Протокол Genemedi-AdV. pdf

Протокол Genemedi-AdV.pdf

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2. 1
Recombinantadenovirus(rAdV)isareplication-defectiveadenoviralvector,whichiswidelyusedforavarietyof
purposesincludinggenetransferandengineering,vaccinationandgenetherapy[1,2].Thereareseveraladvantages
ofusingrAdVasagenetransfermediator.Firstly,itcandeliveraslargeas8kilo-base(kb)genesequencesinto
cellsandtissueswithoutinsertionofexogenousfragmentinthegenome.Secondly,almostallthedividingandnon-
dividingcells,primarycellsandorgantissuescanbetransducedbyrAdV.Moreover,rAdViseasytooperateand
expandintolarge-scale,andtheefficiencycanreachupto100%.Thus,rAdVplaysanimportantroleingene
engineeringresearchandpotentialtherapeutictreatmentofdiseases.
Themostcommonlyusedadenovirusisserotype5(Ad5)ofHomoSapiensconsistingofadouble-strandedlinear
DNAmoleculeatabout36kbinsize1.Thecytoplasmicmembranereceptorsandfibersfacilitateendocytosisof
adenovirusintocellcytoplasm,wherevirusparticlesfurthermigrateintocellnucleusforself-replicationusing
replicationmachineryofthehost[3].Oncereplicated,thevirusgenomeisassembledintoitsproteinshelland
releasedfromcells,causingcelllysis[3].
Nowadays,severalpackagingsystemsofrAdVaredeveloped,inwhichAdEasy1andAdMAX2arethetwomost
popularones,sharingacommonstrategythattargetgenesequenceisclonedintoashuttlevector,thenrecombined
intoaviralbackbonevector.Earlyviraltranscriptionunits,E1andE3,aredefectedinbothofthesetwosystems,
whileE3geneisnotnecessaryforvirusreplication1.Thus,packagingofrAdVisusuallyconductedincelllines
expressingE1gene,suchasHEK-293,HEK-293Aetc.[2].
IncomparisonwithAdEasy,AdMAXsystemisrelativelyeasytohandleandcanachievehighervirustiterduring
virusproduction.ThisrAdVprotocolisdevelopedaccordingtoAdMAXsystem,usingatwo-vectorsystem
composedofapAdshuttlevectorandarAdVbackbonevectorpBHGlox(delta)E1-3cre.
ProtocolOvervie
Adenovirus (AdV)
Introduction of Recombinant Adenovirus (rAdV)
w
AschematicoverviewofrecombinantAdVproductionisshowninFigure1.Thefirststepistoclonethegeneof
interest(GOI)intoanappropriateplasmidvector.Formostapplications,thecDNAofinterestisclonedintooneof
therAdVshuttlevectors.Theinvertedterminalrepeat(ITR)sequencespresentinthesevectorsprovideallofthecis-
actingelementsnecessaryforrAdVreplicationandpackaging.
Therecombinantexpressionplasmidisco-transfectedintothe293Acells(anE1-complementingcellline)with
packagingplasmidpAd-BHGlox(delta)E1,E3,whichtogethersupplyallofthetrans-actingfactorsrequiredforAdV
replicationandpackaging.
Smallplaquescanbevisualizedundermicroscope10to21dayspost-transfection.Pickthreetosixindividual
plaquesandcomparetheirvirustiter,thenselecttheonewithhighesttitertoproceededsubsequentamplification,
concentrationandpurificationexperiments.GeneMedi

3. 2
Figure1.AdVpackagingexperimentflowchart.
ExperimentalMaterials
VirusPackagingSystem
Atwo-plasmidsystemisusedforpackagingrecombinantadenovirus(rAdV)inthisprotocol,whichincludesa
shuttlevector(pAd)thatcanbeclonedintoengineeringsequencesforgeneoverexpression,RNAinterferenceand
CRISPR/Cas9geneknockouts,andanadenoviralbackbonevector(pBHGlox(delta)E1,3Cre).Formore
informationregardinghowtochoosetherightshuttlevectorfordifferentexperimentalpurpose,pleaseconsultour
AdVUserManual.
BacteriumStrain
E.colistrainDH5ɑisusedforamplificationofshuttleandbackbonevectors.GeneMedi

4. 3
PackagingCellLine
293Aistheviruspackagingcelllinethatcanfacilitateinitialproduction,amplificationandtiterdeterminationof
rAdV.Itisanadherent,epithelial-likecelllineexpressingE1proteinsrequiredforadenovirusreplication,andgrows
intoamonolayerwhenconfluent.Originatedfromthe293celllineandestablishedforplaqueassays,thiscellline
wasidentifiedtobeaneasy-to-handletransfectionhost.
Thecompletegrowthmediumof293AisDulbecco'sModifiedEagleMedium(DMEM)supplementedwith10%
FetalBovineSerum(FBS)and1%Penicillin-Streptomycin(Pen-Strep).Foracontinuousculture,cellsshouldnot
exceed70%confluencetomaintainpropercharacteristics.Usually,startingfromcellpassagenumberone,optimal
resultscanbeobtainedwithin30passages.Oncereached,itisbesttostartanewculturefromanotherfrozenstock
incaseofanyunexpectedmutationsandunhealthygrowth.Therefore,bankingyourown293Afrozenstocksisvery
importanttoensureexperimentalintegrityandcontinuity.Freezingcellsatthelogarithmicphasewillimprovepost-
thawviability.
Notices:
Ifthecelllineiscontaminatedbymycoplasma,toreachabetterculturedcellstate,werecommendtheuseof
Genemedianti-mycoplasmareagentCurePlasma
TM
.
PackagingCellLine
Geneofinterest
LBbroth
AgarandAgarose
Kanamycin
Ampicillin
70and100%ethanol
SterilePBS
Cesiumchloride(CsCl)
Chlorinebleach
DNAgelapparatusandpowersupplies
ClassIIBiosafetyCabinet
37℃orbitalshaker
37℃bacteriaincubator
37℃,5%CO2incubator
15-and50-mlconicaltubes
25-and75-cm
2
tissuecultureflasks
Cellscrapers
Dry-ice/methanolbath
Liquidnitrogentank
Ultracentrifuge(Beckman)orequivalentwithSW28rotor
Low-speedswinging-bucketcentrifuge
Microcentrifuge
Centrifugetube(thick-wallpolycarbonatetubewithcap)
Ringstandandclamp,3-mlsyringesand18-GneedlesGeneMedi

5. 4
PackagingandConcentrationofAdV
VectorConstructionofAdV
BeforerAdVpackaging,geneofinterestshouldbeconstructedintorAdVshuttlevector.Genemedialsoprovides
variousAdVvectorswithalternativepromotersandfluorescentlabels(table1).What’smore,Genemedihasplenty
ofpremadeAdVvectorgoodscarryingsomegenetictoolsinstock,suchasadenovirus-LC3autophagyflux
detectionbiosensors,etc.
Note:
Inordertoconstructvectorsquicklyandefficiently,itisstronglyrecommendedtouseGenemedi-ClonEasy
TM
One
StepCloningKit（Cat.GM-GC-01/02/03）.
TransfectionofVirusPlasmidsinto293APackagingCells
a.293Acellcultureshouldbepreparedatleastadayaheadtoreachaconfluenceof50%-70%monolayer
morphologypriortotransfection.
b.Onthedayoftransfection,DMEMneedstobepre-warmedin37℃waterbathandLipoGene
TM
transfection
reagentshouldbeequilibratedtoroomtemperatureandtappedtomixbeforeuse.
c.Toprepareviralplasmidsforeachreactionusinga60-mmdish:
Table1.Plasmidandtransfectionreagentrequiredfortransfection.
Component Amount
pAdshuttleplasmid 2μg
pGlox(delta)E1,3Cre 4μg
LipoGene
TM
30l
d.MixplasmidswithtransfectionreagentinDMEMandadddrop-wisetopre-seeded293Acells.Incubatein37℃,
5%CO2andrefreshwithcompleteculturemediumin6hours.
Note:
1.AdetailedprotocolofthetransfectionreagentcanbereferredtoGenemediLipoGene
TM
TransfectionReagent
UserManual.
2.Cellsshouldbeinahealthygrowthstateforusepriortotransfection.
PlaqueFormationandCellCollection
Plaqueisanareaofmonolayercellsthatdisplayacytopathiceffectwheninfectedbyadenoviruses,usuallyobserved
asround,darkercellsorwhitespotswithmicroscopeornakedeyes(Figure1).ItisimportanttoobserveviralGeneMedi

6. 5
plaquesbeforecollectingthetransfectedcells.
a.Tominimizethespreadingofvirusforabetterconditionofvirusplaqueformation,low-melting-pointagaroseis
suggestedtobeaddedinregularmediumwithafinalconcentrationof1.25%.
b.Smallplaquescanbevisualizedundermicroscope10to21dayspost-transfection.Iftheengineeringsequence
intheshuttleplasmidcarriesfluorescenttags(GFPorRFP),thetransfectionefficiencycanbeestimatedwith
fluorescencemicroscopybeforeproductionofplaques.
c.Pickanisolatedviralplaquetogetherwithsurroundingagarose,andtransferinto1mlfreshmediumand
incubateovernight.Ingeneral,threetosixplaquesshouldbepickedtocomparetheirvirustiter,thentheone
withhighesttiterwillbeproceededintosubsequentexperiments.
Figure1.Identificationofaplaque.
Note:
Astocksolutionofhigh-puritylow-melting-pointagarosecanbepreparedinsterilePBStoafinalconcentrationof
5%.Beforeuse,meltthestockcompletelyinboilingwaterbath,andgraduallycooldownto45℃inroom
temperature.Dilutetheagarosestocksolutionusingpre-warmed37℃completegrowthmediatoafinal
concentrationof1.25%.Immediatelyandgentlyaddthewell-mixedsolutiontocellswithculturingmediumremoved
ahead,androtatetoevenlycoveringtheplaquecells.Fora6-wellplate,add3mlagarose/mediumperwell.
Itisimportanttoobserveviralplaquesbeforecollectingthetransfectedcells.Tominimizethespreadingofvirusfor
abetterconditionofvirusplaqueformation,low-melting-pointagaroseissuggestedtobeaddedinregularmedium,
andsmallplaquescanbevisualizedundermicroscope10to21dayspost-transfection.Iftheengineeringsequence
intheshuttleplasmidcarriesfluorescenttags(GFPorRFP),thetransfectionefficiencycanbeestimatedwith
fluorescencemicroscopybeforeproductionofplaques.
VirusAmplification
a.Onthenextday,addvirus-containingsupernatantintofresh,pre-seeded293Acellstoamplifyvirus.
b.Collectcellsandsupernatantwhenobservingformationofplaques,andproceedintoafreeze-thawcyclefor3
timesbeforecollectingallviruses.GeneMedi

7. 6
c.Thecollectedvirusisrecognizedaspassage1(P1virus).Then,infectfresh293AcellswithP1virus.
d.Performinfection-collectioncycleforthreetimestillP4virusisobtained,andexpandvirusproductioninto
large-scalethroughP4virusinfection.Whenformationofplaquesisobserved,virusesarecollectedfor
purificationandconcentration.
Note:
1.Useacellscraperinsteadoftrypsinizationtodetachcells.Collectedcellsshouldbecentrifugedat500g,4℃
for10min.Discardthemostsupernatantandleave2mltoresuspendthecellpellet,transfertoacontainerat
lowerthan-80℃(usingdryiceorliquidnitrogen)forfreezingandthawing.
2.Immediatelyremovefromthe37℃bathwhenthevirussuspensionmeltscompletelyincaseofanydecreaseof
thevirustiter.Shakethecompletelymeltedsuspensionheavilyfor30seconds.Usually,twotofourroundsof
freeze-thawcyclecanimprovetheyieldofviruseswithhightiter.
3.Afterfreeze-thawcycles,viruslysatecanbecentrifugedat500g,4℃for10mintoremovecelldebris,and
storedat-80℃forlateruse.
VirusPurification
ThepurificationprocessofrAdViscomposedofthreesteps:PEG8000condensation,CsCldensitygradient
centrifugationanddialysis.Thedetailedoperationprocessisasfollowing:
a.Thaw:Takethevirusoutfrom-80centigradeonedayinadvance,andmeltinwaterbathatroomtemperature.
Centrifugeat7000g,4℃for10minandcollectsupernatant.
b.PEG8000condensation:Add50mlPEG8000solution(20%PEG8000inultra-purewaterwith2.5MNaCl)per
100mlsupernatant,placingonicefor1hourtopull-downviruses(Timeforincubationonicecanberelatively
extended).Centrifugethemixturefor20minat7000g,4℃,discardthesupernatantandresuspendviruspellet
in10mlCsClsolutionatdensityof1.10g/ml(solventofCsClis20mMTris-HCl,pH8.0,pleaseseethe
followingCsClsolutionpreparationmethodintable2).Thevirus-containingCsClsolutionshouldbepink
(Figure2).
Table2.CsClsolutionpreparation.
Densityat20
℃
(g/ml)Concentration(ml/ml)AmountofCsCl(g)FinalVolume(ml)
1.40 548.3 5.483 10
1.30 402.4 4.024 10
1.20 143.8 1.438 10
c.CsCldensitygradientcentrifugation:Place2mlof1.40g/mlCsClsolutiononthebottomofacentrifugetube,
nextadd3mlof1.30g/mlCsClsolutionslowlyontopofthefirstlayer,thenadd5mlvirussuspension.
CentrifugewithBeckmanSW28rotorat26,000rpm,4℃for2hours.GeneMedi

