ed Con Lab Clín 2004;7:44-52

66. Anticuerpos antifibrilina La fibrilina es una proteína básica nucleolar loca- lizada en la ribonucleoproteína U3, un complejo pro- teico involucrado en la síntesis de RNA ribosomal . Los anticuerpos anti- fibrilina se asocian con compromiso cutáneo difuso, hipertensión pulmonar y compromiso del tracto gastrointestinal . Desencadenan también la diferenciación de los fibroblastos con fenotipo normal hacia uno de tipo profibrótico , a través de un mecanismo TGF-β (factor de crecimiento)

67. Anticuerpos Anti-Th Los anticuerpos anti-Th/To, dirigidos directamente contra proteínas nucleolares que interactúan con el RNA, se detectan sólo en el 4% de los pacientes y se asocian con compromiso cutáneo limitado, compromiso pulmonar y gastrointestinal. Sin embargo, éstos no son específicos. Rev. chil. reumatol. 2009; 25(1):17-2

68. ANTICUERPOS ANTICITOPLASMA DE NEUTRÓFILOS (ANCA) Los ANCA fueron definidos mediante IFI como anticuerpos contra estructuras citoplasmáticas de neutrófilos en sueros de pacientes con vasculitis . Los ANCA reaccionan con diferentes proteínas de los gránulos azurófilos del neutrófilo. La IFI sobre neutrófilos fijados con etanol muestra dos patrones fundamentales.

69. Son también ANCA positivos la granulomatosis de Wegener y la poliarteritis nodosa microscópica porque comparten algunos mecanismos patogénicos. La negatividad de los ANCA no excluye ninguno de los diagnósticos. En la granulomatosis de Wegener el patrón es C-ANCA y pueden detectarse en más de un 90 % de pacientes con enfermedad activa. En las formas limitadas el porcentaje de  positivos disminuye a un 60 - 70 %.

70. Estos patrones P-ANCA están dirigidos contra mieloperoxidasa en el 61 % de los casos, pero hay un 39% que presenta patrones C-ANCA . En el 80 % de los pacientes con glomerulonefritis necrotizante segmentaria dentro o fuera del contexto de una vasculitis necrotizante sistémica, se detectan P-ANCA. También la glomerulonefritis necrotizante puede estar asociada a hemorragia pulmonar o síndrome pulmonar-renal .

71. c -Anca : patrón de fluorescencia citoplasmático (clásico). En este caso los anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos muestran un patrón de tinción citoplasmático difuso y granular. El antígeno diana es más frecuentemente la proteinasa 3 ( PR3).

72. P-Anca: patrón de fluorescencia perinuclear (tinción protoplasmática) los anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos muestran un patrón de fluorescencia en forma de anillo, rodeando al núcleo. El antígeno diana es generalmente la mieloperoxidasa (MPO).

73. ANTICUERPOS ANTIFOSFOLÍPIDOS, ANTICOAGULANTE LÚPICO Y ANTICARDIOLIPINAS Son anticuerpos que reaccionan cruzadamente con varios fosfolípidos, como: • fosfatidiletanolamina  • fosfatidilserina  • fosfatidilinositol Son anticuerpos poliespecíficos de clase IgG o IgM que reaccionan cruzadamente con ADN y En el 80 % de los pacientes con glomerulonefritis necrotizante segmentaria dentro o fuera del contexto de una vasculitis necrotizante sistémica, se detectan P-ANCA.

74. Anticoagulante lúpico  Factores capaces de inhibir en vitro las pruebas de coagulación dependientes de fosfolípidos, pero in vivo carecen de efecto anticoagulante. Actúan a nivel del complejo de conversión de protrombina en trombina, inhibiendo la formación de protrombina y trombina . Anticuerpos responsables de falsos positivos en la serología luética   Dirigidos contra antígenos como el VDRL o el RPR. Formados por: lecitina, cardiolipina y colesterol. Anticuerpos anticardiolipinas  Se unen in vitro a fosfolípidos cargados negativamente (fosfatidilserina, fosfatidilglicerol o fodfatidilinositol)

75. Otras enfermedades Autoinmunes  Anemia hemolítica autoinmune  Tiroiditis de Hashimoto  Púrpura trombopénica idiopática. La presencia de anticuerpos antifosfolípidos se debe sospechar ante cualquier falso positivo en la serología de lúes o en presencia de alargamiento en el tiempo de tromboplastina parcial activada por anticoagulante lúpico.

76. Las manifestaciones asociadas a la presencia de anticuerpos antifofolípido son : Trombopenia Trombosis venosas o arteriales Anemia hemolítica Livedo reticularis Migrañas  Úlceras en miembros inferiore Valvulopatías  ACV agudos Abortos recurrentes

77. Este síndrome asociado a la presencia de anticuerpos antifosfolípidos puede aparecer en el curso de LES u otras patologías, pero muchos pacientes con estos anticuerpos no presentan ninguna de las patologías asociadas. En estos casos se habla de síndrome antifosfolípido primario.

78. Criterios diagnósticos para el anticoagulante lúpico : a) Prolongación del tiempo de coagulación in vitro en una prueba fosfolípido dependiente . b) Evidencias negativas usando mezclas con plasma normal: el tiempo de coagulación no se corrige . c) Evidenciar la dependencia de fosfolípidos: el tiempo de coagulación se corrige cuando se agrega al sistema una fuente de fosfolípidos que pueden ser plaquetas o fosfolípidos puros . d) Ausencia de déficit de algún factor de coagulación o de otro inhibidor específico .

