Histone Modifications In Therapy Pedro Castelobranco Carmen Jeronimo
aviahknorrtv
8 views
86 slides
May 20, 2025
Slide 1 of 86
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
About This Presentation
Histone Modifications In Therapy Pedro Castelobranco Carmen Jeronimo
Histone Modifications In Therapy Pedro Castelobranco Carmen Jeronimo
Histone Modifications In Therapy Pedro Castelobranco Carmen Jeronimo
Slide Content
Histone Modifications In Therapy Pedro
Castelobranco Carmen Jeronimo download
https://ebookbell.com/product/histone-modifications-in-therapy-
pedro-castelobranco-carmen-jeronimo-50490320
Explore and download more ebooks at ebookbell.com
Castelobranco Carmen Jeronimo download
https://ebookbell.com/product/histone-modifications-in-therapy-
pedro-castelobranco-carmen-jeronimo-50490320
Explore and download more ebooks at ebookbell.com
Here are some recommended products that we believe you will be
interested in. You can click the link to download.
Gut Microbiota As Important Mediator Between Diet And Dna Methylation
And Histone Modifications In The Host Patrizia Daquila
https://ebookbell.com/product/gut-microbiota-as-important-mediator-
between-diet-and-dna-methylation-and-histone-modifications-in-the-
host-patrizia-daquila-10717136
Crosstalk Between Dna Methylation And Histone Modifications Garwin
Pichler
https://ebookbell.com/product/crosstalk-between-dna-methylation-and-
histone-modifications-garwin-pichler-58622488
Histone Methyltransferases 1st Raphael Margueron Daniel Holoch
https://ebookbell.com/product/histone-methyltransferases-1st-raphael-
margueron-daniel-holoch-50584692
Histone Deacetylases Transcriptional Regulation And Other Cellular
Functions Cancer Drug Discovery And Development 1st Edition Eric
Verdin
https://ebookbell.com/product/histone-deacetylases-transcriptional-
regulation-and-other-cellular-functions-cancer-drug-discovery-and-
development-1st-edition-eric-verdin-2091240
interested in. You can click the link to download.
Gut Microbiota As Important Mediator Between Diet And Dna Methylation
And Histone Modifications In The Host Patrizia Daquila
https://ebookbell.com/product/gut-microbiota-as-important-mediator-
between-diet-and-dna-methylation-and-histone-modifications-in-the-
host-patrizia-daquila-10717136
Crosstalk Between Dna Methylation And Histone Modifications Garwin
Pichler
https://ebookbell.com/product/crosstalk-between-dna-methylation-and-
histone-modifications-garwin-pichler-58622488
Histone Methyltransferases 1st Raphael Margueron Daniel Holoch
https://ebookbell.com/product/histone-methyltransferases-1st-raphael-
margueron-daniel-holoch-50584692
Histone Deacetylases Transcriptional Regulation And Other Cellular
Functions Cancer Drug Discovery And Development 1st Edition Eric
Verdin
https://ebookbell.com/product/histone-deacetylases-transcriptional-
regulation-and-other-cellular-functions-cancer-drug-discovery-and-
development-1st-edition-eric-verdin-2091240
Histone Mutations And Cancer Dong Fang Junhong Han
https://ebookbell.com/product/histone-mutations-and-cancer-dong-fang-
junhong-han-22129948
Histone Deacetylase Inhibitors In Combinatorial Anticancer Therapy 1st
Ed Shabir Ahmad Ganai
https://ebookbell.com/product/histone-deacetylase-inhibitors-in-
combinatorial-anticancer-therapy-1st-ed-shabir-ahmad-ganai-22473854
Histone Deacetylases The Biology And Clinical Implication 1st Edition
Juliette Adjo Aka
https://ebookbell.com/product/histone-deacetylases-the-biology-and-
clinical-implication-1st-edition-juliette-adjo-aka-2452562
Histone Deacetylase Inhibitors As Cancer Therapeutics Steven Grant Eds
https://ebookbell.com/product/histone-deacetylase-inhibitors-as-
cancer-therapeutics-steven-grant-eds-4423024
Histone Recognition 1st Edition Mingming Zhou Eds