8. 7
Figure2.CsCldensitygradientcentrifugationprocess.
Leftpanel:CsClgradientbeforeultracentrifugation.
Rightpanel:CsClgradientafterultracentrifugation.
d.Viruscollection:Collectvirusbandbetween1.30g/mland1.40g/mllayerswithasyringe,transferintodialysis
bag.
Note:
Thedialysisbagshouldbeboiledin10mMEDTA-Na2for10min,cooldowntoroomtemperaturebeforeuse.
e.Dialysis:Putthedialysisbagcontainingvirusindialysisbuffer(50gsucrose,10ml1MTris-HCl,PH8.0,2ml
1MMgCl2,topupto1Lbydistilledwater),andstirat4℃overnight.Replacewithfreshbufferonceduring
dialysis.
f.Formulation:Collectvirusfromthebag,adjustvolumeto500µlwithPBS,anddeterminethetiter.Purified
rAdVshouldbekeptin4℃fornomorethanaweekorin-80℃forlongtimestorage.
TitrationofPurifiedrAdV
ThetiterdeterminationmethodofrAdVisplaqueassay.Plaque-formingunit(PFU)isthenumberofplaques
inducedbycertainvolumeofviruses,representingtheconcentrationofactiveviralparticles.
PlaqueassayofrAdV:
a.Plate293Acellsin60-mmdishesatleastonedayinadvance.
b.Whencellconfluencereachesapprox.100%,adddilutedvirusatdifferentconcentrationsandincubatedat37℃.
c.4to8hourspostinfection,covercellswith8mllow-melting-pointagarosesolution(10%FBS,1.25%agarose).GeneMedi

9. 8
d.CalculatethetiterofrAdVbycountingnumberofplaquesin9-11daysofculturing.
Note:
TiterofrAdVcanalsobedeterminedbyobservingfluorescencewhenapplicable,orthroughthemethodofWestern
blotting(WB),immunofluorescence(IF)andimmunohistochemistry(IHC)detectiononexpressionleveloftarget
genes.
TransductionofTargetCells
ForthereasonthatMOIvariesindifferentcelllines,preliminaryexperimentisnecessarytoensureaproperMOIof
targetcellsbeforeconductingformalexperiments.
Note:
MOI:multiplicityofinfection,isthenumberofviralparticlestoinfectonecell.AnoptimizationtestofMOIis
stronglyrecommendedastherealMOItocertaincellsmaybeaffectedbytheoperationsandmethodsofdealing
withvirusesindifferentlabs.
CellPreparation
Platerobusttargetcellsinto24-wellplatesatadensityof1x10
5
/ml.
Note:
Thenumberofplantedcellsdependsonthegrowthrateoftherelevantcellline.50%to70%confluenceshouldbe
reachedonthefollowingday.
MOITestofrAdV
Preparethevirusin10-folddilutiongradient,andensuretheMOIiswithinarangeof3to1000.
Day0:Platetargetcellsingoodconditionatadensityof1x10
5
/mlinto96-wellplates,100µlperwell.Incubateat
37℃overnight.
Day1:Preparevirusinasix-MOIgradient,anddiluteproperamountofvirussuspensionincompleteculture
mediumoftargetcelltoafinalvolumeof100µl(settingMOI=3,10,30,100,300,1000).Adddilutedvirusesto
pre-seededcellsandincubatefor4to8hoursat37℃,thenrefreshthemediumtoremoveviruses.
Day3:Detectfluorescencewithamicroscope.CalculateMOIbasedontheratiooffluorescentcells.
Note:
Ifthevirusisnotfluorescence-labeled,MOIcanbedeterminedbyqPCR,WB,IF,IHC,etc.GeneMedi

10. 9
Transduction
Preparethevirusin10-folddilutiongradient,andensuretheMOIiswithinarangeof3to1000.
a.Foradherentcells:
rAdVscontainingtargetgeneandsameamountofcontrolvirusesshouldbeaddedseparatelyintotwogroupsof
cellsandmixedwell.Theamountsofvirusestobeusedarebasedonsizeofcontainerdescribedinthefollowing
table.ForMOItestinmostcelltypes,agradientof3,10,30,100,300to1000atthreereplicateswouldbesufficient
enough.Refreshmediumin4to8hours.Proteinofinterestscanbedetectedwithin48-72hourswithfluorescence
microscopy,WB,etc.
Table3.Virusesamountsindifferentcontainersize.
SizeofContainer SurfaceArea(cm
2
)VolumeofMediumVolumeofViruses
96-well 0.3 100µl 0.1-0.5µl
24-well 2 500µl 1-3µl
12-well 4 1ml 2-5µl
6-well 10 2ml 5-20µl
Forexample:IfthetierofrAdVis5×10
11
PFU/ml,diluteto5×10
10
PFU/ml(10-fold)withcompletegrowth
mediumoftargetcells.Whenthereare1×10
5
cellsinonewell,andtheMOIis1,000,requiredvolumeofdiluted
virus(5×10
10
PFU/ml)shouldbe(cellnumber)×(MOI)÷(PFU/mlofrAdV)=1×10
5
×1,000/5×10
10
(ml)=2
µl.Thus,2ulofdilutedvirusshouldbeaddedintothiswell.
Note:
ThewasteshouldbedisposedfollowingproceduresdescribedinBiosafetyRequirementsSection.
b.Forsuspensioncells:
Spininfectionisasufficientwaytotransducesuspensionorsemi-suspensioncells.Inbrief,sealthecellcultureplate
byparafilmafteraddingviruses,spininalow-speedswinging-bucketcentrifugeat200gfor1hourat37℃,and
culturecellsat37℃overnight.Mediumshouldberefreshedthenextday.
Iftheconditionisnotallowedforspininfection,acentrifugetubecanbeusedinsteadbytransferringcellsintoa
tubeandcentrifugeatlow-speed.Discardmostofthesupernatantaftercentrifugation,addviruses,andincubateat
roomtemperaturefor15-30min.Thentransferthecell-virusmixtureintoapropercontainer,andcultureat37℃
overnight.Mediumshouldbereplacedthenextday.
DetermineTransductionEfficiency
48to72hourspost-transduction,fluorescentproteinscanbeobservedwhenapplicable,andthealterationoftarget
genecanbeanalyzedatmRNA-levelbyqPCRoratprotein-levelbyWesternblot(WB).GeneMedi

11. 10
SafeUseofAdenovirus(AdV)
1.AdVrelatedexperimentsshouldbeconductedinbiosafetylevel2facilities(BL-2level).
2.Pleaseequipwithlabcoat,mask,glovescompletely,andtryyourbesttoavoidexposinghandandarm.
3.Becarefulofsplashingvirussuspension.Ifbiosafetycabinetiscontaminatedwithvirusduringoperation,scrub
thetable-boardwithsolutioncomprising70%alcoholand1%SDSimmediately.Alltips,tubes,cultureplates,
mediumcontactingvirusmustbesoakedinchlorine-containingdisinfectantbeforedisposal.
4.Ifcentrifugingisrequired,acentrifugetubeshouldbetightlysealed.Sealthetubewithparafilmbefore
centrifugingifconditionallowed.
5.AdVrelatedanimalexperimentsshouldalsobeconductedinBL-2level.
6.AdVassociatedwastematerialsneedtobespeciallycollectedandautoclavedbeforedisposal.
7.Washhandswithsanitizerafterexperiment.
StorageandDilutionofAdV
StorageofAdV
Viruscanbestoredat4°Cforashorttime(lessthanaweek)beforeusingafterreception.SinceAdVvirusesare
sensitivetofreeze-thawingandthetiterdropswithrepeatedfreeze-thawing,aliquotviralstockshouldbestoredat-
80°Cfreezerimmediatelyuponarrivalforlong-termusage.Whilevirustiterredetectionissuggestedbeforeusingif
theAdVviruseshavebeenstoredformorethan12months.
Note:1.Repeatedfreeze-thawcyclesmustbeavoidedincaseofadownsideeffectonvirustiter(foreachfreeze-
thawcycle,therewouldbea10%-50%decrease).GenemediwillproviderAdVproductsinsmallaliquots(200
µl/tube)thatcanbedirectlystoredin-80centigradeformultipleusage.
2.Forvirusesstoredmorethan6months,itissuggestivetore-analyzevirustiterbeforeuse.
DilutionofAdV
ToproperlythawrAdVfrozenaliquots,transfervirusesfrom-80℃freezertoanice-waterbathtillcompletely
melted.Whenmelted,addproperamountofsterilePBSorserum-freeculturemedium,andkeepin4℃fornomore
thanaweek.
Precautions
·AvoidAdVexposuretoenvironmentalextremes(pH,chelatingagentslikeEDTA,temperature,organicsolvents,GeneMedi

12. 11
proteindenaturants,strongdetergents,etc.)
·AvoidintroducingairintotheAdVsamplesduringvortexing,blowingbubblesorsimilaroperations,whichmay
resultinproteindenaturation.
·Avoidrepeatedfreezingandthawing.
·Avoidexposingto“regular”plastics(especiallypolystyreneorhydrophobicplastics)forprolongedperiodsin
liquidphase.MostAdVvirusesareverystickyandlosscanoccurifexposedtoregularplastics,includingtubes,cell
cultureplates,pipettetips,ifnotfrozen.ItisbesttostoreAdVinsiliconizedorlowproteinbindingtubes.Pluronic
F-68usedat0.01%-0.1%intheformulationbufferwillminimizestickingifregularplasticsareused.
·AvoiddilutingAdVintolowsaltsolution.Somevirusesaggregateinlowsaltsolution,whichwillbenon-
infectious.
References
References
1.LuoJ.etal.AprotocolforrapidgenerationofrecombinantadenovirusesusingAdEasysystem.Nat.Protocols.2(5),1236-1247(2007).
2.HeT.C.etal.Asimplifiedsystemforgeneratingrecombinantadenoviruses.PNAS.95,2509-2514(1998).
3.MeierO.&GreberU.F.Adenovirusendocytosis.J.GeneMed.6(Suppl1),S152-S163(2004).
ContactInformation
GenemediBiotech.Inc.
Formoreinformationaboutadenovirus,pleasevisit:www.genemedi.net/i/adenovirus-packaging
FormoreinformationaboutGenemediproductsandtodownloadmanualsinPDFformat,pleasevisitourwebsite:
www.genemedi.net
Foradditionalinformationortechnicalassistance,pleasecalloremailus
Worldwide：[phone]
Fax：[phone]
E-mail:[email protected]
©2018GenemediBiotech.Inc.Allrightsreserved.GeneMedi

13. About GeneMedi
GeneMedi specializes in creating superior antibody, protein, and vector-based
bioproducts, revolutionizing diagnostics and biologics solutions.
At GeneMedi, innovation, product integrity, and scalable solutions form the cornerstone of our mission to advance the field
of diagnostics and biologics. Our portfolio of antibodies, proteins, and vector-derived products is built on a foundation of
unparalleled expertise in the following areas:
Innovative Antigen Design and Robust Assay Development
Our strategic focus on biomarkers and target analysis enables the creation of highly specific antigens
and the development of robust assays, ensuring our products achieve superior performance in clinical
and research settings.
Rapid Protein & Antibody Identification: Our proprietary platforms, TAURUS
TM
for accelerated
antibody discovery and LIBRA
TM
for AI-driven protein evolution, are designed to identify and optimize
molecules with optimal stability and functionality.
Cutting-Edge AAV & GCT Discoveries: The G-NEXT
TM
platform is our answer to the industry's
need for innovative AAV vectors, offering improved stability, efficiency, and safety for groundbreaking
gene therapy approaches.
High-Volume Protein & Antibody Manufacturing: Our facilities are equipped to handle large-scale
production of up to 1000L per batch, ensuring high levels of purity and stability through stringent
quality controls.
Advanced Vector Manufacturing Capabilities: In GeneMedi Vector Core (GVC), with a focus on
AAV, Lentivirus, and VLP production up to 200L per batch, we employ sophisticated purification
techniques to guarantee vector efficacy and integrity
Diagnostics: Our diagnostic solutions leverage CLIA, LFA, ELISA and unique POCT platforms for
comprehensive assay validation and clinical sample consistency, setting new standards in diagnostic
accuracy.
Biologics: We specialize in the development of industrial solutions in up/downstream for therapeutic
antibodies, AAV gene therapy, and Cell therapy technologies, ensuring our products and solutions
can improve specificity, potency, and safety in the therapeutic industry.
Streamlined Molecular Discovery with Emphasis on Stability
Scalable Production and Uncompromising Quality
Comprehensive Solutions for Diverse Application Needs
GeneMedi (GM) is dedicated to delivering innovative and scalable biotechnological solutions, driving forward the fields of diagnostics
and therapeutics with confidence and expertise. Contact with GM to reach your reliable industrial partner.
Website: https://www.genemedi.net
Contact Email: [email protected] | [email protected]

