模拟自然进化过程，在试管中通过基因多样化+筛选/选择的迭代循环优化生物分子功能directevolution.pptx

生物方向：定向进化

1. 定向进化：方法与应用综述 作者单位 ：美国 · 伊利诺伊大学香槟分校 出版期刊 ： Chemical Reviews 影响因子 ： IF 2020 =72.087 出版时间 ： 2021.07.23 1 、 ​ ​定义与原理​ ​ 模拟自然进化过程，在试管中通过基因多样化 + 筛选 / 选择的迭代循环优化生物分子功能（图 1 ）。 核心目标：加速进化速率（突变率高于自然进化），实现蛋白质、核酸、代谢通路等的人工优化。 1

2. 2 、 ​ ​发展历程 ​基础工具阶段（ 1967-1990s ）​ ​： RNA 体外进化（ 1967 ）→ 噬菌体展示（ 1985 ）→ DNA 改组（ 1994 ）→ 酵母展示（ 1997 ）。 特点：聚焦高通量筛选平台构建。 工程化突破阶段（ 2000s ）​ ​： 首个酶进化（ 1993 ）→ 非天然氨基酸引入（ 2003 ）→ 正交核糖体系统（ 2007 ）。 特点：拓展至非天然生物催化体系。 智能化革命阶段（ 2010s- 至今）​ ​： PACE 连续进化（ 2011 ）→ CRISPR 全基因组扰动（ 2016 ）→ AI 突变预测（ 2020 ）。 特点：实验自动化与计算设计深度融合。 2

3. 方法论体系 体外方法​ ​ ​ ​随机诱变​ ​：易错 PCR （ epPCR ）、序列饱和诱变（ SeSaM ）（图 3A ） ​ ​定点诱变​ ​：位点饱和突变（ SSM ）、迭代饱和突变（ ISM ）（图 3B ） ​ ​重组技术​ ​： DNA 改组（ DNA shuffling ）、非依赖同源重组（ ITCHY/SHIPREC ）（图 3C ）。 1 、 ​ ​ 基因多样化策略 3

4. 方法论体系 体内方法​ ​ 正交系统 ​​： T7 RNAP 突变系统、 OrthoRep 酵母质粒系统（图 5A ） ​ ​重组工程​ ​： MAGE （细菌）、 SCRaMbLE （酵母合成基因组）（图 5B ） ​ ​ CRISPR 工具​ ​： HDR 基因编辑、碱基编辑器（ dCas9-deaminase ）、 EvolvR 随机突变（图 6 ）。 1 、 ​ ​ 基因多样化策略 4

5. 1 、 ​ ​ 基因多样化策略 ​ ​ 计算辅助设计​ ​ 序列分析工具（ SIFT/PANTHER ） 结构模拟工具（ CAVER/ CASTp ） 机器学习模型（预测突变效应、优化文库设计（图 7 ）。 5

6. 2 、 ​ ​ 筛选与选择技术​ 选择法​ ​（高通量） 展示技术：噬菌体 / 酵母展示（图 9 ）。 区室化：体内生长互补、体外微液滴分选 SELEX ：核酸适配体筛选（图 11 ）。 6

7. 2 、 ​ ​ 筛选与选择技术​ 筛选法​ ​（精确分析） FACS ：荧光激活细胞分选（图 12 ） 微孔板检测：显色 / 荧光底物（图 13 ） 质谱技术： MALDI-TOF MS （图 14 ） 微流控：单液滴反应监测（图 15 ）。 7

8. 3 、 ​ ​ 连续进化系统​ 体外连续进化​ ​：核酶自复制模型（如 RNA 连接酶）。 ​ ​体内连续进化​ ​： PACE （噬菌体辅助）：将蛋白活性与噬菌体增殖偶联（图 16 ） 自动化平台（如 eVOLVER ）：实时调控选择压力。 8

9. AI 赋能定向进化​​ 1 、突破序列空间限制：预测高阶突变组合 传统定向进化局限性：序列空间探索有限（仅 0.0001% ）、上位效应、高阶突变检测难 机器学习预测全局最优序列，突破实验通量限制（图 3 ） AI 覆盖文库设计→筛选→迭代的闭环 9

10. 2 、 蛋白语言模型革命​ PLM 核心能力：从 10 亿 + 序列无监督学习结构 / 功能规律 代表性模型： ESM-3 （ 98B 参数，例图）、 ProtGPT2 、 Ankh 多模态数据融合提升预测精度 10

11. 11 从自然进化策略中学习可以指导人工进化，通用蛋白质语言模型可以通过提示进化上 合理的突变 来有效地进化人类抗体。 对 七种抗体 进行了语言模型引导的亲和力成熟，仅在 两轮进化 中筛选了每种抗体的 20 个 或更少的变体，并将四种临床相关的 高度成熟 抗体的结合亲和力提高了 7 倍，将三种 未成熟 抗体的结合亲和力提高了 160 倍