https://ebookbell.com/product/histone-recognition-1st-edition-
mingming-zhou-eds-5141246
https://ebookbell.com/product/histone-mutations-and-cancer-dong-fang-
junhong-han-22129948
Histone Deacetylase Inhibitors In Combinatorial Anticancer Therapy 1st
Ed Shabir Ahmad Ganai
https://ebookbell.com/product/histone-deacetylase-inhibitors-in-
combinatorial-anticancer-therapy-1st-ed-shabir-ahmad-ganai-22473854
Histone Deacetylases The Biology And Clinical Implication 1st Edition
Juliette Adjo Aka
https://ebookbell.com/product/histone-deacetylases-the-biology-and-
clinical-implication-1st-edition-juliette-adjo-aka-2452562
Histone Deacetylase Inhibitors As Cancer Therapeutics Steven Grant Eds
https://ebookbell.com/product/histone-deacetylase-inhibitors-as-
cancer-therapeutics-steven-grant-eds-4423024
Histone Recognition 1st Edition Mingming Zhou Eds
https://ebookbell.com/product/histone-recognition-1st-edition-
mingming-zhou-eds-5141246
HISTONE
MODIFICATIONS
INTHERAPY
MODIFICATIONS
INTHERAPY
Translational Epigenetics Series
Trygve O. Tollefsbol, Series Editor
Transgenerational Epigenetics
Edited by Trygve O. Tollefsbol, 2014
Personalized Epigenetics
Edited by Trygve O. Tollefsbol, 2015
Epigenetic Technological Applications
Edited by Y. George Zheng, 2015
Epigenetic Cancer Therapy
Edited by Steven G. Gray, 2015
DNA Methylation and Complex Human Disease
By Michel Neidhart, 2015
Epigenomics in Health and Disease
Edited by Mario F. Fraga and
Agustin F. F Ferna´ndez, 2015
Epigenetic Gene Expression and Regulation
Edited by Suming Huang, Michael Litt and
C. Ann Blakey, 2015
Epigenetic Biomarkers and Diagnostics
Edited by Jose Luis Garcı´a-Gimenez, 2015
Drug Discovery in Cancer Epigenetics
Edited by Gerda Egger and
Paola Barbara Arimondo, 2015
Medical Epigenetics
Edited by Trygve O. Tollefsbol, 2016
Chromatin Signaling and Diseases
Edited by Olivier Binda and
Martin Fernandez-Zapico, 2016
Genome Stability
Edited by Igor Kovalchuk and
Olga Kovalchuk, 2016
Chromatin Regulation and Dynamics
Edited by Anita G€ond€or, 2016
Neuropsychiatric Disorders and Epigenetics
Edited by Dag H. Yasui, Jacob Peedicayil and
Dennis R. Grayson, 2016
Polycomb Group Proteins
Edited by Vincenzo Pirrotta, 2016
Epigenetics and Systems Biology
Edited by Leonie Ringrose, 2017
Cancer and Noncoding RNAs
Edited by Jayprokas Chakrabarti and
Sanga Mitra, 2017
Nuclear Architecture and Dynamics
Edited by Christophe Lavelle and
Jean-Marc Victor, 2017
Epigenetic Mechanisms in Cancer
Edited by Sabita Saldanha, 2017
Epigenetics of Aging and Longevity
Edited by Alexey Moskalev and
Alexander M. Vaiserman, 2017
The Epigenetics of Autoimmunity
Edited by Rongxin Zhang, 2018
Epigenetics in Human Disease, Second Edition
Edited by Trygve O. Tollefsbol, 2018
Epigenetics of Chronic Pain
Edited by Guang Bai and
Ke Ren, 2018
Epigenetics of Cancer Prevention
Edited by Anupam Bishayee and
Deepak Bhatia, 2018
Computational Epigenetics and Diseases
Edited by Loo Keat Wei, 2019
Pharmacoepigenetics
Edited by Ramo´n Cacabelos, 2019
Epigenetics and Regeneration
Edited by Daniela Palacios, 2019
Chromatin Signaling and Neurological Disorders
Edited by Olivier Binda, 2019
Transgenerational Epigenetics, Second Edition
Edited by Trygve Tollefsbol, 2019
Nutritional Epigenomics
Edited by Bradley Ferguson, 2019
Prognostic Epigenetics
Edited by Shilpy Sharma, 2019
Epigenetics of the Immune System
Edited by Dieter Kabelitz, 2020
Stem Cell Epigenetics
Edited by Eran Meshorer and
Giuseppe Testa, 2020
Epigenetics Methods
Edited by Trygve Tollefsbol, 2020
Trygve O. Tollefsbol, Series Editor
Transgenerational Epigenetics
Edited by Trygve O. Tollefsbol, 2014
Personalized Epigenetics
Edited by Trygve O. Tollefsbol, 2015
Epigenetic Technological Applications
Edited by Y. George Zheng, 2015