14. 1
アデノウイルス (AdV)
組換えアデノウイルス (rAdV)の導入
組換えアデノウイルス (rAdV)は複製欠陥のあるアデノウイルスベクターであり、遺伝子移転やエンジニアリ
ング、ワクチン接種、遺伝子治療など、さまざまな目的で広く使用されています [1,2]。遺伝子転写メディ
エーターとして rAdVを使用することにはいくつかの利点があります。第一に、ゲノムに外因性フラグメン
トを挿入することなく、 8キロ塩基（ kb）の大きさの遺伝子配列を細胞や組織に伝達することができます。
第二に、ほとんどすべての分裂細胞および非分裂細胞、一次細胞および臓器組織が rAdVによって伝達され
ることができる。さらに、 rAdVは操作が容易で大規模に拡張され、効率は最大 100%に達することができ
ます。したがって、 rAdVは遺伝子工学研究と疾患の潜在的な治療法において重要な役割を果たしています。
最も一般的に使用されるアデノウイルスは、サイズ約 36 kbの二本鎖線形 DNA分子からなるホモサピエン
スの血清型 5(Ad5)です1。細胞質膜受容体および繊維は、アデノウイルスの細胞質への内細胞増殖を促進
し、そこでウイルス粒子はさらに細胞核に移動し、宿主の複製機械を使用して自己複製する [3]。複製する
と、ウイルスゲノムはタンパク質殻に組み込まれ、細胞から放出され、細胞の溶解を引き起こします [3]。
現在、rAdVのいくつかのパッケージングシステムが開発されており、その中では AdEasy1とAdMAX2が
2つの最も人気のあるパッケージングシステムであり、標的遺伝子配列をシャトルベクターにクローンし、
その後ウイルスバックボーンベクターに再結合するという共通の戦略を共有しています。初期のウイルス転
写ユニットである E1とE3は、これら 2つのシステムの両方で欠損していますが、 E3遺伝子はウイルスの
複製に必要ではありません 1。したがって、 rAdVのパッケージは通常、 HEK-293、HEK-293AなどのE1遺
伝子を発現する細胞株で行われます [2]。
AdEasyと比較して、 AdMAXシステムは比較的扱いやすく、ウイルス生成中により高いウイルス価を達成で
き ま す 。 こ の rAdVプ ロ ト コ ル は 、 パ ッ ド シ ャ ト ル ベ ク ト ル と rAdVバ ッ ク ボ ー ン ベ ク ト ル
pBHGlox(delta)E1-3creからなる 2ベクトルシステムを使用して、 AdMAXシステムに従って開発されま
す。
プロトコルの概要
組換えAdV生産の概略的概要を図 1に示します。最初のステップは、関心遺伝子（ GOI）を適切なプラスミ
ドベクターにクローンすることです。ほとんどのアプリケーションでは、興味のある cDNAはrAdVシャト
ルベクトルの 1つにクローンされます。これらのベクトルに存在する反転端子繰り返し (ITR)配列は、 rAdV
の複製とパッケージ化に必要なすべての cis作用要素を提供します。
組換え発現プラスミドは、パッケージングプラスミド pAd-BHGlox(delta)E1、E3と293A細胞(E1補完
細
胞株)に共トランスフ
ェクトされ、これらは
AdV複製とパッケージングに必要なすべてのトランス作用因子
を一
緒に供給します。
トランスフ
ェクション後
10~21日
後に顕微鏡下 で小さなプラークを 視覚化することができます。
3~6個
の
個々
のプラークを 選び、それらのウイルス価を比較し、最高価のプラークを 選択して、その後の増 幅、濃
縮
、精製実験を進めます。

15. 細
菌株
E.coli株dh 5 ɑsはシャトルベクターとバックボーンベクターの増
幅
に使用されます。
2
図1。AdVパッケージ
実験フローチャート。
実験材料
ウイルス
包装システム
このプロトコルでは、組換えアデノウイルス (rAdV)をパッケージ化するた
めに
2プラスミドシステム
が使用されます。これには、遺伝子
過剰発現、
RNA干渉
、
CRISPR/Cas9遺伝子ノックアウトのた
めの
エンジニアリング配列にクローン
可能なシャトルベクター
(pAd)、およびアデノウイルスバックボーン
ベクター (pBHGlox(delta)E1,3Cre)が
含まれます。さまざまな 実験目的に適したシャトルベクトルの 選
択
方法の詳細については、
AdVユー
ザーマニュアルを参照してください。

16. 3
包装
細胞株
293Aは、rAdVの初期生産、増
幅及び価測定を容易にすることができるウイルス 包装細胞株である。これは、ア
デノウイルス複製に必要な E1タンパク質を発現する
付着性のある 上皮様細胞株であり、合 流すると単分子層に成
長
します。
293細胞株に
由来し、プラークアッ セイのために確立されたこの細胞株は、扱いやすいトランスフ ェ
クション宿主であることが
同定されました。
293Aの
完全な成長培地は、
10%胎児
ウシ血清
(FBS)と1%ペ
ニシリンスト レプトマイシン
(Pen-Strep)を
補充した
Dulbeccoの
修飾イーグル 培地
(DMEM)です。
連続培養 の場合、細胞は適切な 特性を維持するために
70%の合
流を
超
えてはい けません。通常、 セル通路番号
1から
始めて、
30通
路内で最適な結果を 得ることができます。 到達し
たら、
予期せぬ突然変異 や不健康な成長の場合に備えて、別の冷凍株から新しい文化を開始するのが最 善です。し
たがって、
実験の完全性と継続性を確保するためには、独自の
293A凍
結株を銀行化することが非常に重要です。
対数相
で細胞を 凍結することで、解 凍後の生存性が 向上します。
通知：
細胞株が
マイコプラズ マによって 汚染されている 場合、より 良い培養細胞状態に達するた めに、ゲネメディ抗マ
イコプラズ
マ試薬キュレプラズマの使用をお 勧めします。
包装
細胞株
関心のある遺伝子
ポ
ンドスープ
寒天及
びアガロー
ス
カナマイシンア
ンピシリン
70、100%エタノール
滅菌PBS
塩化
セシウム（
CsCl）
塩素
漂白剤
DNAゲル
装置および電源クラス
IIバイ
オ
セ
ーフティキャ ビネット
37℃軌道
シェーカー
37℃細
菌インキュベー
ター37℃、5%CO2イ
ンキ
ュベーター
15、50ml円錐
チューブ
25 cm2および75 cm2の組織
培養フ
ラスコ
セルスクレーパー
ドライアイス /メタ
ノール
浴液窒素タン
ク
超遠
心分離機
(Beckman)またはSW28ローター
低速ス
イングバケット
遠心分離機と同等
微小遠
心分離機
遠
心分離機チューブ（キャップ 付き厚壁ポリカーボネー
トチ
ューブ）リングスタンドとクランプ、
3ml注射
器、18g針

17. 4
AdVの
包装と濃度
AdV のベクトル
構築

rAdVパ ッ ケ ー ジ 化 の
前に 、 関 心 の あ る 遺 伝 子 を
rAdVシ ャ ト ル ベ ク タ ー に
構 築す る 必 要 が あ り ま
す。Genemediはまた、
代替プロモーターと 蛍光ラベルを 備えたさまざまな
AdVベクターを提供していま
す(表1)。さらに、ジ
ェネメディには、アデノウイルス
-LC3オ
ートファジーフラックス 検出バイオセンサー
などの遺伝子
ツールを備えた事前に作られた
AdVベクターグッズがたくさん在
庫されています。
注意：
ベクターを
迅速かつ効率的に 構築するためには、
genemedi-cloneasytmワンステップクローニングキット
(cat.gm-gc-01/02/03)を使用することを
強くお勧めします。
293A 包装
細胞へのウイルスプラスミドのトランスフ ェクション

a.293A細胞
培養は、トランスフ ェクション 前に
50%〜70%の
単層形態の合流に達するた めに、少なくと
も1日前
に準備する必要があります。
b.トランスフ
ェクションの 日には、
DMEMを37℃の
水浴で予め温め る必要があり、リ ポゲネットトラン
スフ
ェクション 試薬を室温に均衡させ、使用 前にタップして 混合する必要があります。
c.60 mmの
皿を使用して 各反応のためのウイルスプラスミドを 調製する。
表1。トランスフ
ェクションに必要なプラスミドおよびトランスフ ェクション 試薬。
成分 額
パッドシャトルプラスミド 2 μ g
pGlox(デルタ)E1,3Cre 4 μ g
脂肪
遺伝子
30 μ l
d.プラスミドとトランスフ
ェクション 試薬を
DMEMで
混合し、事前播種された
293A細胞に
滴状に追加し
ます。37℃、5%CO2でインキ
ュベートし、
6時間
で完全な培地でリフレッシュします。
注意：
1.前記トランスフェクション試薬の詳細なプロトコルは、ゲ ネメディリポゲネットトランスフェクション
試薬使用マニュアルを参照することができる。
2.細胞は、トランスフ ェクション前に使用するために健康な成長状態である必要があります。
プラーク形成と細胞
採取
プラークは、アデノウイルスに
感染すると細胞 障害効果を示す 単層細胞の領域であり、通常は 顕微鏡または肉
眼
で丸く暗い細胞または 白い斑点として 観察されます
(図1)。ウイルス性を
観察することが重要です

18. 5
トランスフ
ェクションされた細胞を 収集する前にプラークが発生します。
a.ウイルスの拡
散を最小限に抑え、ウイルスプラーク形成の 状態を良好にするた めに、最終濃度
1.25%の
通常
培地に低融点アガロースを 添加することをお 勧めします。
b.トランスフ
ェクション後
10~21日
後に顕微鏡下 で小さなプラークを 視覚化することができます。シャト
ルプラスミド内のエンジニアリング配列に
蛍光タグ
(GFPまたはRFP)が
搭載されている 場合、プラーク
が生成される
前に蛍光顕微鏡 でトランスフ ェクション効率を 推定できます。
c.孤立
したウイルスプラークを 周囲のアガロースとともに 選び、
1mlの
新鮮な培地に移し、一 晩インキュ
ベートします。一般的に、ウイルス価を比較するた
めに
3~6個
のプラークを 選ぶ必要があり、その後、
価が最も高いプラークをその後の
実験に進めます。
図1。プラークの
同定。
注意：
高純度の低融点アガロースの原液を、滅菌PBS中で最終濃度5%まで調製することができる。使用 前に、沸
騰した水浴でストックを完全に溶かし、室温で45℃まで徐々に冷却します。あらかじめ加熱した37℃の完
全成長媒体を使用して、ア ガロース原液を最終濃度1.25%に希釈します。培養液を前に除去した細胞によく
混合した溶液を直ちに穏やかに加え、プラーク細胞を 均一に覆うように回転させる。6井戸プレートには、
井戸ごとにアガロース/媒体3mlを加えます。
感染した細胞を収集する前にウイルスプラークを 観察することが重要です。ウイルスの拡 散を最小限に抑
え、ウイルスプラーク形成の 状態を良好にするために、通常の培地に低融点アガロースを添加することが推
奨され、トランスフ ェクション後 10~21日後に顕微鏡下で小さなプラークを視覚化することができます。
シャトルプラスミド内のエンジニアリング配列に 蛍光タグ(GFPまたはRFP)が搭載されている場合、プラー
クが生成される前に蛍光顕微鏡でトランスフェクション効率を推定できます。
ウイルス増
幅
a.翌日
、新鮮な事前播種された
293A細胞にウイルスを
含む上清を加えてウイルスを増 幅します。
b.プラークの形成を
観察する際に細胞や 上清を採取し、全ウイルスを 採取する前に
3回凍
結解凍サイクル
に進みます。

19. 6
c.回収
されたウイルスは通 過
1（P1ウイルス）として
認識される。次に、 新鮮な
293A細胞にP1ウイ
ルスを
感染させます。
d.P4ウイルスが
得られるまで
3回
の感染収集 サイクルを行い、
P4ウイルス
感染によりウイルス産生
を大規模に拡大します。プラークの形成が
観察されると、ウイルスが 採取され、精製および 濃縮さ
れます。
注意：
1.トリプシン化の 代わりに細胞スク レーパーを使用して細胞を 剥離します。採取した細胞は、 500
g、4℃で10分間遠心分離する必要があります。最も 多くの上清を捨て、2mlを残して細胞ペレット
を再懸濁させ、-80℃未満の容器に移します (ドライアイスまたは 液体窒素を使用して )凍結および解
凍します。
2.ウイルス価が低下した場合には、ウイルス 懸濁液が完全に溶融したときに 37℃浴から直ちに除去し
ます。完全に溶けたサスペンションを 30秒間大きく振ります。通常、 2~4ラウンドの凍結解凍サ
イクルは、価数の高いウイルスの 収率を向上させることができます。
3.凍結解凍サイクルの後、ウイルス溶解 液を500 g、4℃で10分間遠心分離して細胞の破片を除去
し、後で使用するた めに-80℃で保存することができます。
ウイルス
浄化
rAdVの
精製プロセスは、
PEG8000凝
縮、
CsCl密
度勾配遠心分離、透析の
3つのステップで
構成されて
います。
前記詳細な動作 処理は以下の通りである。
a.解
凍：
1日前
に
-80℃からウイルスを
取り出し、 室温の水浴で溶かします。
7000g、4℃で10分
間
遠
心分離し、上清を採取します。
b.PEG8000凝
縮：上清
100mlあたり50ml peg8000溶
液（
2.5m naclの
超純水に
20%PEG8000）
を
加え、氷の上に
1時間置
き、ウイルスをプル ダウンします（ 氷の上でインキ ュベーションする 時
間
は比較的 延長できます）。 混合物を
7000g、4℃で20分
間遠心分離し、上清を廃棄し、密度
1.10g/mlで10ml cscl溶
液にウイルス ペレットを再 懸濁させます（
CsClの溶
媒は
20mM Tris-
HCl、pH8.0です。
表
2の次のCsCl溶
液調製方法を 参照してください）。ウイルスを 含む
CsCl溶
液
はピンクのものでな ければなりません
(図2)。
表2。CsCl溶
液調製。
20℃（g/ml）での
密
度
濃度
（
ml/ml） CsCl量
（
g） 最
終容積
(ml)
1.40 548.3 5.483 10
1.30 402.4 4.024 10
1.20 143.8 1.438 10
c.CsCl密
度勾配遠心分離：遠心チューブの底に
1.40g/mlのCsCl溶
液
2mlを
置き、次に
1.30g/mlの
CsCl溶
液
3mlを最初の
層の上にゆっくりと 加え、
5mlのウイルス
懸濁液を加えます。ベック マン
SW28ローターを 26,000 rpm、4℃で2時間備
えた遠心分離機。

20. 7
図2。CsCl密
度勾配遠心分離プロセス。左パネル：超
遠
心前の
CsCl勾
配。右パネル：超遠心後の
CsCl勾
配。
d.ウイルス
収集：注射 器で
1.30g/mlから1.40g/mlの
層の間のウイルスバンドを 収集し、透析袋に移
します。
注意：
透析バッグを10 mM EDTA-Na2で10分間沸騰させ、使用前に室温まで冷却する必要があります。
e.透析
：ウイルスを 含む透析バッグを 透析緩衝 液（ショ糖
50g、10ml 1 m tris-hcl、PH 8.0、2ml 1
m mgcl2、
蒸留水で最大
1l補充
）に入れ、
4℃で一
晩かき混ぜます。透析中に一度新鮮な緩衝液と
交
換してく ださい。
f.処
方：バッグからウイルスを 採取し、
PBSで体
積を
500 μ lに
調整し、価を 決定します。 精製され
たrAdVは4℃で1週
間以内、または
-80℃で
長時間保 存する必要があります。
精
製
rAdVの
滴定
rAdVの価
測定方法はプラークアッ セイである。プラーク形成 単位（
PFU）は、一
定の体積のウイルスに
よって
誘導されるプラークの 数であり、 活性なウイルス粒子の 濃度を表します。
rAdVのプラークアッ
セイ：
a.少
なくとも
1日前
に
60mm皿
にセル
293Aをプ
レートすることを 特徴とする。
b.細胞の合
流が約に達すると。
100%、
異なる濃度の希釈ウイルスを 加え、
37℃でインキ
ュベートしま
す。
c.感染
後
4~8時間
、
8mlの
低融点アガロース溶 液（
10%FBS、1.25%ア
ガロース）で細胞を 覆いま
す。

