HbA1c : glycosylated hemoglobin

A presentation to physicians on using Hba1c in clinical practice.

1. Glycosylated hemoglobin HbA1c
Mathew JohnMD, DM, DNB 
Endocrinologist 
Providence Endocrine & Diabetes 
Specialty Centre

2. Some terms
• A1c : Glycated hemoglobin = glycosylated
hemoglobin= glycohemoglobin(US)
•
IFCC
: 
International Federation of Clinical Chemistry
•
IFCC
: 
International Federation of Clinical Chemistry
• NGSP: National Glycohemoglobin Standardisation 
Programme
• DCCT : Diabetes Control and Complications Trial
• ADAG : A1c derived average glucose

3. Hemoglobin
HbA0(α2ß2)
90 % 
HbA2(α2δ2)
HbF(α2γ2)
Non ezymatically glycosylated form of human 
hemoglobin, taking place under physiological 
conditions, at a specific site on the protein
HbA1
HbA1c 

4. Terminology
• Hb: hemoglobin 
• HbA1: is a series of glycated variants resulting f rom 
attachment of various carbohydratesto N terminal  valine
of 
Hb
valine
of 
Hb
• Glycation results in increased negative charge and  hence 
runs fast on electrophoresis systems
Pickup & Williams , Textbook of Diabetes

5. GHb: glycated hemoglobin
1. HbA1a1: fructose 1,6 diphosphate N terminal valin e
2. HbA1a2: glucose 6 phosphate N terminal valine
3. HbA1b: unknown carbohydrate N terminal valine
4.
HbA1c: (60
-
80%): attachment of glucose to N 
4.
HbA1c: (60
-
80%): attachment of glucose to N 
terminal amino acid valine of the beta chain of 
hemoglobin Total glycated Hb: HbA1c+ sugar Non N terminal sites 

6. Amadori rearrangement of glucose 
molecule.

7. Relationship of HbA
1Cto Risk of 
Microvascular Complications
Relative Risk (%)
Retinopathy
Nephropathy
Neuropathy
15
13
11
Diabetes Control and Complications Trial
(DCCT)
Skyler JS. Endocrinol Metab Clin North Am. 1996;25: 243-254. 
Relative Risk (%)
Neuropathy Microalbuminuria
HbA
1C(%)
11
9
7
5
3
1
6 7 8 9 10 11 12

8. Factors affecting HbA1c 
Falsely elevated values
• HbF or HbG 
• Uremia ( BUN > 85 mg/dl) 
• Hypertriglyceridemia( cation exchange +, EP-) 
• Alcohol
• High bilirubin( cation exchange+, HPLC+) 
• Aspirin 
• Splenectomy, Aplastic anemia

9. Factors affecting HbA1c
Falsely low HbA1c
• HbC, HbS
• Hemolytic anemias
• Pregnancy
•
Acute/ Chronic blood loss
•
Acute/ Chronic blood loss
• Vitamin E/C 
• Dapsone
• Severe nephropathy ( shorten RBC survival) 
Glycated hemoglobin monitoring BMJ 2006 ; 333;586-8

10. Age specific targets 
Age  HbA1c target 
<6 years  7.5 –8.5 % 
6
-
12 years 
< 8%
Silverstein J, Diabetes Care; 28;2005
6
-
12 years 
< 8%
13-19 years  <7.5 % 

11. Current HbA1c recommendations 
Normal IDF ADA AACE
A1c*<6% <6.5% <7% <6.5%
Preprandial
<100
<110
90
-
130
<110
Preprandial
<100
<110
90
-
130
<110
Postprandial <140 <155 <180 <140

12. What does HbA1c represent ? 

13. Patients with variable diurnal profiles 
can have the same A1c
Roger Mazze DIABETES TECHNOLOGY & THERAPEUTICS
Volume 10, Supplement 1, 2008