Epigenetic Cancer Therapy
Edited by Steven G. Gray, 2015
DNA Methylation and Complex Human Disease
By Michel Neidhart, 2015
Epigenomics in Health and Disease
Edited by Mario F. Fraga and
Agustin F. F Ferna´ndez, 2015
Epigenetic Gene Expression and Regulation
Edited by Suming Huang, Michael Litt and
C. Ann Blakey, 2015
Epigenetic Biomarkers and Diagnostics
Edited by Jose Luis Garcı´a-Gimenez, 2015
Drug Discovery in Cancer Epigenetics
Edited by Gerda Egger and
Paola Barbara Arimondo, 2015
Medical Epigenetics
Edited by Trygve O. Tollefsbol, 2016
Chromatin Signaling and Diseases
Edited by Olivier Binda and
Martin Fernandez-Zapico, 2016
Genome Stability
Edited by Igor Kovalchuk and
Olga Kovalchuk, 2016
Chromatin Regulation and Dynamics
Edited by Anita G€ond€or, 2016
Neuropsychiatric Disorders and Epigenetics
Edited by Dag H. Yasui, Jacob Peedicayil and
Dennis R. Grayson, 2016
Polycomb Group Proteins
Edited by Vincenzo Pirrotta, 2016
Epigenetics and Systems Biology
Edited by Leonie Ringrose, 2017
Cancer and Noncoding RNAs
Edited by Jayprokas Chakrabarti and
Sanga Mitra, 2017
Nuclear Architecture and Dynamics
Edited by Christophe Lavelle and
Jean-Marc Victor, 2017
Epigenetic Mechanisms in Cancer
Edited by Sabita Saldanha, 2017
Epigenetics of Aging and Longevity
Edited by Alexey Moskalev and
Alexander M. Vaiserman, 2017
The Epigenetics of Autoimmunity
Edited by Rongxin Zhang, 2018
Epigenetics in Human Disease, Second Edition
Edited by Trygve O. Tollefsbol, 2018
Epigenetics of Chronic Pain
Edited by Guang Bai and
Ke Ren, 2018
Epigenetics of Cancer Prevention
Edited by Anupam Bishayee and
Deepak Bhatia, 2018
Computational Epigenetics and Diseases
Edited by Loo Keat Wei, 2019
Pharmacoepigenetics
Edited by Ramo´n Cacabelos, 2019
Epigenetics and Regeneration
Edited by Daniela Palacios, 2019
Chromatin Signaling and Neurological Disorders
Edited by Olivier Binda, 2019
Transgenerational Epigenetics, Second Edition
Edited by Trygve Tollefsbol, 2019
Nutritional Epigenomics
Edited by Bradley Ferguson, 2019
Prognostic Epigenetics
Edited by Shilpy Sharma, 2019
Epigenetics of the Immune System
Edited by Dieter Kabelitz, 2020
Stem Cell Epigenetics
Edited by Eran Meshorer and
Giuseppe Testa, 2020
Epigenetics Methods
Edited by Trygve Tollefsbol, 2020
Translational Epigenetics
HISTONE
MODIFICATIONS
INTHERAPY
Volume 20
Series Editor
TRYGVE TOLLEFSBOL
Edited by
PEDRO CASTELO-BRANCO
CARMEN JERONIMO
HISTONE
MODIFICATIONS
INTHERAPY
Volume 20
Series Editor
TRYGVE TOLLEFSBOL
Edited by
PEDRO CASTELO-BRANCO
CARMEN JERONIMO
Academic Press is an imprint of Elsevier
125 London Wall, London EC2Y 5AS, United Kingdom
525 B Street, Suite 1650, San Diego, CA 92101, United States
50 Hampshire Street, 5th Floor, Cambridge, MA 02139, United States
The Boulevard, Langford Lane, Kidlington, Oxford OX5 1GB, United Kingdom
© 2020 Elsevier Inc. All rights reserved.
No part of this publication may be reproduced or transmitted in any form or by any means, electronic or mechanical,
including photocopying, recording, or any information storage and retrieval system, without permission in writing
from the publisher. Details on how to seek permission, further information about the Publisher’s permissions
policies and our arrangements with organizations such as the Copyright Clearance Center and the Copyright
Licensing Agency, can be found at our website:www.elsevier.com/permissions.
This book and the individual contributions contained in it are protected under copyright by the Publisher (other
than as may be noted herein).
Notices
Knowledge and best practice in this field are constantly changing. As new research and experience broaden our
understanding, changes in research methods, professional practices, or medical treatment may become necessary.