21. 8
d.培養
の
9~11日間
のプラーク 数をカウントすることで
rAdVの価を
計算します。
注意：
rAdVの価は、適用可能な場合に蛍光を観察することによって、または標的遺伝子の発現 レベルでウェスタン
ブロッティング (WB)、免疫蛍光(IF)および免疫組織化学(IHC)検出の方法によって 決定することもできます。
標的細胞の伝達
細胞株
ごとにモイが 異なるため、正式な実験を行う前に標的細胞の適切なモイを 確保するために予備実験 が
必要である。
注意：
MOI：感染の多数は、1つの細胞に感染するウイルス粒子の 数です。特定の細胞への本物のモイは、さまざ
まなラボでのウイルスへの 対処の操作と方法の影響を受ける可能性があるため、モイの最適化テストを 強く
お勧めします。
細胞
調製
堅牢
なターゲット細胞を
1 x 105/mlの
密度で
24ウ
ェルプレートにプ レートします。
注意：
植えられた細胞数は、当該細胞株の成長速度に依存することを特徴とする。次の日に50%から70%の合流に
達する必要があります。
rAdV のモイ
試験

ウイルスを 10倍
の希釈勾配で調製し、モイが
3~1000の
範囲内であることを 確認します。
日0：1 x 105/mlの
密度で良好な状態のプレートターゲット細胞を
96ウ
ェルプレートに、
1ウ
ェルあたり
100 μ lにします。一
晩
37℃でインキ
ュベートします。
1日
目：
6モイ
勾配でウイルスを 調製し、標的細胞の 完全培地 中で適量のウイルス 懸濁液を最終体積
100 μ l
に
希釈します
(モイ=3、10、30、100、300、1000を
設定します
)。
希釈されたウイルスを 事前播種細胞に
加
え、
37℃で4~8時間
インキュベートし、 培地をリフレッシュしてウイルスを 除去します。
3日
目：顕微鏡 で蛍光を検出します。 蛍光セルの比率に基 づいて
MOIを
算出することを 特徴とする。
注意：
ウイルスが蛍光標識されていない場合、MOIはqPCR、WB、If、IHCなどで決定することができる。

22. 9
伝導；伝導
ウイルスを 10倍の希釈勾配で調製し、モイが 3~1000の範囲内であることを 確認します。
a.付着細胞の場合：
標的遺伝子と 同じ量の対照ウイルスを 含むrAdVsを2つの細胞 群に別々に添加し、よく 混合する必要が
あります。使用するウイルスの 量は、下記表に記載の容器の大きさに基 づいている。ほとんどの細胞タ
イプのモイテストの 場合、3回の複製で 3、10、30、100、300~1000の勾配で十分です。 4~8時間
で媒体をリフ レッシュします。興味のあるタンパク質は、 蛍光顕微鏡 、WBなどで48~72時間以内に
検出できます。
表3。ウイルスの 量は容器サイズが 異なります。
表面積（cm2） 媒体の容積 ウイルスの 量
0.3
100 μ l
容器のサイズ
96-ウェル
24-ウェ
0.1~0.5 μ l
ル
2 500 μ l
1~3 μ l
412-ウェル
6-ウェ
1 ml 2~5 μ l
ル 10 2 ml


たとえば、rAdVの層が5 × 1011 PFU/mlの場合、標的細胞の 完全な成長培地で5 × 1010
PFU/ml(10倍)に希釈します。1つの井戸に1 × 105細胞があり、 MOIが1,000の場合、希釈ウイルス
の必要な体積(5 × 1010 PFU/ml)は(細胞数)×(MOI)÷(rAdVのPFU/ml)=1 × 105 × 1,000/5 ×
1010(ml)=2µlでなければなりません。したがって、この 井戸に2ulの希釈ウイルスを添加する必要が
5~20 μ l
あります。
注意：
廃棄物は、生物安全要件セクションに記載されている手順に従って処分する必要があります。
b.懸濁細胞の場合：
スピン感染は、懸濁細胞または 半懸濁細胞を転換するのに 十分な方法です。要するに、ウイルスを 添加
した後、細胞 培養プレートをパラフィルムで 封止し、低速スイングバケ ツ遠心分離機で200gで37℃
で1時間回転させ、 37℃で一晩培養します。次の 日に媒体を更新する必要があります。
スピン感染の状態が許されない 場合は、細胞をチ ューブに移し、 遠心分離器を低速で使用することがで
きる。遠心分離後に上清の大部分を廃棄し、ウイルスを 加え、室温で15〜30分間インキュベートしま
す。その後、細胞とウイルスの 混合物を適切な容器に移し、一 晩37℃で培養します。 媒体は翌日交換す
る必要があります。
伝導効率を 決定する
伝達後48~72時間では、適用される 場合に蛍光タンパク質を 観察し、標的遺伝子の 変化をqPCRによっ
てmRNAレベルまたは WBによってタンパク質 レベルで分 析することができる。

23. 10
アデノウイルス (AdV)の
安全な使用
1.AdV関
連実験は、バイ オセーフティ レベル
2施設(BL-2レ
ベル
)で
実施する必要があります。
2.ラボコート、
マスク、手袋を完全に装備し、手と腕を露出させないよう最 善を尽くしてく ださい。
3.ウイルス
懸濁液を飛ばすのに注意してください。運転中にバイ オセーフティキャ ビネットがウイルス
に
汚染された場合は、す ぐに
70%アルコールと 1%SDSを
含む溶液でテーブルボードをこすります。
すべてのチップ、チ
ューブ、培養プレート、ウイルスに接 触する培地は、廃棄する前に塩素含有消毒液
に
浸す必要があります。
4.遠
心分離が必要な 場合は、遠心チューブを密閉する必要があります。 条件が許容されている 場合は、
遠
心分離する前にパラフィルムでチ ューブをシールします。
5.AdV関
連の動物実験も
BL-2レ
ベルで実施する必要があります。
6.廃棄物
に関連する廃棄物は、処分前に特別に収集しオートクレーブする必要があります。
7.実験
後は消毒剤で手を洗います。
AdVの
保存と希釈
広
告の保管
ウイルスは 4°Cで
短時間（
1週
間未満）保存し、受 信後に使用することができます。
AdVウイルスは
凍
結解
凍に敏感であり、 凍結解凍を繰り返すと価 数が低下するため、アリコットウイルス在 庫は到着直後
に-80°C冷凍庫
で保管して長期使用する必要があります。一方、
AdVウイルスが 12か
月以上保存され
ている
場合は、使用 前にウイルス価の再 検出が推奨されます。
注：1.ウイルス価に
悪影響を及ぼす場合には、繰り返しの 凍結解凍サイクルを 避ける必要があります
(凍
結解
凍サイクル ごとに
10%~50%の
減少があります
)。Genemediは、rAdV製
品を小さなアリコット
(200 μ l/チ
ューブ
)で提供し、複
数の使用用に
-80℃で
直接保存できます。
2.6か
月以上保存されたウイルスについては、使用 前にウイルス価を再分 析することが示 唆されます。
AdV の
希釈

冷凍
アリコットを適切に解 凍するには、
-80℃の
冷凍庫から完全に溶けるまで氷の湯にウイルスを移し
ます。溶解したときは、適
量の無菌
PBSまたは
無血清培地を加え、
4℃で1週
間以内に保存します。
注意事項
·環境
の極端な状況
(pH、EDTAなどのキ
レート剤、温度、有機溶 媒、
)へのAdV曝露
を避ける

24. 1110
タンパク質
変性剤、強力な洗剤など
)
·渦
、気泡の吹き付け、または 同様の操作中に
AdVサンプルに
空気を導入することを 避け、タンパク
質の
変性を引き起こす 可能性があります。
·繰り返しの
凍結と解凍を避けてください。
·「
通常の」プラスチック
(特
にポリスチレンまたは 疎水性プラスチック
)に
液相で長期間曝露しないよ
うにしてく
ださい。ほとんどの
AdVウイルスは非常に
粘着性があり、 冷凍しないとチ ューブ、細胞培
養
プレート、ピ ペット先端などの通常のプラスチックにさらされると損 失が発生する 可能性がありま
す。AdVをシリコン化または
低タンパク質結合チ ューブに保存するのが最 善です。プラロニック
F-68
を配合
緩衝液で
0.01%~0.1%で使用すると、通常のプラスチックを使用すると、
付着が最小限に抑え
られます。
·AdVを
低塩溶液に希釈しないようにしてく ださい。いくつかのウイルスは 低塩溶液に集まり、それ
は
感染性ではありません。
参照
参照
1.ル
オ
J.ら。アデージーシステムを用いた組換えアデノウイルスの
迅速な生成プロトコル。 ナット。プロトコル。
2(5),1236-1247(2007).
2.彼
。
C.他
。組換えアデノウイルスを生成するた めの簡略化されたシステムと、
PNAS.95,2509-2514(1998).
3.マ
イヤー
O.J.遺伝子メド。 6(補
足
1)、S152~S163(2004)。
連
絡先情報
ジ
ェネメディバイ オテクノロジー。株 式会社。
アデノウイルスの
詳細については、
www.genemedi.net/i/adenovirus-packaging を
ご覧ください。
genemedi製
品の詳細および
PDF形
式のマニュアルをダウンロードするには、 当社の
webサイト
：
www.genemedi.netを
ご覧ください。
追加
情報または技術支援 については、お 電話またはメールでお 問い合わせく ださい。
世界
中で：
86-21-
50478399フ
ァックス：
86-21-50478399
電
子メール ：
[email protected]
©2018ジ
ェネメディバイ オテクノロジー。株 式会社全著作権所有。

25. About GeneMedi
GeneMedi specializes in creating superior antibody, protein, and vector-based
bioproducts, revolutionizing diagnostics and biologics solutions.
At GeneMedi, innovation, product integrity, and scalable solutions form the cornerstone of our mission to advance the field
of diagnostics and biologics. Our portfolio of antibodies, proteins, and vector-derived products is built on a foundation of
unparalleled expertise in the following areas:
Innovative Antigen Design and Robust Assay Development
Our strategic focus on biomarkers and target analysis enables the creation of highly specific antigens
and the development of robust assays, ensuring our products achieve superior performance in clinical
and research settings.
Rapid Protein & Antibody Identification: Our proprietary platforms, TAURUS
TM
for accelerated
antibody discovery and LIBRA
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for AI-driven protein evolution, are designed to identify and optimize
molecules with optimal stability and functionality.
Cutting-Edge AAV & GCT Discoveries: The G-NEXT
TM
platform is our answer to the industry's
need for innovative AAV vectors, offering improved stability, efficiency, and safety for groundbreaking
gene therapy approaches.
High-Volume Protein & Antibody Manufacturing: Our facilities are equipped to handle large-scale
production of up to 1000L per batch, ensuring high levels of purity and stability through stringent
quality controls.
Advanced Vector Manufacturing Capabilities: In GeneMedi Vector Core (GVC), with a focus on
AAV, Lentivirus, and VLP production up to 200L per batch, we employ sophisticated purification
techniques to guarantee vector efficacy and integrity
Diagnostics: Our diagnostic solutions leverage CLIA, LFA, ELISA and unique POCT platforms for
comprehensive assay validation and clinical sample consistency, setting new standards in diagnostic
accuracy.
Biologics: We specialize in the development of industrial solutions in up/downstream for therapeutic
antibodies, AAV gene therapy, and Cell therapy technologies, ensuring our products and solutions
can improve specificity, potency, and safety in the therapeutic industry.
Streamlined Molecular Discovery with Emphasis on Stability
Scalable Production and Uncompromising Quality
Comprehensive Solutions for Diverse Application Needs
GeneMedi (GM) is dedicated to delivering innovative and scalable biotechnological solutions, driving forward the fields of diagnostics
and therapeutics with confidence and expertise. Contact with GM to reach your reliable industrial partner.
Website: https://www.genemedi.net
Contact Email: [email protected] | [email protected]

26. 1
아데노바이러스 (AdV)

재조합 아데노바이러스
(rAdV) 도입

재조합 아데노바이러스
(rAdV)
는 유전자 이전과 공학
,
백신 접종
,
유전자 치료를 포함한 다양한 목적에 널리 사

용되는 복제 결함의 아데노바이러스 매개체이다
[1,2]. radv
를 유전자 이동 매개체로 사용하는 것은 몇 가지


장점이 있다
. 첫째,
게놈에 외원성 조각을 삽입하지 않고도 세포와 조직으로
8킬로염기 (kb)
의 유전자 서열을


전달할 수 있다
. 둘째,
거의 모든 분분세포
, 비분분세포 ,
원차 세포 및 기관 조직은
radv
에 의해 전환될 수 있
다.
또한
radv
는 조작이 쉽고 대규모로 확장되며 효율이 최대
100%
에 달할 수 있다
.
따라서
radv
는 유전자


공학 연구와 질병의 잠재적 치료에서 중요한 역할을 한다
.

가장 흔히 사용되는 아데노바이러스는 약
36kb
의 크기의 이중 사슬 선형
dna
분자로 구성된 호모 사피엔스의


혈청형
5(Ad5)이다.
세포질막 수용체와 섬유는 아데노바이러스가 세포 세포질로 내세포를 유도하고
, 바이러스

입자는 숙주의 복제 기계를 이용하여 세포 핵으로 더 이동하여 자기 복제를 진행한다
.
일단 복제되면 바이러스


게놈은 단백질 껍데기에 집결되어 세포에서 방출되어 세포의 분해를 일으킨다
[3].