14. Relationship between FPG, PPG 
and HbA1c
Contribution (%)
60
80
Postprandial
Fasting Hyperglycemia
HbA
1cquintiles
Contribution (%)
(<7.3) (7.3-8.4) (8.5-9.2) (9.3-10.2) (>10.2)
0
20
40
1 2 3 4 5
Monnier L, Diabetes Care 2003;26

15. ADAG study 
A1c Derived Average Glucose 
• Define the mathematical relationship between A1c and 
average glucose levels 
• 507 subjects : 268 with type 1 diabetes, 159 with  type 2 
diabetes and 80 non diabetic subjects  diabetes and 80 non diabetic subjects 
• A1c at end of 3 months compared with average glucose 
during the previous 3 months
• From 2 day CGMS 4 times+7 point SMBG 3 times/week 
Nathan D Diabetes Care 31:1-6, 2008

16. ADAG study
• Approx 2700 values/subject in 3 months
• Linear regression analysis between A1c and AG 
values provided the tightest correlations
AG 
(mg/dl) =
28.7X  A1C
-
46.7
( 
R
2  0.84, 
P 
0.0001)
AG 
(mg/dl) =
28.7X  A1C
-
46.7
( 
R
2  0.84, 
P 
0.0001)

17. ADAG study 
mg/dl   mmol/L
Estimated average glucose ( e AG) 
DCCT
Nathan D Diabetes Care 31:1-6, 2008
135 
170
205
240
275
310

18. Hba1c represents more recent 
sugars 

19. Mean blood sugars vs. ADAG 
ADAG
ADAG : A1c Derived Average Glucose
ADAG MBG

20. Methods of measuring HbA1c
• Ion exchange chromatography : low pressure 
HPLC
• Electrophoretic methods
• Immunoturbimetric methods
•
Affinity methods
•
Affinity methods
• Chemical methods: e.g thiobarbituric method
• Electrospray iontophoresis
• Mass spectroscopy
• Reversed phase HPLC

21. Can we use HbA1c for diagnosis 
of diabetes ?  

22. Cut offs
Fasting plasma glucose cut offs for definition of IGT and DM 
Normal IGT Type 2 diabetes
100 mg/dl 126 mg/dl

23. Diagnosis of diabetes
• Diagnosis of diabetes has always been glucose centric
: based on FBS, 2 hr post glucose , RBS 
• National Diabetes Data Group (NDDG) 1979 : relied on 
distributions of glucose levels distributions of glucose levels
• Based on their association with decompensation
to “overt” or symptomatic diabetes
FPG > 140 mg/dl 
PPG > 200 mg/dl 

24. 1997
1997, the Expert Committee on the Diagnosis and 
Classification of Diabetes Mellitus refocused atten tion on 
the relationship between glucose levels and the pre sence 
of long-term complications as the basis for diagnos is of 
diabetes  diabetes 
The Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Report of the Expert 
Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care 1997;20:1183–
1197

25. Expert Committee on the Diagnosis and 
Classification of Diabetes Mellitus
Committee recommended that the FPG cut point be 
lowered to 126 mg/dl (7.0 mmol/l)so that this cut 
point would
• Represent a degree of hyperglycemia that was “similar” 
to the 2HPG value and diagnosis with either measure   to the 2HPG value and diagnosis with either measure   would result in a similar prevalence of diabetes in  the
population
• Introduced the concept of IFG and IGT 
The Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Report of the Expert 
Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care 1997;20:1183–
1197

26. Pathophysiologic cut offs
Looked at 3 studies which compared glycemia to risk  of 
retinopathy 
• Egyptian population (
n 
1,018)
• Pima Indians (
n 
960), 
•
U.S. National Health and Nutrition Examination Surv ey
•
U.S. National Health and Nutrition Examination Surv ey (NHANES) population (
n 
2,821)

27. FPG/PPG /HbA1c vs. Retinopathy
U.S. National Health and Nutrition Examination Survey
(NHANES) population (n 2,821)

28. Current use of HbA1c
• Monitor long term glycemic control
• Adjust therapy
• Assess the quality of diabetes care
• Predict the risk for the development of complicati ons