Practitioners and researchers must always rely on their own experience and knowledge in evaluating and using any
information, methods, compounds, or experiments described herein. In using such information or methods they
should be mindful of their own safety and the safety of others, including parties for whom they have a professional
responsibility.
To the fullest extent of the law, neither the Publisher nor the authors, contributors, or editors, assume any liability
for any injury and/or damage to persons or property as a matter of products liability, negligence or otherwise, or
from any use or operation of any methods, products, instructions, or ideas contained in the material herein.
Library of Congress Cataloging-in-Publication Data
A catalog record for this book is available from the Library of Congress
British Library Cataloguing-in-Publication Data
A catalogue record for this book is available from the British Library
ISBN 978-0-12-816422-8
For information on all Academic Press publications
visit our website athttps://www.elsevier.com/books-and-journals
Publisher:Elsevier
Acquisitions Editor:Peter B Linsley
Editorial Project Manager:Megan Ashdown
Production Project Manager:Sreejith Viswanathan
Cover Designer:Miles Hitchen
Typeset by SPi Global, India
125 London Wall, London EC2Y 5AS, United Kingdom
525 B Street, Suite 1650, San Diego, CA 92101, United States
50 Hampshire Street, 5th Floor, Cambridge, MA 02139, United States
The Boulevard, Langford Lane, Kidlington, Oxford OX5 1GB, United Kingdom
© 2020 Elsevier Inc. All rights reserved.
No part of this publication may be reproduced or transmitted in any form or by any means, electronic or mechanical,
including photocopying, recording, or any information storage and retrieval system, without permission in writing
from the publisher. Details on how to seek permission, further information about the Publisher’s permissions
policies and our arrangements with organizations such as the Copyright Clearance Center and the Copyright
Licensing Agency, can be found at our website:www.elsevier.com/permissions.
This book and the individual contributions contained in it are protected under copyright by the Publisher (other
than as may be noted herein).
Notices
Knowledge and best practice in this field are constantly changing. As new research and experience broaden our
understanding, changes in research methods, professional practices, or medical treatment may become necessary.
Practitioners and researchers must always rely on their own experience and knowledge in evaluating and using any
information, methods, compounds, or experiments described herein. In using such information or methods they
should be mindful of their own safety and the safety of others, including parties for whom they have a professional
responsibility.
To the fullest extent of the law, neither the Publisher nor the authors, contributors, or editors, assume any liability
for any injury and/or damage to persons or property as a matter of products liability, negligence or otherwise, or
from any use or operation of any methods, products, instructions, or ideas contained in the material herein.
Library of Congress Cataloging-in-Publication Data
A catalog record for this book is available from the Library of Congress
British Library Cataloguing-in-Publication Data
A catalogue record for this book is available from the British Library
ISBN 978-0-12-816422-8
For information on all Academic Press publications
visit our website athttps://www.elsevier.com/books-and-journals
Publisher:Elsevier
Acquisitions Editor:Peter B Linsley
Editorial Project Manager:Megan Ashdown
Production Project Manager:Sreejith Viswanathan
Cover Designer:Miles Hitchen
Typeset by SPi Global, India
Contents
Contributors xi
Editors biography xv
Preface xvii
1. Histone modifications in diseases 1
Mónica T. Fernandes, Helder Almeida-Lousada, and Pedro Castelo-Branco
1.1The basics of histone modifications 1
1.2Alterations of histone modifications in human diseases 4
References 9
Section I Targeting histone modifications for cancer treatment
2. HDAC inhibitors in cancer therapy 19
A. Ganesan
2.1HDACs: The most successful epigenetic drug discovery target 19