오늘날
radv
의 여러 포장 시스템이 개발되었는데
,
그 중
Adeasy1
과
Admax2
는 가장 인기있는 두 가지이며
,

표적 유전자 서열을 셔틀 매개체로 복제한 후 바이러스 핵심 매개체로 재결합하는 공통적인 전략을 공유한다
.

초기 바이러스 전사 단위인
e1
과
e3
은 이 두 시스템에서 변함이 있지만
e3
유전자는 바이러스 복제에 필요하

지 않다
1.
따라서
radv
의 포장은 보통
hek-293, hek-293a
등과 같은
e1
유전자를 발현하는 세포계에서 이

루어진다
[2].
admax
시스템은
adeasy
에 비해 처리하기 쉽고 바이러스 생성 과정에서 더 높은 바이러스 적사를 달성할 수

있다.
이
radv
프로토콜은
admax
시스템에 따라 개발되었으며
,
패드 셔틀 벡터와
radv
핵심 벡터

pbhglox(delta) E1-3cre
로 구성된 이중 벡터 시스템을 사용하였다
.

프로토콜 개요

재조합
adv
생산에 대한 도표적 개요는 그림
1
과 같다
.
첫 번째 단계는 관심 유전자
(GOI)
를 적절한 질체 매개

체로 복제하는 것이다
.
대부분의 응용 프로그램의 경우
,
관심의
cdna
는
radv
셔틀 벡터 중 하나로 복제됩니
다.
이러한 벡터에 존재하는 반전 단말기 반복
(ITR)
서열은
radv
복제 및 포장에 필요한 모든
cis
작용 요소를

제공한다 .

재조합 발현 플라스미드
293a 세포(E1
보완 세포계
)
와 포장 플라스미드 패드
-bhglox(delta) E1, E3
로 공동

으로 전염되며
,
이들은
adv
복제 및 포장에 필요한 모든 트랜스 작용 인자를 공급한다
.

작은 플라크는 전염 후
10~21
일 현미경 아래에서 시각화될 수 있다
. 3~6
개의 개별 플라크를 선택하여 그들

의 바이러스 적사를 비교한 다음 최고 적사를 가진 플라크를 선택하여 이후의 증폭
,
농축 및 정화 실험을 진행
한다.

27. 박테리아 주
E.
대장주
dh5
는 셔틀과 핵심 벡터의 증폭에 사용된다
.
2
그림 1. adv 포장 실험 흐름도.
실험 재료
바이러스 포장 시스템
이 프로토콜은 유전자 과발현, rna 간섭 및 crispr/cas9 유전자 토너먼트를 위한 엔지니어링 서열로 복제
할 수 있는 셔틀 벡터(패드)와 아데노바이러스 핵심 벡터(pBHGlox(delta) E1,3Cre)를 포함한 재조합 아
데노바이러스 (rAdV)를 포장하는 데 사용된다 . 다른 실험 목적에 적합한 셔틀 벡터를 선택하는 방법에 대
한 자세한 내용은 adv 사용자 설명서를 참조하십시오 .

28. 3
포장 세포 라인
293a는 radv의 초기 생산, 증폭 및 적사 측정을 용이하게 할 수 있는 바이러스 포장 세포라인이다 . 그것은 아데노바이러스의 복제에 필요한 e1
단백질을 발현하는 붙박이 있는 상피 모양의 세포계이며 , 합류할 때 단층으로 자란다. 이 세포계는 293 세포계에서 유래하여 플라크 측정을 위해
설립되었으며 , 이 세포계는 쉽게 처리할 수 있는 전염 숙주로 확인되었다 .
293a의 완전한 성장 배양기는 돌베코 개식 독수리 배양기(DMEM)가 10%의 태소 혈청(FBS)과 1%의 페니실린 -스트레프토마이신 (펜-스트레프 )
을 보
충한다
. 지
속적인
배양의 경우, 세포는 적절한 특
성을
유지하기 위해 70%의 합류를 초과해서는 안 된다. 일반적으로 세포 통행 번호부터 시
작하면 30개 통행 이내에 최적의 결과를 얻
을
수 있다. 일단 도달하면 예
상치
못
한
돌연변이와 불건강
한
성장이 발생할 경우 다른 냉
동
주식에서
새
로운
문
화를
시작하는 것이 가장 좋
다
. 따라서 자신의 293a 동결 주식을 은행하는 것은 실험의 무
결성과
연
속성을
보장하는 데 매우 중요하다 .
대수 단계의 세포를 얼
어붙이면
해동 후의 생존
력이
향
상된다
.
알림:
만약 세포계가 바이코플라
즈마에
오염되면 , 더 나은 배양 세포 상태에 도달하기 위해, 우리는 genemedi 항
바이코플라 즈마
시약 cureplasmatm
의 사용을 권
장한다
.
포장 세포 라인
관심 유전자 파운
드
수
프
석
가와
석
가로스
카
나
마이신 암
피실린
70 및 100% 에
탄올
무균 pbs
염화세
슘
(CsCl) 염소표백제
dna 젤
기구
및 전원 공급 장치 II 등급 생
물안전장
37℃ 궤
도
흔들기 37℃ 박테
리아 인
큐베이터
37℃, 5%
CO2 인
큐베이터
15ml 및 50ml 원
추관
25cm2 및 75cm2 조직 배양 병리 세포 스크래
퍼
건
아이스
/메탄올 목
욕
액
질
소 탱
크
초원심분리기 (Beckman) 또는 sw28 로터 저속 스
윙
-버킷 원심분리기
와 동등한
마이크로 원심기
원심기 튜브(뚜껑
이
있는 두
벽
폴
리카보네이트
튜브) 링 스
탠드
및 클
램
프, 3ml 주사기 및 18g 바늘

29. 4
ADV의 포장 및 농도
ADV 의 벡터 구성
RADV 포장하기 전에 관심있는 유전자는 RADV 셔틀 벡터로 구축되어
야
한다. genemedi는 또한 다양한 adv 매개체에 대체 촉
진제와 형
광
라
벨을
제공한다 (표 1). 게다가, genemedi는 아데노바이러스 -lc3 자가식용 흐름 검
사
생
물
센
서
등과 같은 유전자
도구를 가지고 있는 많
은
사전 제작된 adv 매개체 상
품을
가지고 있다.
참고:
벡터를 빠르
고
효율적으로 구축하기 위해 genemedi-cloneasytm 1단계 복제 키
트
(cat.gm-gc-01/02/03)를 사용하는 것이 강
력
하다
.
바이러스 플라스미드를 293a 포장세포로 전염시
키다

a.293a 세포 배양은 전염되기 전에 50%-70%의 단층 형태의 합류점에 도달하기 위해 적어도 하루 전에 준
비되어야
한다.
b.전염
당일
, dmem은 37℃의 물욕
에서
사전에 따
뜻하게
해
야
하며, lipogenetm 전염제 시약은 실
온에
균
형을
맞추
고
사용
하기 전에 섞
어야
한다.
c.60mm 접시를 사용하여 각 반응에 대해 바이러스 플라스미드를 준
비합니다
.
표 1. 전염에 필요한 플라스미드와 전염시약
구성 요소 금액
패드 셔틀 플라스미드 2μg
pGlox (델타) E1,3Cre 4μg
지방 제
품
30개의 리터
d.플라
즈미드와
전염제 시약을 dmem에서 혼
합하고
, 사전 파
종된
293a 세포에 방
울을
첨
가한다
. 37℃, 5%의 CO2에서 부화
하고 6시간 동
안
완전한 배양체로 새
로워한다
.
참고:
1.상기 전염 시약의 상세한 프로토콜은 genemedi lipogenetm 전염 시약 사용자 설명서를 참조할 수 있다.
2.세포는 전염되기 전에 사용하기 위해 건강한 성장 상태에 있어야 한다.
플라크 형성 및 세포 채
집

플라크는 아데노바이러스에 감
염되면
세포병적 효과를 나
타내는
단층 세포의 영
역이며
, 일반적으로 현미경이나 육안
으로
둥글
고

짙
은
세포나 흰색 반점으로 관
찰된다
(그림 1). 바이러스를 관
찰하는
것이 중요합니다 .

30. 5
전염된 세포를 수집하기 전에 플라크
a.바이러스의 전
파를
최소화하여 바이러스의 플라크 형성 상태를 더 좋
게
하기 위해, 최종 농도가 1.25%인 정규 매질에 낮
은

녹
점의
아가로스를 첨
가하는
것이 좋
다
.
b.작은 플라크는 전염 후 10~21일 현미경 아래에서 시각화될 수 있다. 만약 셔틀 플라스미드의 공학 서열이 형
광
태그(gfp 또
는 rfp)를 가지고 있다면, 플라크가 생성되기 전에 형
광
현미경으로 전염 효율을 추
정할
수 있다.
c.분리된 바이러스 플라크를 주위의 아가로스와 함
께
뽑
아
1ml의 신선한 매질에 옮겨 밤새 부화시킨다 . 일반적으로 3~6개의
플라크를 선택하여 바이러스 적사를 비교해
야
하며, 그 후 가장 높은 적사를 가진 플라크는 후
속
실험으로 진행될 것이다.
그림 1. 플라크의 식별.
참고:
고순도 저융점 아가로스의 원액은 무균 pbs에서 최종 농도가 5%에 달할 수 있다. 사용하기 전에, 끓는 물욕에서 주식을 완전히
녹이고, 실온에서 점차 45℃까지 냉각하십시오. 미리 가열된 37℃의 완전한 성장매질을 사용하여 마지막 농도를 1.25%로 희석
시킨다. 바로 잘 섞은 용액을 세포에 가볍게 넣고 앞에 배양체를 제거한 후 회전하여 플라크 세포를 고르게 덮으세요. 6정 접시의
경우, 정당 3밀리리터의 아가로스/미디어를 첨가합니다.
전염된 세포를 채취하기 전에 바이러스 플라크를 관찰하는 것이 중요하다. 바이러스의 전파를 최소화하여 바이러스 플라크 형성
을 더 나은 상태로 만들기 위해, 일반적인 매질에 낮은 녹점의 아가로스를 첨가하는 것이 좋으며, 전염 후 10일에서 21일 후에
현미경 아래에서 작은 플라크를 시각화할 수 있다. 만약 셔틀 플라스미드의 공학 서열이 형광 태그(gfp 또는 rfp)를 가지고 있다
면, 플라크가 생성되기 전에 형광 현미경으로 전염 효율을 추정할 수 있다.
바이러스 증폭
a.다음 날, 바이러스를 함유한 상청
액을
신선한 293a 세포에 첨
가하여
바이러스를 증폭시킨다 .
b.플라크 형성을 관
찰할
때 세포와 상청
액을
채취
하고
, 모든 바이러스를 채취
하기
전에 3회 동해주기로 진행한다 .

31. 6
c.채
집된
바이러스는 1번째 통행(p1 바이러스 )로 인정된다 . 그
런
다음 신선한 293a 세포에 p1 바이러스를 감
염시
킨다.
d.p4 바이러스를 얻
을
때
까지
세 번의 감
염
-수집 주기를 수행하고 p4 바이러스 감
염을
통해 바이러스 생산을 대규
모로 확대한다 . 플라크의 형성을 관
찰할
때 바이러스는 정화와 농축을 위해 수집된다 .
참고:
1.세포를 분리하기 위해 트립신화 대신 세포 스크래퍼를 사용하십시오 . 수집된 세포는 500g, 4℃에서 10분 동안
원심분리되어야 한다. 가장 많은 상청액을 버리고 2ml을 남겨 세포 펠릿을 다시 부상시키고, 냉동 및 해동을 위
해 -80 ℃ 이하의 용기로 이동하십시오 (드라이 아이스 또는 액체 질소를 사용하십시오.
2.바이러스 중단이 완전히 녹을 때 바이러스 적사가 감소하는 경우 37 ℃ 욕조에서 즉시 제거하십시오 . 완전히 녹
은 서스펜션을 30초 동안 크게 흔들어라. 일반적으로 2~4차례의 동해주기는 높은 적사량의 바이러스의 생산량
을 향상시킬 수 있다.
3.동결-해동 주기 후에, 바이러스 분해액은 세포 잔해를 제거하기 위해 500g, 4℃에서 10분 동안 원심분리되고
나중에 사용하기 위해 -80℃에서 저장될 수 있습니다.
바이러스 정화
radv의 정화 과정은 peg8000 응축, cscl 밀
도
경도 원심분리 및 투석 등 세 단계로 구성된다 . 상세한 작
업
과정은 다
음과 같
습니다
.
a.해동: 바이러스를 하루 앞당겨 -80 센티
그레드에서
꺼
내고
상
온에서
물욕
에서
녹
으십시오
. 10분 동
안
7000 g,
4℃에서 원심분리하고 상청
액을
수집합니다 .
b.peg8000 응축: 100ml 상청
액당
50ml peg8000 용
액
(2.5m nacl의 초
순수한
물
에
peg8000 20%), 1시간
동
안
얼
음에
놓
아
바이러스를 끌
어내린다
(얼
음에
부화하는 시간은 상대적으로 연장될 수 있다). 혼
합물을

7000g, 4℃에서 20분 동
안
원심분리하고 , 상청
액을
버
리고
바이러스 알갱
이를
10ml의 cscl 용
액에

1.10g/ml의 밀
도로
다시 부유시킨다 (cscl의 용매는 20mm tris-hcl, pH8.0, 표 2의 아래 cscl 용
액
제조 방법
을 참조하십시오 ). 바이러스를 함유한 cscl 용
액은
분
홍색이어야
한다(그림 2).
표 2. cscl 솔
루션
준
비
.
20℃(g/ml) 밀
도
농도 ml/ml cscl 양(g) 최종 부피(ml)
1.40 548.3 5.483 10
1.30 402.4 4.024 10
1.20 143.8 1.438 10
c.cscl 밀
도
그라데이
션
원심: 원심관 바
닥에
2ml의 1.40g/ml cscl 용
액을
놓
고
, 다음에 1층 위에 3ml의
1.30g/ml cscl 용
액을
천천
히
첨
가한
다음 5ml의 바이러스 현
탁액을
첨
가합니다
. 2시간 동
안
26,000rpm에
서 beckman sw28 로터를 가진 원심기, 4℃에.