29. HbA1c for diagnosis of diabetes
• HbA1c correlates with retinopathy 
• There was a stronger correlation between A1C and
retinopathy than between fasting glucose levels and  
retinopathy
•
Similar correlation between A1c and Retinopathy has  
•
Similar correlation between A1c and Retinopathy has   been seen in DCCT/ UKPDS trials
• 1997 Expert Committee recommended against using
A1C values for diagnosis in part because of the  lack of 
assay standardization

30. 2009 :International Expert Committee Report on
the Role of the A1C Assay in the Diagnosis
of Diabetes
DIABETES CARE, VOLUME 32, NUMBER 7, JULY 2009
Recommends that HbA1c be adopted as one of the 
diagnostic criteria for diabetes 

31. What has happened between 
2003 and 2009 ?
Advances in instrumentation and standardization, 
the accuracy and precision of A1C assays at least 
match those of glucose assays
International Expert Committee Report on the Role o f the A1C Assay in the Diagnosis of Diabetes. DIABE TES CARE, 
VOLUME 32, NUMBER 7, JULY 2009

32. New reference standards
• International Federation of Clinical Chemistry(IFC C)
• Measures “ pure” A1c 
• Pure A1c: N-[1deoxylfructos-1-yl]) hemoglobin beta
chain, abbreviated as DOF hemoglobin 
•
Expressed as mmol/mol of 
Hb
•
Expressed as mmol/mol of 
Hb
• HbA1c of 5%would now be about 33 mmol/mol, and an 
8% A1C would be about58 mmol/mol. 

33. Pitfalls with glucose measurement
• The measurement of glucose itself is less accurate
and precise than most clinicians realize
• 41% of instruments have a significant bias from th e     
reference method that would result in potential       reference method that would result in potential       misclassification of 12% of patients
• Potential preanalytic errors owing to sample handl ing
• Lability of glucose in the collection tube at room  
temperature
International Expert Committee Report on the Role o f the A1C Assay in the Diagnosis
of Diabetes. DIABETES CARE, VOLUME 32, NUMBER 7, JULY 2009

34. Advantages of HbA1c
• HbA1c is stable after collection 
• New reference method to calibrate all A1C assay 
instruments should further improve A1C assay 
standardization in most of the world between- and 
within
-
subject
within
-
subject
• Coefficients of variation have been shown to be 
substantially lower for A1C than for glucose 
measurements 
• The variability of A1C values is also considerably  less 
than that of FPG levels, with day-to-day within-per son 
variance of 2% for A1C but 12–15% for FPG
International Expert Committee Report on the Role o f the A1C Assay in the Diagnosis
of Diabetes. DIABETES CARE, VOLUME 32, NUMBER 7, JULY 2009

35. Advantages of HbA1c
• Convenience for the patient and ease of sample
collection for A1C testing
• Relatively unaffected by acute (e.g., stress or il lness 
related) perturbations in glucose levels
International Expert Committee Report on the Role o f the A1C Assay in the Diagnosis
of Diabetes. DIABETES CARE, VOLUME 32, NUMBER 7, JULY 2009

36. Cut off of HbA1c for diagnosis of 
diabetes 
• Cut offs at which the prevalence of retinopathy in creases
• NHANES data and DETECT 2 study  

37. DETECT 2 study
Prevalence of retinopathy by 0.5% intervals and severity of retinopathy in participants aged 20–79 years. NPDR, nonp roliferative
diabetic retinopathy. Adapted with permission from (S. C., personal communication).
19,000 subjects from nine countries 
The glycemic level at which the prevalence of “any”  retinopathy begins to rise above 
background levels and for the more diabetes-specifi c “moderate” retinopathy, was 
6.5% when the data were examined in 0.5% increments

38. Cut off of HbA1c
• A1C level of 6.5%is sufficiently sensitive and specific 
to identify individuals who are at risk for develop ing
retinopathy and who should be diagnosed as diabetic
•
A1C level is at least as predictive as the current  FPG and
•
A1C level is at least as predictive as the current  FPG and
2HPG values.