2.2Clinically approved HDAC inhibitors 22
2.3Hydroxamic acid HDAC inhibitor clinical candidates 28
2.4Nonhydroxamic acid HDAC inhibitor clinical candidates 34
2.5HDAC inhibitors in combination with cytotoxic agents 36
2.6HDAC inhibitors in combination with targeted therapy 37
2.7Combinationepigenetic therapy 40
2.8Dual mechanism HDAC inhibitors 40
2.9HDAC inhibitors: Magic bullets or shotgun pellets 42
References 44
3. HAT inhibitors in cancer therapy 51
Francesco Fiorentino, Antonello Mai, and Dante Rotili
3.1Background 51
3.2HAT superfamilies 55
3.3HATs and cancer 57
3.4HATs and other diseases 61
3.5HAT inhibitors 62
3.6Bi-substrate inhibitors 62
3.7Natural products and derivatives 66
v
Contributors xi
Editors biography xv
Preface xvii
1. Histone modifications in diseases 1
Mónica T. Fernandes, Helder Almeida-Lousada, and Pedro Castelo-Branco
1.1The basics of histone modifications 1
1.2Alterations of histone modifications in human diseases 4
References 9
Section I Targeting histone modifications for cancer treatment
2. HDAC inhibitors in cancer therapy 19
A. Ganesan
2.1HDACs: The most successful epigenetic drug discovery target 19
2.2Clinically approved HDAC inhibitors 22
2.3Hydroxamic acid HDAC inhibitor clinical candidates 28
2.4Nonhydroxamic acid HDAC inhibitor clinical candidates 34
2.5HDAC inhibitors in combination with cytotoxic agents 36
2.6HDAC inhibitors in combination with targeted therapy 37
2.7Combinationepigenetic therapy 40
2.8Dual mechanism HDAC inhibitors 40
2.9HDAC inhibitors: Magic bullets or shotgun pellets 42
References 44
3. HAT inhibitors in cancer therapy 51
Francesco Fiorentino, Antonello Mai, and Dante Rotili
3.1Background 51
3.2HAT superfamilies 55
3.3HATs and cancer 57
3.4HATs and other diseases 61
3.5HAT inhibitors 62
3.6Bi-substrate inhibitors 62
3.7Natural products and derivatives 66
v
3.8Synthetic inhibitors 69
3.9Conclusions and perspectives 74
References 74
4. Targeting DOT1L for mixed-lineage rearranged leukemia 81
Corentin Bon, Yang Si, and Paola B. Arimondo
4.1Introduction 81
4.2The chemical inhibitors of DOT1L 85
4.3Biological assays to screen for new DOT1L inhibitors 88
4.4Filter-binding assay 88
4.5Scintillation proximity assay 89
4.6Surface plasmon resonance 91
4.7Isothermal titration calorimetry 91
4.8Cellular thermal shift assay 91
4.9Cell proliferation inhibition assay 92
4.10Quantitative reverse transcriptase PCR 92
4.11High content screening 93
4.12Conclusions and perspectives 94
Acknowledgment 97
References 97
5. BET mechanisms in cancer 101
Elizabeth Henderson and Panagis Filippakopoulos
5.1Introduction 101
5.2BET proteins initiate protein-protein interactions 101
5.3Roles of BET in cellular homeostasis 102
5.4Pharmacological targeting of BET bromodomains 106
5.5NUT midline carcinoma 110
5.6Acute myeloid leukemia (AML) 111
5.7Multiple myeloma 112
5.8Neuroblastoma 112
5.9Glioblastoma 113
5.10Colorectal cancer 113
5.11Ovarian cancer 114
5.12Breast cancer 115
5.13Melanoma 115
5.14Prostate cancer 116
5.15Lung cancer 117
5.16Endometrial cancer 118
5.17Liver cancer 118
5.18Head and neck cancer 119
vi
Contents
3.9Conclusions and perspectives 74
References 74
4. Targeting DOT1L for mixed-lineage rearranged leukemia 81
Corentin Bon, Yang Si, and Paola B. Arimondo
4.1Introduction 81
4.2The chemical inhibitors of DOT1L 85
4.3Biological assays to screen for new DOT1L inhibitors 88
4.4Filter-binding assay 88
4.5Scintillation proximity assay 89
4.6Surface plasmon resonance 91
4.7Isothermal titration calorimetry 91
4.8Cellular thermal shift assay 91
4.9Cell proliferation inhibition assay 92
4.10Quantitative reverse transcriptase PCR 92
4.11High content screening 93
4.12Conclusions and perspectives 94
Acknowledgment 97
References 97
5. BET mechanisms in cancer 101
Elizabeth Henderson and Panagis Filippakopoulos
5.1Introduction 101
5.2BET proteins initiate protein-protein interactions 101
5.3Roles of BET in cellular homeostasis 102
5.4Pharmacological targeting of BET bromodomains 106
5.5NUT midline carcinoma 110
5.6Acute myeloid leukemia (AML) 111
5.7Multiple myeloma 112
5.8Neuroblastoma 112
5.9Glioblastoma 113
5.10Colorectal cancer 113
5.11Ovarian cancer 114