32. 7
그림 2. cscl 밀
도
그라데이
션
원심분리 공정. 왼쪽 패
널: 초원심분리하기 전에 cscl 그라데이
션
. 오른
쪽
패
널: 초원심 후 cscl 그라데이
션
.
d.바이러스 수집: 주사기와 1.30g/ml과 1.40g/ml의 층들 사이에 바이러스 밴
드를
수집하고 투석 봉
지
로 이동합니다 .
참고:
투석 봉지를 10mm의 edta-na2에 10분 동안 끓여 실온까지 냉각시켜 사용하십시오.
e.투석: 투석 완
충기에
바이러스를 포함한 투석 봉
지를
넣
으십시오
(자
당
50g, 10ml 1m tris-hcl, PH
8.0, 2ml 1m mgcl2, 증류
물에
의해 최대 1l), 밤새 4℃에서 섞
으십시오
. 투석 중에 신선한 완
충기로

한 번 교체하세요 .
f.배합: 봉
지에서
바이러스를 채취
하고
, pbs로 500μl로 부피를 조절하고 , 적사를 결정한다 . 정화된
radv는 장시간 저
장을
위해 일주일 이상 또는 -80℃에서 4 ℃에 유지되어
야
합니다.
정화 radv의 적정
radv의 적사 측정 방법은 플라크 측정이다 . 플라크 형성 단위(PFU)는 일정 부피의 바이러스가 유도하는
플라크 수로 활
성
바이러스 입자의 농도를 나
타낸다
.
radv의 플라크 측정:
a.적어도 하루 전에 60mm 접시의 293a 세포를 판
다
.
b.세포 합류가 약 도달할 때 100%, 서로 다른 농도의 희석
된
바이러스를 추
가하여
37℃에서 부화한다 .
c.감
염
후 4~8시간, 8ml의 저융
점
아가로스 용
액
(10% FBS, 1.25% 아가로스 )으로 세포를 덮
어라
.

33. 8
d. 9-11일 동
안
배양된 플라크 수를 계산함으로
써
radv의 적사를 계산한다 .
참고:
적용할 때 형광을 관찰하거나, 표적 유전자의 발현 수준에서 웨스턴 블로팅(WB), 면역 형광(IF) 및 면역 조직 화학(IHC) 검사를
통해 radv의 적분을 측정할 수도 있다.
표적 세포의 전도
모이가 세포계에 따라 다
르기
때
문에
, 공식적인 실험을 하기 전에 표적 세포의 적절한 모이를 보장하기 위해 초보적인 실험이 필
요하다.
참고:
MOI: 감염의 다중성은 하나의 세포에 감염되는 바이러스 입자의 수이다. 특정 세포에 대한 실제 moi는 다른 실험실에서 바이러
스를 처리하는 조작과 방법에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에 moi의 최적화 테스트를 강력히 권장한다.
세포 준
비

견
고한
표적 세포를 1x105/ml의 밀
도로
24정의 플레이트로 만
듭니다
.
참고:
심은 세포의 수는 관련 세포계의 성장속도에 따라 달라진다. 다음날 50~70%의 합류에 도달해야 한다.
radv 의 moi 테스트
바이러스를 10배의 희석 그라데이
션으로
준
비하고
moi가 3에서 1000의 범
위
내에 있도
록
보장한다 .
제0일: 1x105/ml의 밀
도로
양호한 상태의 플레이트 표적 세포가 96개의 플레이트로 구성되어 있으며, 1개의 플레이트
당

100μl이다. 하
룻밤
사이에 37℃에서 부화한다 .
1일: 6moi 그라데이
션으로
바이러스를 준
비하고
, 표적 세포의 완전한 배양기에서 적
당량의
바이러스 현
탁액을
100μl의 최종 부
피로 희석
시킨다
(moi=3, 10, 30, 100, 300, 1000을 설정한다 ). 희석
된
바이러스를 사전 파
종된
세포에 넣
고
37℃에서 4~8
시간 동
안
부화한 다음 매질을 새
로워하여
바이러스를 제거한다 .
3일: 현미경으로 형
광을
검
사합니다
. 형
광
세포의 비율에 따라 moi를 계산합니다 .
참고:
만약 바이러스가 형광 표지가 없다면, moi는 qpcr, WB, IF, IHC 등으로 측정할 수 있다.

34. 9
전도
바이러스를 10배의 희석 그라데이 션으로 준비하고 moi가 3에서 1000의 범위 내에 있도록 보장한다 .
a.부착된 세포의 경우 :
표적 유전자와 같은 양의 대조 바이러스를 함유한 radvs를 두 세포에 별도로 첨가하여 잘 섞어야 한다.
사용할 바이러스의 양은 다음 표에 설명된 컨테이너의 크기에 따라 결정됩니다 . 대부분의 세포 유형의
moi 테스트의 경우, 세 번의 복제에서 3, 10, 30, 100, 300에서 1000의 경도가 충분하다. 4~8시간 안
에 미디어를 새로 고침. 관심의 단백질은 형광 현미경, WB 등으로 48-72시간 이내에 검출할 수 있다.
표 3. 다양한 용기 크기에 있는 바이러스의 양입니다 .
표면 면적(cm2) 매질 부피 바이러스의 양이
0.3
100μl
컨테이너 크기
96 -정
24 -
0.1-0.5μl
응 2 500μl 1-3μl
4 1ml12 -응
6 -
2-5μl
응
10 2ml
예를 들어, radv의 층이 5×1011pfu/ml인 경우, 표적 세포의 완전한 성장 매질로
5-20μl
5×1010pfu/ml(10
우물에 1×105세포가 있고 MOI가 1000일 경우 희석된 바이러스의 필요한 배)로희석시킨다. 1개의 부
피(5×1010pfu/ml)는 세포수 × MOI÷ radv PFU/ml=1×105×1000/5×1010(ml)=2µl 이어야 한다.
따라서 2ul의 희석된 바이러스를 이 우물에 넣어야 한다.
참고:
폐기물은 생물 안전 요구 사항 섹션에 설명된 절차에 따라 처리되어야 한다.
b.현상 세포의 경우 :
스핀 감염은 현상 또는 반현상 세포를 전환하는 충분한 방법이다 . 간단히 말해서, 바이러스를 첨가한 후
세포 배양판을 파필름으로 밀봉하고, 저속 흔들리는 원심분리기에서 200g에서 37℃에서 1시간 동안 회
전하며, 하룻밤 사이에 37℃에서 세포를 배양한다. 미디어는 다음날 새로 고쳐야 합니다.
만약 스핀 감염이 허용되지 않는다면 , 세포를 튜브로 옮기고 저속으로 원심분리기로 대신 원심분리기 튜
브를 사용할 수 있다. 원심분리한 후 상청액의 대부분을 버리고 바이러스를 첨가한 후 실온에서 15-30분
동안 부화한다 . 그런 다음 세포-바이러스 혼합물을 적절한 용기에 옮겨 하룻밤 사이에 37℃에서 배양한
다. 미디어는 다음날 교체해야 한다.
전도 효율을 결정하다
전달 후 48시간에서 72시간, 적용할 때 형광 단백질을 관찰할 수 있으며, qpcr를 이용하여 mrna 수준에
서 또는 WB를 이용하여 단백질 수준에서 표적 유전자의 변화를 분석할 수 있다.

35. 10
아데노바이러스의 안
전한
사용
1.adv 관
련
실험은 생
물
안
전
2급 시설(bl-2급) 에서 진행되어
야
한다.
2.실험실 코트, 마스크, 장
갑을
완전히 갖추
고
손
과
팔
을
노출하지 않도
록
최선을 다해 주십시오 .
3.바이러스 현
액을
뿌
리지
않도
록
조심하세요 . 만약 생
물
안
전
캐
비닛이
작동 중에 바이러스에 오염되면 , 즉
시
70% 알
코올과
1% sds를 포함한
용
액으로
탁
자
보드를 닦
아라
. 모든 첨
단
, 튜브, 배양
판
, 바이러스와 접
촉하는
매질은 폐
기하기
전에 염소를 함유한 소독
액에
담
그어야
한다.
4.원심분리가 필요하다면 원심분리기 튜브
를
단단히 밀봉
해야
한다. 조
건이
허
용되면
원심분리하기 전에 파
라필름으로
튜브
를
밀봉
합니다
.
5.ADV 관
련
동
물
실험도 bl-2 수
준에서
진행되어
야
한다.
6.ADV와 관
련된
폐
기물은
처리하기 전에 특
별히
수집하고 오토
클레이브해야
한다.
7.실험 후 세정제로 손
을
씻
어라
.
adv의 저
장
및 희석
adv 저
장

바이러스는 수신 후에 사용하기 전에 짧
은
시간 (일주일 미만)에 4 ° c에서 저
장될
수 있
습니다
. ADV 바이러스는 얼
음
-해동에 민감
하며
, 얼
음
-해
동이 반복되면 적
량이
떨
어지기
때
문에
, aliquot 바이러스 재고는 도
착하면
즉
시
-80°C 냉
동고에
보관되어 장기간 사용해
야
한다. ADV 바이러스
가 12개
월
이상 저
장되어
있다면 사용하기 전에 바이러스 적정을 재
검사하는
것이 좋습
니다
.
주: 1. 바이러스 적사
량에
악영향
을
미치는 경우 반복적인 동해주기는 피해
야
한다(동해주기마다 10%-50%의 감
소가
발생한다 ). genemedi는
여러 사용을 위해 -80도에서 직접 저
장할
수 있는 작은 aliquot(200 µl/tube)의 radv 제
품을
제공합니다 .
2. 6개
월
이상 저
장된
바이러스의 경우, 사용 전에 바이러스 적사를 다시 분
석하는
것이 암
시적이다
.
adv 희석
RADV의 냉
동
aliquots를 적절히 해동시
키고
, 바이러스를 -80℃ 냉
동고에서
완전히 녹
을
때
까지
얼
음수욕장으로
옮긴
다
. 녹
으면
적
당량의
무균
pbs나 무
혈청
배양체를 추
가하고
4℃에서 일주일 이상 유지하십시오 .
주의사항
· 환경의 극
단적
인 pH, edta와 같은 킬레이트제 , 온
도
, 유기용매 ,

36. 1110
단백질 변성제, 강
세제
등)
·소용돌이 , 거
품
불
기
또는 유사한 작
업
중 adv 샘
플에
공기를 도입하는 것을 피하십시오 . 이는 단백질
변성을 초래할 수 있다.
·반복적인 냉
동과
해동을 피하세요 .
·액
상에서
장기간 '일반적' 플라스
틱
(특
히
폴
리스티렌이나
소수성 플라스
틱
)에 노출되지 않도
록
하십시
오. 대부분의 adv 바이러스는 매우 끈
적끈적하며
, 파
이프
, 세포 배양 플레이트 , 피
펫
끝
을
포함한 일반 플
라스
틱에
노출되면 손
실이
발생할 수 있다. 냉
동하지
않으면. 실리
콘
또는 낮
은
단백질 결합관에 adv를
저
장하는
것이 가장 좋
다
. Pluronic f-68은 0.01%-0.1%의 배합 완
충기에서
사용되는 일반적인 플라스
틱
을
사용하는 경우 점
착을
최소화합니다 .
·ADV를 저
염용액으로
희석
시키는
것을 피하세요 . 일부 바이러스는 저
염용액에
모여 전염성이 없습
니
다.
참조
참조
1.루오 J. 등이 있다. Adeasy 시스템을 사용하여 재조합 아데노바이러스를 빠르
게
생성하는 프로토콜 나트. 프로토콜 . 2 (5), 1236-1247 (2007).
2.그는. c. 등. 재조합 아데노바이러스를 생성하는 간소화된 시스템 PNAS. 95, 2509-2514 (1998).
3.마이어 O. & 그레
버
U. F. 아데노바이러스 내세포 증발. J. 유전자 메
드
6(Suppl 1), S152-S163(2004).
연
락처
정보
제
네메디
바이오테크
놀로지
Inc.
아데노바이러스에 대한 자세한 내용은 www.genemedi.net/i/adenovirus-packaging 를 참조하십시오 .
genemedi 제
품에
대한 자세한 내용과 pdf 형식의 매
뉴얼을
다
운로드하려면
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사이트

www.genemedi.net 를 방
문하십시오
.
추
가
정보나 기
술
지원을 원하시면 전화하거나 이
메일을
주시기 바
랍니다
.
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© 2018 genemedi 바이오테크
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37. About GeneMedi
GeneMedi specializes in creating superior antibody, protein, and vector-based
bioproducts, revolutionizing diagnostics and biologics solutions.
At GeneMedi, innovation, product integrity, and scalable solutions form the cornerstone of our mission to advance the field
of diagnostics and biologics. Our portfolio of antibodies, proteins, and vector-derived products is built on a foundation of
unparalleled expertise in the following areas:
Innovative Antigen Design and Robust Assay Development
Our strategic focus on biomarkers and target analysis enables the creation of highly specific antigens
and the development of robust assays, ensuring our products achieve superior performance in clinical
and research settings.
Rapid Protein & Antibody Identification: Our proprietary platforms, TAURUS
TM
for accelerated
antibody discovery and LIBRA
TM
for AI-driven protein evolution, are designed to identify and optimize
molecules with optimal stability and functionality.
Cutting-Edge AAV & GCT Discoveries: The G-NEXT
TM
platform is our answer to the industry's
need for innovative AAV vectors, offering improved stability, efficiency, and safety for groundbreaking
gene therapy approaches.
High-Volume Protein & Antibody Manufacturing: Our facilities are equipped to handle large-scale
production of up to 1000L per batch, ensuring high levels of purity and stability through stringent
quality controls.
Advanced Vector Manufacturing Capabilities: In GeneMedi Vector Core (GVC), with a focus on
AAV, Lentivirus, and VLP production up to 200L per batch, we employ sophisticated purification
techniques to guarantee vector efficacy and integrity
Diagnostics: Our diagnostic solutions leverage CLIA, LFA, ELISA and unique POCT platforms for
comprehensive assay validation and clinical sample consistency, setting new standards in diagnostic
accuracy.
Biologics: We specialize in the development of industrial solutions in up/downstream for therapeutic
antibodies, AAV gene therapy, and Cell therapy technologies, ensuring our products and solutions
can improve specificity, potency, and safety in the therapeutic industry.
Streamlined Molecular Discovery with Emphasis on Stability
Scalable Production and Uncompromising Quality
Comprehensive Solutions for Diverse Application Needs
GeneMedi (GM) is dedicated to delivering innovative and scalable biotechnological solutions, driving forward the fields of diagnostics
and therapeutics with confidence and expertise. Contact with GM to reach your reliable industrial partner.
Website: https://www.genemedi.net
Contact Email: [email protected] | [email protected]