12. 通用蛋白质语言模型指导定向进化 可行性 基于进化适应度识别合理的突变可能有助于引导进化远离无效制度，从而间接提高进化效率，而无需对感兴趣的功能有任何明确的了解 蛋白质语言模型，经过数百万个天然蛋白质序列的训练，学习自然界中可能看到的氨基酸模式。假设大多数具有高语言模型可能性的突变在进化上也是合理的，没有特定选择压力信息的语言模型仍然可以有效地指导进化。 12 通用蛋白质语言模型指导定向进化 挑战 一般进化信息（从过去进化的序列变异中学习模式）是否足以在特定选择压力下实现有效进化 意义：在实验室中，亲和力成熟是定向进化的主要应用，因为对疾病靶标具有高亲和力的抗体具有治疗潜力。 模型仅负责 “推荐进化上合理的突变”，但突变是否真的能提升功能、是否符合 “定向进化” 的目标，需要依赖实验验证

13. 疑惑 为什么 在实验室中使用相同的方法进行蛋白质的定向进化负担重 ? 自然进化是 “无明确目标、超大种群、漫长时间” 的被动筛选，而实验室定向进化是 “有明确目标（如提高酶活性、增强稳定性）、有限资源、短期周期” 的主动改造，这种差异导致从突变效率、筛选难度到资源消耗均面临巨大挑战。 什么是蛋白质进化中的进化适应度？ 蛋白质实现其生物学功能（或人工设计目标）的能力，以及维持这种能力的稳定性 。 （酶：催化效率 + 热稳定性 + 底物特异性；结合类：结合亲和力 + 结合特异性 + 结合稳定性；结构类：机械强度 + 折叠正确性 + 相互作用能力） 13

14. 14 EVOLVEpro ，一种结合 蛋白质语言模型 与 少样本主动学习 的蛋白质工程方法，通过顶层随机森林回归模型学习蛋白质 “序列 - 活性” 关系，仅需每轮 10-20 个实验数据即可迭代优化。

15. Method 15 采用 ESM-2 15B 蛋白质语言模型，基于 2 亿 + 蛋白质序列训练 选用 随机森林回归器 ，学习嵌入向量与实验测得活性的映射关系 少样本主动学习 ，每轮流程为：模型推荐候选变体→实验检测活性→更新模型→下一轮优化

16. Method 16 采用 ESM-2 15B 蛋白质语言模型，基于 2 亿 + 蛋白质序列训练 选用 随机森林回归器 ，学习嵌入向量与实验测得活性的映射关系 少样本主动学习 ，每轮流程为：模型推荐候选变体→实验检测活性→更新模型→下一轮优化

17. 基准实验 17 数据集 ： 12 个深度突变扫描（ DMS ）数据集，覆盖 5 类功能（病毒刺突蛋白、 RNA 引导核酸酶、 DNA 结合蛋白、 RNA 结合蛋白、激酶），确保模型通用性； 对比对象 ：零样本 PLM 方法（ ESM-2 ）、传统序列编码（ one-hot 编码、 integer 编码）、其他回归模型（高斯过程、 KNN ）、 UniRep （循环神经网络）、其他生成式模型（ ProtT5/ ProteinBERT /Ankh ）。

18. 3 、 起始序列智能设计​ 传统：依赖野生型序列 → AI ：生成多样性功能序列 EvoAI （图 a ）设计 GFP 变体 使用 AI 设计新型催化酶 18

19. 4 、 文库构建优化策略​ 主动学习：优先探索模型不确定区域 熵采样：平衡功能强度与序列多样性 传统方法 易错 PCR​ ​：随机突变引入方式； ​​ Golden Gate 组装​​：模块化精准连接； ​​达尔文组装法​​：一步法构建多样性文库 ​ AI 方法 ​ ​： ​​主动学习与熵采样逻辑​​ 19

20. 5 、 功能预测与虚拟筛选​ 从间接指标（荧光强度）→ 直接预测功能（结合能 / 活性） 模型：高斯过程回归、神经网络、 ECNet ​ ​ ECNet （ Evolutionary Context-integrated Neural Network ）作为一种整合局部与全局进化信息的深度学习框架，在蛋白质功能预测与虚拟筛选中展现出显著优势 20

21. 研究背景 ω- 转氨酶（ ω-transaminase ）是一类重要的生物催化酶，可将氨基从供体转移到受体羰基化合物上，用于合成手性胺等有价值的化合物。由于天然 ω-transaminase 对某些非天然底物远低于其天然底物的活性，限制了 ω-transaminase 在合成手性胺药物中间体方面的直接应用。 通过定向进化或理性设计对酶进行改造，可以拓宽酶的底物谱并提高催化效率，使酶能够高效催化这些非天然底物。 技术路线 基于 ESM 蛋白质语言大模型的 ω- 转氨酶定向改造 21