5.12Breast cancer 115
5.13Melanoma 115
5.14Prostate cancer 116
5.15Lung cancer 117
5.16Endometrial cancer 118
5.17Liver cancer 118
5.18Head and neck cancer 119
vi
Contents
5.19Emerging consensus on BET-targeted phenotypes and mechanisms 119
5.20Toxicity arising from BET bromodomain targeting in cancer 123
5.21Resistance to BET bromodomain inhibitors 124
5.22Combinatorial strategies and efforts to overcome resistance 125
5.23BET protein degraders 127
5.24Alternative BET targeting 128
5.25Conclusions and outlook 129
Acknowledgments 133
Declaration of interests 133
References 133
6. Histone demethylase inhibitors and their potential in cancer
treatment 143
Federica Sarno, Angela Nebbioso, and Lucia Altucci
6.1Introduction 143
6.2Arginine demethylation 144
6.3Lysine demethylation 153
6.4Conclusions 167
References 168
7. Targeting chromatin remodelers in urological tumors 179
João Lobo, Carmen Jerónimo, and Rui Henrique
7.1Introduction 179
7.2Targeting chromatin remodelers in kidney cancer 180
7.3Targeting chromatin remodelers in bladder cancer 187
7.4Targeting chromatin remodelers in prostate cancer 193
7.5Targeting chromatin remodelers in testicular cancer 201
7.6Conclusion: Clinical trials in urological tumors 205
Acknowledgments 208
References 208
Section II Targeting histone modifications for infectious disease
8. The therapeutic potential of epigenetic manipulation during
infectious diseases 217
Anju M. Philip, Alexandra Binnie, and Claudia C. dos Santos
8.1Introduction 217
8.2Epigenetic modifications 218
8.3Pathogen-driven epigenetic modifications 220
8.4Host immune response and epigenetic changes in response to
infection 224
vii
Contents
5.20Toxicity arising from BET bromodomain targeting in cancer 123
5.21Resistance to BET bromodomain inhibitors 124
5.22Combinatorial strategies and efforts to overcome resistance 125
5.23BET protein degraders 127
5.24Alternative BET targeting 128
5.25Conclusions and outlook 129
Acknowledgments 133
Declaration of interests 133
References 133
6. Histone demethylase inhibitors and their potential in cancer
treatment 143
Federica Sarno, Angela Nebbioso, and Lucia Altucci
6.1Introduction 143
6.2Arginine demethylation 144
6.3Lysine demethylation 153
6.4Conclusions 167
References 168
7. Targeting chromatin remodelers in urological tumors 179
João Lobo, Carmen Jerónimo, and Rui Henrique
7.1Introduction 179
7.2Targeting chromatin remodelers in kidney cancer 180
7.3Targeting chromatin remodelers in bladder cancer 187
7.4Targeting chromatin remodelers in prostate cancer 193
7.5Targeting chromatin remodelers in testicular cancer 201
7.6Conclusion: Clinical trials in urological tumors 205
Acknowledgments 208
References 208
Section II Targeting histone modifications for infectious disease
8. The therapeutic potential of epigenetic manipulation during
infectious diseases 217
Anju M. Philip, Alexandra Binnie, and Claudia C. dos Santos
8.1Introduction 217
8.2Epigenetic modifications 218
8.3Pathogen-driven epigenetic modifications 220
8.4Host immune response and epigenetic changes in response to
infection 224
vii
Contents
8.5Therapeutic potential of epigenetic drugs in infectious diseases 229
8.6A view of the future 229
References 234
9. Targeting histone deacetylases for bacterial infections 237
Katarzyna B. Lagosz and Aleksander M. Grabiec
9.1Introduction 237
9.2HDACs in epigenetic and nonepigenetic regulation 237
9.3HDACi as antiinflammatory agents 239
9.4HDAC regulation by bacterial pathogens 240
9.5Effects of HDACi on cell responses to bacterial agonists 241
9.6HDACi in cellular infection models 243
9.7HDACi in animal models of infection 245
9.8Conclusions 248
Funding 249
References 249
10. Targeting histone epigenetics to control viral infections 255
Zeina Nehme, Sebastien Pasquereau, and Georges Herbein
10.1Chronic viral infections 255
10.2Cancer-inducing viruses 267
10.3Epidemic/emerging viral infections 276
10.4Conclusion and future perspectives 281
References 282
Section III Targeting histone modifications for treating other
pathologies
11. Targeting histone modifications in psychotic disorders 295
Jacob Peedicayil
11.1Introduction 295
11.2Histone modifications in psychotic disorders 298