38. 1
аденовирус (AdV)
внедрение рекомбинантного аденовируса (rAdV)
Рекомбинантный аденовирус (rAdV) — это аденовирусный вектор с дефектом репликации, который широко
используется для различных целей, включая перенос генов и инженерия, вакцинацию и генную терапию [1,2].
есть несколько преимуществ использования radv в качестве медиатора переноса генов. во-первых, он может
доставлять в клетки и ткани последовательности генов размером до 8 килоосновых (кб) без вставки экзогенного
фрагмента в геном. во-вторых, почти все делящиеся и неделящиеся клетки, первичные клетки и ткани органов
могут трансдуцироваться radv. Кроме того, radv прост в эксплуатации и расширяется в больших масштабах, а
эффективность может достигать 100%. Таким образом, radv играет важную роль в исследованиях генной
инженерии и потенциальном терапевтическом лечении заболеваний.
Наиболее часто используемым аденовирусом является серотип 5 (Ad5) homo sapiens, состоящий из
двухцепочечной линейной молекулы ДНК размером около 36 кб 1. рецепторы и волокна цитоплазматической
мембраны облегчают эндоцитоз аденовируса в цитоплазму клеток, где частицы вируса дальше мигрируют в ядро
клеток для саморепликации с помощью механизма репликации хозяина [3]. После репликации геном вируса
собирается в белковую оболочку и высвобождается из клеток, вызывая лизис клеток [3].
В настоящее время разрабатывается несколько систем упаковки radv, в которых adeasy1 и admax2 являются двумя
наиболее популярными, разделяя общую стратегию, согласно которой целевая последовательность генов
клонируется в челночный вектор, а затем рекомбинируется в вирусный магистральный вектор. ранние единицы
транскрипции вируса e1 и e3 дефектируют в обеих этих системах, в то время как ген e3 не необходим для
репликации вируса1. Таким образом, упаковка radv обычно проводится в клеточных линиях, экспрессирующих
ген e1, таких как hek-293, hek-293a и т. д. [2].
по сравнению с adeasy, система admax относительно проста в обращении и может достичь более высокого титра
вируса во время производства вируса. Этот протокол radv разработан в соответствии с системой admax с
использованием двухвекторной системы, состоящей из вектора шаттла на площадке и магистрального вектора
radv pbhglox (delta) E1-3cre.
обзор протокола
Схематический обзор производства рекомбинантной рекламы показан на рисунке 1. первым шагом является
клонирование интересующего гена (GOI) в соответствующий плазмидный вектор. для большинства приложений
интересующая КДНК клонируется в один из челночных векторов radv. последовательности перевернутого
терминального повторения (ITR), присутствующие в этих векторах, обеспечивают все элементы цис-действия,
необходимые для репликации и упаковки radv.
рекомбинантная экспрессионная плазмида ко-трансфицируется в клетки 293a (клеточная линия, дополняющая E1)
с упаковочной плазмидной пада-bhglox (дельта) E1, E3, которые вместе обеспечивают все факторы транс-
действия, необходимые для репликации и упаковки adv.
мелкие бляшки можно визуализировать под микроскопом через 10-21 день после трансфекции. выберите от трех
до шести отдельных бляшек и сравните их вирусный титр, затем выберите ту с самым высоким титром, чтобы
провести последующие эксперименты по амплификации, концентрации и очистке.

39. бактериальный
штамм
Штамм E. coli dh5ɑиспользуется для усиления челночных и
магистральных векторов.
2
рисунок 1. Блок-схема эксперимента по упаковке adv.
экспериментальные материалы
система упаковки вирусов
Для упаковки рекомбинантного аденовируса (rAdV) в этом протоколе используется двухплазмидная система,
которая включает в себя челночный вектор (pAd), который можно клонировать в инженерные
последовательности для сверхэкспрессии генов, интерференции РНК и нокаутов гена crispr/cas9, и
аденовирус. магистральный вектор (pBHGlox (дельта) E1,3Cre). Для получения дополнительной информации
о том, как выбрать правильный вектор шаттла для различных экспериментальных целей, пожалуйста,
ознакомьтесь с нашим руководством пользователя adv.

40. 3
линия упаковочных ячеек
293a-это упаковочная клеточная линия вируса, которая может облегчить первоначальное производство, амплификацию
и определение титра radv. это адгезивная эпителиально-подобная клеточная линия, экспрессирующая белки e1,
необходимые для репликации аденовируса, и при слиянии вырастает в монослой. Эта клеточная линия, возникшая из
клеточной линии 293 и созданной для анализа бляшек, была идентифицирована как простой в обращении хозяин
трансфекции.
Полная среда для роста 293a представляет собой модифицированную орлиную среду (дмем) дулбекко, дополненную
10% сывороткой крови плода крупного рогатого скота (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина (пен-стреп). для
непрерывной культуры клетки не должны превышать 70% слияния для поддержания надлежащих характеристик.
обычно, начиная с клеточного прохода номер один, оптимальные результаты можно получить в течение 30 проходов.
после достижения лучше начать новую культуру из другого замороженного запаса на случай каких-либо неожиданных
мутаций и нездорового роста. поэтому банкирование собственных замороженных акций 293a очень важно для
обеспечения экспериментальной целостности и преемственности. замерзшие клетки на логарифмической фазе повысят
жизнеспособность после оттаивания.
уведомления:
если клеточная линия загрязнена микоплазмой, чтобы достичь лучшего состояния культивированных клеток, мы
рекомендуем использовать антимикоплазменный реагент генемеди куреплазматм.
линия упаковочных ячеек
Интересный ген
фунт бульон
агар и агароза
канамицин
ампициллин
70 и 100% этаноловый
стерильный pbs
хлорид цезия (CsCl)
хлорный отбеливатель
Гелевые аппараты и источники питания
ДНК шкафы биобезопасности II класса
37 орбитальный
℃
шейкер 37 инкубатор
℃
бактерий 37 , 5%
℃
инкубатор CO2
Конические трубки 15 и 50 мл
Колбы для культивирования тканей
размером 25 и 75 см2 для скребок
клеток
резервуар для жидкого
азота для сухого
льда/метаноловой
ванны
ультрацентрифуга (бекман) или эквивалент с
низкоскоростной центрифугой с качанием с ротором sw28
микроцентрифуга
центрифугационная трубка (толстостенная
поликарбонатная трубка с крышкой) кольцевая подставка и
зажим, шприцы объемом 3 мл и иголки объемом 18 г

41. 4
упаковка и концентрация adv
векторная конструкция adv
перед упаковкой radv гены, представляющие интерес, должны быть построены в челночный вектор radv. Genemedi
также предоставляет различные векторы рекламы с альтернативными промоторами и флуоресцентными метками
(таблица 1). Более того, у genemedi есть множество предварительно сделанных веществ с некоторыми
генетическими инструментами, такими как биосенсоры для обнаружения аутофагического потока аденовируса-lc3
и т. д.
Примечание:
Для быстрого и эффективного построения векторов настоятельно рекомендуется использовать комплект
одноступенчатого клонирования genemedi-cloneasytm (Cat. GM-GC-01/02/03).
трансфекция вирусных плазмид в упаковочные клетки 293a
a.Культура клеток 293a должна быть приготовлена как минимум за день до того, как до трансфекции она
достигает слияния монослойной морфологии 50%-70%.
b.В день трансфекции DMEM необходимо предварительно подогреть в водяной ванне 37 , а реагент для
℃
трансфекции липогенетма должен быть сбалансирован до комнатной температуры и перемешит его перед
использованием.
c.приготовить вирусные плазмиды для каждой реакции с использованием 60 мм тарелки:
таблица 1. Плазмиды и трансфекционные реагенты, необходимые для трансфекции.
компонент, компонент сумма суммы
прокладка челночной плазмиды 2 мкг
pGlox (дельта) E1,3Cre 4 мкг
липогенетм 30 мкл
d.смешайте плазмиды с трансфекционным реагентом в dmem и добавьте капли в предварительно посеянные
клетки 293a. Инкубируйте при 37 , 5% CO2 и освежите полной средой в течение 6 часов.
℃
Примечание:
1.Подробный протокол трансфекционного реагента можно ссылаться на руководство пользователя
трансфекционного реагента genemedi lipogenetm.
2.клетки должны находиться в здоровом состоянии роста для использования до трансфекции.
образование бляшек и сбор клеток
Бляшка представляет собой область однослойных клеток, которые демонстрируют цитопатический эффект при
заражении аденовирусами, обычно наблюдается как круглые, более темные клетки или белые пятна с помощью
микроскопа или невооруженного глаза (рис. 1). важно наблюдать за вирусным

42. 5
бляшки перед сбором трансфекцированных клеток.
a.Для минимизации распространения вируса для лучшего состояния образования вирусных бляшек рекомендуется
добавлять агарозу с низкой температурой плавления в обычную среду с конечной концентрацией 1,25%.
b.мелкие бляшки можно визуализировать под микроскопом через 10-21 день после трансфекции. если инженерная
последовательность в челночной плазмиде несет флуоресцентные метки (gfp или rfp), эффективность трансфекции
можно оценить с помощью флуоресцентной микроскопии перед образованием бляшек.
c.выберите изолированную вирусную бляшку вместе с окружающей агарозой, перенесите в 1 мл свежей среды и
инкубируйте за ночь. как правило, для сравнения их вирусного титра следует выбрать от трех до шести бляшек, а
затем бляшек с самым высоким титром будут переданы в последующие эксперименты.
рисунок 1. идентификация таблички.
Примечание:
первичный раствор агарозы высокой чистоты с низкой температурой плавления может быть приготовлен в
стерильных ПБС до конечной концентрации 5%. Перед использованием полностью расплавите бульон в ванне с
кипятком и постепенно охладите до 45 при комнатной температуре. Разбавьте первичный раствор агарозы с
℃

использованием предварительно разогретой полной среды роста 37 до конечной концентрации 1,25%. немедленно и
℃

аккуратно добавьте хорошо смешанный раствор в клетки с удаленной культуральной средой впереди и поверните,
чтобы равномерно покрыть клетки бляшек. Для тарелки из 6 скважин добавьте 3 мл агароза/среды на скважин.
важно наблюдать за вирусными бляшками перед сбором трансфекцированных клеток. чтобы минимизировать
распространение вируса для лучшего состояния образования вирусных бляшек, рекомендуется добавить агарозу с
низкой температурой плавления в обычную среду, а небольшие бляшки можно визуализировать под микроскопом через
10-21 день после трансфекции. если инженерная последовательность в челночной плазмиде несет флуоресцентные
метки (gfp или rfp), эффективность трансфекции можно оценить с помощью флуоресцентной микроскопии перед
образованием бляшек.
амплификация вируса
a.на следующий день добавьте вирусосодержащий супернатант в свежие, предварительно посеянные клетки 293a для
амплификации вируса.
b.собирать клетки и супернатант при наблюдении за образованием бляшек и переходить в цикл замораживания-
оттаивания 3 раза, прежде чем собирать все вирусы.

43. 6
c.собранный вирус признается пассажиром 1 (вирус p1). затем заразите свежие клетки 293а вирусом p1.
d.выполнять цикл сбора инфекции три раза до получения вируса p4 и расширять производство вируса в
крупномасштабных масштабах за счет инфекции вирусом p4. при наблюдении образования бляшек
вирусы собираются для очистки и концентрации.
Примечание:
1.используйте клеточный скребок вместо трипсинизации для отделения клеток. собранные клетки
должны центрифугироваться при 500 г, 4 в течение 10 минут. Выбросьте наибольшее количество
℃

супернатанта и оставьте 2 мл для повторной суспензии клеточных гранул и перенесите в контейнер при
температуре ниже -80 ° C (с использованием сухого льда или жидкого азота) для заморозки и
оттаивания.
2.Когда вирусная суспензия полностью растает, немедленно удалите из ванны 37 в случае какого-либо
℃

снижения титра вируса. сильно встряхните полностью расплавленную подвеску в течение 30 секунд.
обычно двух-четыре раунда цикла замораживания-оттаивания могут улучшить выход вирусов с
высоким титром.
3.После циклов замораживания-оттаивания вирусный лизит можно центрифугировать при 500 г, 4 в
℃

течение 10 минут для удаления клеточных обломков и хранить при -80 для последующего
℃

использования.
очистка вируса
Процесс очистки radv состоит из трех этапов: конденсации peg8000, центрифугирования с градиентом
плотности cscl и диализа. Подробный процесс работы следующий:
a.оттаивание: удалите вирус от -80 градусов за день и расплавьте в водяной ванне при комнатной
температуре. Центрифуги при 7000 г, 4 в течение 10 минут и соберите супернатант.
℃
b.Конденсация peg8000: добавьте 50 мл раствора peg8000 (20% peg8000 в сверхчистой воде с 2,5 м nacl) на
100 мл супернатанта, поместите на льд в течение 1 часа, чтобы вытянуть вирус (время инкубации на льду
может быть относительно продлено). Центрифугируйте смесь при 7000 г, 4 в течение 20 минут,
℃

выбрасывайте супернатант и повторно суспендируйте вирусные гранулы в 10 мл раствора cscl с
плотностью 1,10 г/мл (растворитель cscl составляет 20 мм три-гкл, ph8,0, пожалуйста, см. следующий
способ приготовления раствора cscl в таблице 2). раствор cscl, содержащий вирус, должен быть розовым
(рисунок 2).
таблица 2. Приготовление раствора cscl.
плотность при 20
℃

(г/мл)
концентрация (мл/мл)Количество cscl (g)конечный объем (мл)
1.40 548.3 5.483 10
1.30 402.4 4.024 10
1.20 143.8 1.438 10
c.Центрофугация с градиентом плотности cscl: поместите 2 мл раствора cscl 1,40 г/мл на дно
центрифужной трубки, затем медленно добавьте 3 мл раствора cscl 1,30 г/мл на первый слой, затем
добавьте 5 мл вирусной суспензии. центрифуга с ротором Beckman sw28 при 26 000 об/мин, 4 в
℃

течение 2 часов.