79. Principales técnicas dependientes de fosfolípidos que se realizan en el laboratorio: KPTT Tiempo de coagulación con caolín (KCT) Tiempo de veneno de víbora de Rusell diluido ( DRVVT) Los anticuerpos anticardiolipinas se estudian por RIA y ELISA . Estos anticuerpos se dirigen a cardiolipinas puras y hacia un cofactor plasmático, la ß2 glicoproteína I, unido o no a las cardiolipinas . Se deben determinar junto con el anticoagulante lúpico ante la sospecha de síndrome antifofolipídico .

80. Técnicas de detección de autoanticuerpos D.F. Hernández Ramírez , J. Cabiedes / Reumatol Clin . 2010;6(3):173–177174

81. Inmunofluorescencia indirecta La técnica se basa en el reconocimiento de los anticuerpos que reconocen estructuras antigénicas celulares nativas. La interacción se evidencia por medio de un anticuerpo antiinmunoglobulina humana, producido en conejo, cabra o cobayo, dirigido contra las fracciones constantes ( Fc ) de las inmunoglobulinas IgG , IgA y/o IgM .

82. Este anticuerpo antiinmunoglobulina humano está conjugado o acoplado a un fluoróforo (generalmente isotiocianato de fluoresceína [FITC]). Los resultados del reconocimiento de los antígenos por los autoanticuerpos presentes en el suero, plasma o cualquier otro líquido , se evaluán en un microscopio de epifluorescencia . Para la detección de anticuerpos que reconocen antígenos nucleares se utilizan como sustratos líneas celulares epiteliales humanas como las células HEp-2 o las células HeLa .

83. En el caso de los anticuerpos contra componentes de los gránulos primarios y específicos de los polimorfonucleares o anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA), se utilizan neutrófilos fijados con etanol y formalina .

84. Ensayo inmunoenzim á tico Como se mencionó anteriormente, el ELISA es una de las técnicas más utilizadas para identificar o confirmar la especificidad de los anticuerpos presentes en las muestras de los pacientes con enfermedades autoinmunes. Si bien existen diferentes tipos de ELISA, el más utilizado en el laboratorio de diagnóstico de autoinmunidad es el ELISA indirecto .

85. El cual se fundamenta en el reconocimiento de los anticuerpos específicos presentes en las muestras de los pacientes, mediante un anti- cuerpo dirigido contra la región Fc humana de cualquier isotipo ( IgG , IgA o IgM ) e inclusive de cualquier subclase (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 o IgA2). Los anticuerpos anti- Fc están unidos a enzimas como la peroxidasa o la fosfatasa alcalina.

86. Los antígenos utilizados en las placas de ELISA pueden ser nativos, recombinantes ( antígeno completo o epítopo específico ) o sintéticos ( epítopo específico ). Después de permitir la interacción de los anticuerpos de las muestras de los pacientes con el antígeno pegado a la placa de ELISA

87. Se realizan lavados para eliminar los anticuerpos inespecíficos y se agrega el anticuerpo antiinmuno globulina humana unido a enzima, permitiendo la interacción por un tiempo determinado . Posteriormente, se adiciona la solución que contiene el sustrato cromogénico específico de la enzima ( Tetrametilbenzidina [TMB] para la peroxidasa o p- nitrofenilfosfato para la fosfatasa alcalina) el cual cambiará de color en función de la cantidad de anticuerpos conjugados con la enzima y cuya cantidad depende de los anticuerpos del paciente que reconocieron al antígeno pegado a la placa.

88. L a intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo del paciente unido al antígeno. Engvall E, Perlman P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantita - tive assay of immunoglobulin . G Immunochem . 1971;8:871–4.

89. Electroinmunotrasferencia La EIT, junto con el ELISA son las técnicas de mayor sensibilidad y especificidad para la detección de anticuerpos contra antígenos específicos . Se fundamenta en el reconocimiento de anticuerpos que tienen especificidad por antígenos que se absorben en una membrana (de nitrocelulosa o nylon ).

90. Los antígenos adsorbidos en la membrana fueron previamente separados en geles de poliacrilamida- dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) y transferidos a las membranas . La unión de los anticuerpos a los antígenos específicos se detecta mediante la adición de un anticuerpo que reconoce la región Fc de las inmunoglobulinas humanas, el cual está acoplado a una enzima (fosfatasa alcalina o peroxidasa ).

91. La unión se revela con la adición de un sustrato- cromogénico soluble (alfa-naftol/ Fast red o NBT/ BCIP [cloruro de azul de tretrasodio /sal de toluidina de 5-bromo-4- cloro-3-indolfosfato], para cada enzima, respectivamente) el cual se precipita en el sitio en donde se encuentra el complejo antígeno- anticuerpo por la acción de la enzima. Neal W. Western blotting : electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radio- graphic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem . 1981;112:195–203.

92. NEFELOMETRÍA Nefelometría deriva del griego Nephele , significa nube o neblina. Se define como la detección de la energía lumínica dispersa o reflejada hacia un detector que no se encuentra en el camino directo del haz luminoso . Las mediciones se realizan en un determinado ángulo en relación con dicho haz. La intensidad de luz dispersa en un determinado ángulo está en función de la longitud de onda del rayo incidente, del tamaño y forma de las partículas.

93. La formación de inmunocomplejos se ha relacionado con la cuantía de dicha dispersión y se ha empleado como fundamento para cuantificar antígenos . La nefelometría tiene aplicación para la determinación de fracciones del complemento, inmunoglobulinas, transferrina , haptoglobina , cadenas kappa y lambda, albúmina, pre-albúmina, proteína C reactiva, factor reumatoide, alfa 2 macroglobulina y otras proteínas.

94. GRACIAS!!!