11.3Drugs targeting histone modifications in psychotic disorders 301
11.4Histone-modifying drugs for correcting cognitive deficits in psychotic
disorders 303
11.5Conclusions 306
Acknowledgments 306
References 306
12. Epigenetic treatment of neurodegenerative disorders 311
Olaia Martínez-Iglesias and Ramon Cacabelos
12.1Introduction 311
12.2Histone modifications 311
viii
Contents
8.6A view of the future 229
References 234
9. Targeting histone deacetylases for bacterial infections 237
Katarzyna B. Lagosz and Aleksander M. Grabiec
9.1Introduction 237
9.2HDACs in epigenetic and nonepigenetic regulation 237
9.3HDACi as antiinflammatory agents 239
9.4HDAC regulation by bacterial pathogens 240
9.5Effects of HDACi on cell responses to bacterial agonists 241
9.6HDACi in cellular infection models 243
9.7HDACi in animal models of infection 245
9.8Conclusions 248
Funding 249
References 249
10. Targeting histone epigenetics to control viral infections 255
Zeina Nehme, Sebastien Pasquereau, and Georges Herbein
10.1Chronic viral infections 255
10.2Cancer-inducing viruses 267
10.3Epidemic/emerging viral infections 276
10.4Conclusion and future perspectives 281
References 282
Section III Targeting histone modifications for treating other
pathologies
11. Targeting histone modifications in psychotic disorders 295
Jacob Peedicayil
11.1Introduction 295
11.2Histone modifications in psychotic disorders 298
11.3Drugs targeting histone modifications in psychotic disorders 301
11.4Histone-modifying drugs for correcting cognitive deficits in psychotic
disorders 303
11.5Conclusions 306
Acknowledgments 306
References 306
12. Epigenetic treatment of neurodegenerative disorders 311
Olaia Martínez-Iglesias and Ramon Cacabelos
12.1Introduction 311
12.2Histone modifications 311
viii
Contents
12.3Histone modifications in neurodegenerative disorders 313
12.4Histone modification treatments in neurodegenerative disorders:
Preclinical studies 316
12.5Histone-modification treatment in neurodegenerative disorders:
Clinical studies 321
12.6Conclusions 327
References 328
13. Histone modification as a potential preventative and therapeutic
approach for cardiovascular disease 337
Justine S. Habibian and Bradley S. Ferguson
13.1Introduction 337
13.2Histone acetylation and deacetylation in cardiovascular disease 338
13.3Histone methylation in cardiovascular disease 344
13.4Conclusions and future perspectives 348
References 349
Further reading 357
14. The potentiality of histone deacetylase inhibitors for diabetes and
obesity 361
Ahmed El-Serafi and Ibrahim El-Serafi
14.1Introduction 361
14.2Epigenetic role in insulin production 362
14.3Interplay of epigenetics and obesity 363
14.4Epigenetic modifiers and diabetes 364
14.5Epigenetic modifiers and the complications of diabetes 366
14.6Histone deacetylase inhibitors and obesity 366
14.7Epigenetic modifiers and the complications of obesity 367
14.8Histone deacetylase inhibitors as a double hit for obesity and
diabetes 367
14.9Conclusion 368
References 369
15. Targeting histone modifications in cancer immunotherapy 373
Ester Munera-Maravilla, Jesús M. Paramio, and Marta Dueñas
15.1Introduction 373
15.2Epigenetic remodeling in TME 374
15.3Epigenetic immunomodulation in TME players 375
15.4NK cells 379
15.5Macrophages 379
15.6Dendritic cells 381
15.7Other immune cell players 382
15.8Cancer-associated fibroblasts 382
ix
Contents
12.4Histone modification treatments in neurodegenerative disorders:
Preclinical studies 316
12.5Histone-modification treatment in neurodegenerative disorders:
Clinical studies 321
12.6Conclusions 327
References 328
13. Histone modification as a potential preventative and therapeutic
approach for cardiovascular disease 337
Justine S. Habibian and Bradley S. Ferguson
13.1Introduction 337
13.2Histone acetylation and deacetylation in cardiovascular disease 338
13.3Histone methylation in cardiovascular disease 344
13.4Conclusions and future perspectives 348
References 349
Further reading 357
14. The potentiality of histone deacetylase inhibitors for diabetes and
obesity 361
Ahmed El-Serafi and Ibrahim El-Serafi
14.1Introduction 361
14.2Epigenetic role in insulin production 362