44. 7
рисунок 2. Процесс центрифугирования с градиентом
плотности cscl. Левая панель: градиент cscl перед
ультрацентрифугированием. Правая панель: градиент cscl
после ультрацентрифугирования.
d.Сбор вируса: соберите вирусную полосу между слоями от 1,30 г/мл до 1,40 г/мл шприцом и перенесите в
диализный мешок.
Примечание:
Диализный мешок следует варить в 10 мм edta-na2 в течение 10 минут и охладить до комнатной температуры перед использованием.
e.Диализ: поместите диализный мешок с вирусом в диализный буфер (50 г сахарозы, 10 мл 1 м трис-гкл, ph 8,0, 2 мл
1 м мгкл 2, добавьте до 1 л дистиллированной водой) и перемешайте при 4 ° C за ночь. Во время диализа замените
свежий буфер один раз.
f.формула: соберите вирус из мешка, регулируйте объем до 500 мкл с помощью pbs и определите титр. Очищенный
radv должен храниться в температуре 4 ° C не более недели или в -80 ° C для длительного хранения.
титрение очищенного RADV
Методом определения титра radv является анализ бляшек. Единица образования бляшек (PFU) представляет собой
количество бляшек, вызванных определенным объемом вируса, и представляет собой концентрацию активных вирусных
частиц.
Анализ бляшек radv:
a.пластинка 293а ячеек в 60-мм тарелках не менее чем за день.
b.когда слияние клеток достигает примерно. 100%, добавьте разбавленный вирус в различных концентрациях и
инкубируйте при 37 .
℃
c.Через 4-8 часов после заражения покрывайте клетки 8 мл раствора агарозы с низкой температурой плавления (10%
FBS, 1,25% агарозы).

45. 8
г. рассчитать титр radv путем подсчета количества бляшек за 9-11 дней культивирования.
Примечание:
титр radv также можно определить путем наблюдения флуоресценции, когда это применимо, или с
помощью метода вестерн-блотинга (WB), иммунофлуоресценции (IF) и иммуногистохимического
обнаружения (IHC) на уровне экспрессии генов-мишеней.
трансдукция целевых клеток
поскольку мои варьируются в разных линиях клеток, предварительный эксперимент необходим для
обеспечения правильного мои клеток-мишеней перед проведением формальных экспериментов.
Примечание:
MOI: множество инфекций — это количество вирусных частиц, заражающих одну клетку. Настоятельно
рекомендуется оптимизировать тест мои, поскольку на настоящий мои определенных клеток могут
влиять операции и методы борьбы с вирусами в разных лабораториях.
клеточная подготовка
пластины прочные клетки-мишени в пластины с 24 скважинами с плотностью 1 x 105/мл.
Примечание:
количество посаженных клеток зависит от скорости роста соответствующей клеточной линии. Слияние
от 50% до 70% должно быть достигнуто на следующий день.
РАДВ МОИ ТЕСТ
приготовьте вирус в 10-кратном градиенте разбавления и убедитесь, что мои находится в диапазоне от 3 до
1000.
день 0: клетки-мишени пластины в хорошем состоянии с плотностью 1 x 105/мл в пластины с 96
скважинами, 100 мкл на скважину. Инкубируйте при 37 за ночь.
℃
день 1: приготовьте вирус в градиенте шести мой и разбавьте соответствующее количество суспензии вируса
в полной среде культуры клетки-мишени до конечного объема 100 мкл (установление мой = 3, 10, 30, 100,
300, 1000). Добавьте разбавленный вирус в предсеянные клетки и инкубируйте в течение 4-8 часов при 37
, затем освежите среду для удаления вируса.
℃
день 3: обнаружить флуоресценцию с помощью микроскопа. Рассчитайте мои на основе соотношения
флуоресцентных ячеек.
Примечание:
если вирус не помечен флуоресценцией, moi можно определять с помощью qpcr, WB, IF, IHC и т. д.

46. 9
преобразовательная передача
приготовьте вирус в 10-кратном градиенте разбавления и убедитесь, что мои находится в диапазоне от 3 до 1000.
a.Для адгезивных клеток:
Radvs, содержащие ген-мишень и одинаковое количество контрольных вирусов, должны быть добавлены
отдельно в две группы клеток и хорошо смешаны. Количество используемых вирусов зависит от размера
контейнера, описанного в следующей таблице. для теста мои в большинстве типов клеток достаточно градиента
от 3, 10, 30, 100, 300 до 1000 при трех повторениях. обновление среды за 4-8 часов. Интересный белок можно
обнаружить в течение 48–72 часов с помощью флуоресцентной микроскопии, WB и т. д.
таблица 3. количества вирусов в разных размерах контейнера.
Площадь
размер контейнераповерхности (см2)
объем среды
объем вирусов
96-скважин 0.3 100 мкл 0,1-0,5 мкл
24-квадратный 2 500 мкл 1-3 мкл
12-скважин 4 1 мл 2-5 мкл
6-квадратный 10 2 мл



5-20 мкл
например: если уровень radv составляет 5 × 1011 рфу/мл, разбавьте до 5 × 1010 рфу/мл (в 10 раз) с полной
средой для роста клеток-мишеней. когда в одном скважине 1 × 105 клеток, а мои составляет 1000, требуемый
объем разбавленного вируса (5 × 1010 рфу/мл) должен быть (количество клеток) × (мои) ÷ (рфу/мл radv) = 1 ×
105 × 1000/5 × 1010 (мл) = 2 мкл. Таким образом, в эту скважину следует добавить 2 мкл разбавленного вируса.
Примечание:
Отходы должны быть утилизированы в соответствии с процедурами, описанными в разделе требований
биобезопасности.
b.Для суспензионных клеток:
спиновая инфекция является достаточным способом трансдукции суспензионных или полусуспензионных клеток.
Короче говоря, запечатайте пластину для культивирования клеток парапленкой после добавления вирусов,
вращайтесь в низкоскоростной центрифуге с качающимся ведром при 200 г в течение 1 часа при 37 и℃
культивируйте клетки при 37 за ночь. Средство должно быть обновлено на следующий день.℃
если условие не допускается для спиновой инфекции, вместо этого можно использовать центрифужную трубку
путем переноса клеток в трубку и центрифуги на низкой скорости. выбросить большую часть супернатанта после
центрифугирования, добавить вирусы и инкубировать при комнатной температуре в течение 15-30 минут. затем
перенесите смесь клеток и вируса в соответствующий контейнер и культивируйте при 37 за ночь. Средства℃
должны быть заменены на следующий день.
определить эффективность передачи
Через 48 до 72 часов после трансдукции флуоресцентные белки можно наблюдать, когда это применимо, и
изменения в гене-мишени могут анализироваться на уровне mrna с помощью qpcr или на уровне белка с помощью
вестерн-блота (WB).

47. 10
безопасное использование аденовируса (AdV)
1.Эксперименты, связанные с adv, должны проводиться на объектах уровня биобезопасности 2 (уровень bl-2).
2.пожалуйста, полностью оснастите лабораторное пальто, маску, перчатки и старайтесь избежать обнажения рук и рук.
3.Будьте осторожны, чтобы брызгать вирусную суспензию. Если шкаф биобезопасности заражен вирусом во время
эксплуатации, немедленно вытерьте стол раствором, содержащим 70% спирта и 1% SDS. Перед утилизацией все
наконечники, трубки, культуральные пластины, контактные среды вируса должны быть замочены хлорсодержащим
дезинфицирующим раствором.
4.Если необходимо центрифугировать, трубка центрифуги должна быть плотно герметизирована. Если позволяют
условия, закройте трубку парапленкой перед центрифугом.
5.Эксперименты на животных, связанные с adv, также должны проводиться на уровне bl-2.
6.Отходы, связанные с adv, должны быть специально собраны и автоклавированы перед утилизацией.
7.После эксперимента мыть руки дезинфицирующим средством.
хранение и разбавление adv
хранение рекламы
Вирус может храниться при температуре 4 ° C в течение короткого времени (менее недели), прежде чем его
использовать после приема. Поскольку вирусы ADV чувствительны к замораживанию-оттаиванию, а титр снижается
при повторном замораживании-оттаивании, аликот вирусный запас должен храниться при морозильной камере -80 ° C
сразу по прибытии для длительного использования. в то время как перед использованием рекомендуется повторное
обнаружение титра вируса, если вирусы adv хранятся более 12 месяцев.
примечание: 1. Необходимо избегать повторных циклов замораживания-оттаивания в случае возникновения побочного
эффекта на титр вируса (за каждый цикл замораживания-оттаивания произойдет снижение на 10–50%). Genemedi
предоставит продукты RADV в небольших аликвотах (200 мкл/трубка), которые можно хранить непосредственно в
температуре -80 градусов для многократного использования.
2. Для вирусов, хранящихся более 6 месяцев, рекомендуется повторный анализ титра вируса перед использованием.
разбавление adv
Чтобы правильно разморозить замороженные аликвоты RADV, перенесите вирус из морозильной камеры -80 ° C в
ванну с ледяной водой до полного растопления. При расплавлении добавьте соответствующее количество стерильного
PBS или среды без сыворотки и храните в температуре 4 не более недели.℃
меры предосторожности
· Избегайте воздействия ADV экстремальных условий окружающей среды (pH, хелатирующие агенты, такие как edta,
температура, органические растворители,

48. 1110
денатуранты белка, сильные моющие средства и т. д.)
·Избегайте ввода воздуха в образцы adv во время вихревого, пузырькового дувания или аналогичных
операций, что может привести к денатурации белка.
·Избегайте повторного замораживания и оттаивания.
·избегайте воздействия «обычных» пластиков (особенно полистирола или гидрофобных пластиков) в
течение длительного периода времени в жидкой фазе. большинство вирусов ADV очень липкие, и потеря
может возникнуть при воздействии обычного пластика, включая трубки, пластины для культивирования
клеток, кончики пипетки, если они не заморожены. Лучше всего хранить adv в силиконизированных или
низкобелковых связывающих трубках. Плюроник f-68, используемый при 0,01%-0,1% в буфере для
формулы, минимизирует приклеивание при использовании обычного пластика.
·Избегайте разбавления adv в раствор с низким содержанием соли. некоторые вирусы собираются в
низкосолевом растворе, который будет неинфекционным.
Ссылка на
Ссылка на
1.Луо Дж. и др. протокол для быстрой генерации рекомбинантных аденовирусов с использованием системы adeasy. Нат. протоколы. 2 (5), 1236-1247
(2007).
2.он. с. и др. упрощенная система генерации рекомбинантных аденовирусов. Пнас. 95, 2509-2514 (1998).
3.Майер О. Дж. Ген Мед. 6 (дополнение 1), s152–s163 (2004).
контактная информация
генемеди биотехнология. Инк.
Для получения дополнительной информации об аденовирусе посетите: www.genemedi.net/i/adenovirus-
packaging
Для получения дополнительной информации о продуктах genemedi и загрузки руководств в формате PDF
посетите наш веб-сайт: www. genemedi.net
Для получения дополнительной информации или технической помощи позвоните или напишите нам.
по всему миру: 86-21-
50478399 факс: 86-21-
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49. About GeneMedi
GeneMedi specializes in creating superior antibody, protein, and vector-based
bioproducts, revolutionizing diagnostics and biologics solutions.
At GeneMedi, innovation, product integrity, and scalable solutions form the cornerstone of our mission to advance the field
of diagnostics and biologics. Our portfolio of antibodies, proteins, and vector-derived products is built on a foundation of
unparalleled expertise in the following areas:
Innovative Antigen Design and Robust Assay Development
Our strategic focus on biomarkers and target analysis enables the creation of highly specific antigens
and the development of robust assays, ensuring our products achieve superior performance in clinical
and research settings.
Rapid Protein & Antibody Identification: Our proprietary platforms, TAURUS
TM
for accelerated
antibody discovery and LIBRA
TM
for AI-driven protein evolution, are designed to identify and optimize
molecules with optimal stability and functionality.
Cutting-Edge AAV & GCT Discoveries: The G-NEXT
TM
platform is our answer to the industry's
need for innovative AAV vectors, offering improved stability, efficiency, and safety for groundbreaking
gene therapy approaches.
High-Volume Protein & Antibody Manufacturing: Our facilities are equipped to handle large-scale
production of up to 1000L per batch, ensuring high levels of purity and stability through stringent
quality controls.
Advanced Vector Manufacturing Capabilities: In GeneMedi Vector Core (GVC), with a focus on
AAV, Lentivirus, and VLP production up to 200L per batch, we employ sophisticated purification
techniques to guarantee vector efficacy and integrity
Diagnostics: Our diagnostic solutions leverage CLIA, LFA, ELISA and unique POCT platforms for
comprehensive assay validation and clinical sample consistency, setting new standards in diagnostic
accuracy.
Biologics: We specialize in the development of industrial solutions in up/downstream for therapeutic
antibodies, AAV gene therapy, and Cell therapy technologies, ensuring our products and solutions
can improve specificity, potency, and safety in the therapeutic industry.
Streamlined Molecular Discovery with Emphasis on Stability
Scalable Production and Uncompromising Quality
Comprehensive Solutions for Diverse Application Needs
GeneMedi (GM) is dedicated to delivering innovative and scalable biotechnological solutions, driving forward the fields of diagnostics
and therapeutics with confidence and expertise. Contact with GM to reach your reliable industrial partner.
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