39. Should we use of HbA1c to 
diagnose diabetes 
in our set up ?
diagnose diabetes 
in our set up ?

40. Limitations
•Cost may preclude routine use 
FBS + PPBS: Rs. 60/ -
HbA1c : Rs. 275/ -
•Standardized methods and instrumentation
POC instruments  POC instruments 
•Hemoglobin variants
• Any condition that changes red cell turnover, such as 
hemolytic anemia, chronic malaria, major blood loss , or 
blood transfusions
•A1C levels appear to increase with age

41. Limitations
•Discordance with standard diagnostic criteria 
• The prevalence of diabetes in some populations 
may not  be the samewhen diagnosis is based on 
A1C compared with diagnosis with glucose  A1C compared with diagnosis with glucose  measurements, and one method may identify different 
individuals than the other. 
•Ethnic variations in HbA1c at same glucose levels exists 

42. “ Prediabetes”
• Once A1c is used to diagnose diabetes, “ prediabet es” or 
IGT/ IFG may be obsolete 
• HbA1c between 6 and 6. 5 % :
higher risk for developing diabetes  higher risk for developing diabetes  more effective interventions 

43. Practical considerations
• POC instruments are not to be used to make this 
diagnosis  • Always confirm using the same tests 
• Intermethod variability is reported to still be a  potential
source of inaccuracy

44. Point of care instruments 
• DCA Vantage 
• Nycocard
• In2it (BioRad) 
• A1cNow( Bayer) 

45. Methods for HbA1c
The better and best 
HPLC
Electrospray iontophoresis
Mass spectrometry 
•Point of care ( POC) 
Instruments 
•Colorimetry
Immunoassay
methods 
CV 5-6 % 
HPLC CV : 2-3 %  

46. BioRad D10 
• A1C quantitation in the presence of HbS, 
HbC and HbF
• Optimized to minimize interference from 
carbamylation, lipemia and labile A1C
• Traceable to the IFCC reference method
• NGSP Certified

47. • HbA1c and mean glucose corroborate abnormal glucose 
metabolism, but it requires self monitoring ( or CG MS) to 
detect the location and magnitude of the abnormalit ies
Words of wisdom 
• HbA1c and SMBG should be considered together, with 
each complementing the information provided by the 
other  
Peacock I J Clin Path 1984

48. HbA1c for all patients ? 
On Metformin 1000 mg/day
Added Glimiperide 
2 mg/day
Started 
Glargine 14 
units/day 
1 month 
HbA1c 
1000 mg/day
units/day 
3 months 

49. HbA1c for all patients ?  
Glargine  dose
18 units/day 
HbA1c 
Glargine 14 units/day 
Metformin
1000 mg/day
Glimiperide 2 mg/day
HbA1c 

50. 2010 Consensus Statement on the Worldwide 
Standardization of the HbA1C Measurement
• HbA1c test results should be standardized worldwid e
• The IFCC reference system for HbA1c represents the 
only valid anchor to implement standardization
• HbA1c results are to be reported by clinical labor atories 
worldwide in SI units (mmol/mol, no decimals) and 
derived NGSP units (%, one decimal)
DIABETES CARE, VOLUME 33, NUMBER 8, AUGUST 2010

51. Name: Kuttapan J, 45 yrs Male
HbA1c: 8.0% ( Biorad D10 variant 1
1
)
High Commission Labs Pvt Ltd, High Commission Labs Pvt Ltd, High Commission Labs Pvt Ltd, High Commission Labs Pvt Ltd,
69, Park Road, NY
eAG
2
: 183 mg/dl
IFCC HbA1c
3
: 58mmol/mol
1.Biorad D10 is a DCCT aligned method 
2.e AG are derived from ADAG study by Nathan et al. Nathan D Diabetes Care 31:1-6, 2008
3.IFCC A1c is estimated from a regression equation  . From Jeppsson J-O, Clin Chem Lab Med 
2002;40:78-8 

52. Thank you