14.3Interplay of epigenetics and obesity 363
14.4Epigenetic modifiers and diabetes 364
14.5Epigenetic modifiers and the complications of diabetes 366
14.6Histone deacetylase inhibitors and obesity 366
14.7Epigenetic modifiers and the complications of obesity 367
14.8Histone deacetylase inhibitors as a double hit for obesity and
diabetes 367
14.9Conclusion 368
References 369
15. Targeting histone modifications in cancer immunotherapy 373
Ester Munera-Maravilla, Jesús M. Paramio, and Marta Dueñas
15.1Introduction 373
15.2Epigenetic remodeling in TME 374
15.3Epigenetic immunomodulation in TME players 375
15.4NK cells 379
15.5Macrophages 379
15.6Dendritic cells 381
15.7Other immune cell players 382
15.8Cancer-associated fibroblasts 382
ix
Contents
15.9Tumor endothelial cells 383
15.10Modulating epigenetics of the TME-Cancer cell interaction: Can we change
the game rules? 385
References 387
16. Epigenetic drug development for autoimmune and inflammatory
diseases 395
Hammad Ullah and Haroon Khan
16.1Introduction 395
16.2Pathogenesis of autoimmune and inflammatory disorders 396
16.3Epigenetic drug development for autoimmune and inflammatory
disorders 400
16.4Conclusion 412
References 412
17. Present and future perspectives for targeting histone modifications
in therapy 415
V^ania Camilo and Carmen Jerónimo
17.1Introduction 417
17.2Targeting the epigenetic writers 418
17.3Targeting the epigenetic readers 427
17.4Targeting the epigenetic erasers 428
17.5Histone deacetylase inhibitors (HDACi) 431
17.6Conclusions 449
Funding 450
References 450
Index 459
x
Contents
15.10Modulating epigenetics of the TME-Cancer cell interaction: Can we change
the game rules? 385
References 387
16. Epigenetic drug development for autoimmune and inflammatory
diseases 395
Hammad Ullah and Haroon Khan
16.1Introduction 395
16.2Pathogenesis of autoimmune and inflammatory disorders 396
16.3Epigenetic drug development for autoimmune and inflammatory
disorders 400
16.4Conclusion 412
References 412
17. Present and future perspectives for targeting histone modifications
in therapy 415
V^ania Camilo and Carmen Jerónimo
17.1Introduction 417
17.2Targeting the epigenetic writers 418
17.3Targeting the epigenetic readers 427
17.4Targeting the epigenetic erasers 428
17.5Histone deacetylase inhibitors (HDACi) 431
17.6Conclusions 449
Funding 450
References 450
Index 459
x
Contents
Contributors
Helder Almeida-Lousada
Algarve Biomedical Center, Campus Gambelas; Centre for Biomedical Research (CBMR),
Universidade do Algarve; Department of Biomedical Sciences and Medicine, Universidade do
Algarve, Faro, Portugal
Lucia Altucci
Department of Precision Medicine, University of Campania “Luigi Vanvitelli”, Naples, Italy
Paola B. Arimondo
Epigenetic Chemical Biology, Department of Structural Biology and Chemistry, Institut Pasteur,
UMR3523 CNRS, Paris, France
Alexandra Binnie
William Osler Health System, Toronto, ON, Canada; Algarve Biomedical Centre, Faro, Portugal
Corentin Bon
Epigenetic Chemical Biology, Department of Structural Biology and Chemistry, Institut Pasteur,
UMR3523 CNRS; Ecole Doctorale MTCI, Universite de Paris, Sorbonne Paris Cite, Paris,
France
Ramon Cacabelos
Department of Genomic Medicine, International Center of Neuroscience and Genomic
Medicine, Bergondo, Corunna, Spain
V^ania Camilo
Cancer Biology and Epigenetics Group, Research Center (CI-IPOP), Portuguese Oncology
Institute of Porto, Porto, Portugal
Pedro Castelo-Branco
Algarve Biomedical Center, Campus Gambelas; Centre for Biomedical Research (CBMR),
Universidade do Algarve; Department of Biomedical Sciences and Medicine, Universidade do
Algarve, Faro, Portugal
Claudia C. dos Santos
Keenan Research Centre for Biomedical Science, St. Michael’s Hospital; Institute of Medical
Sciences, Department of Medicine, University of Toronto, Toronto, ON, Canada
Marta Duen˜as
Biomedical Research Institute I+12, University Hospital; Molecular Oncology Unit, CIEMAT
(Centro de Investigaciones Energeticas, Medioambientales y Tecnolo´gicas); Centro de
Investigacio´n Biomedica en Red de Ca´ncer (CIBERONC), Madrid, Spain
Ahmed El-Serafi
Department of Biomedical and Clinical Sciences (BKV), Link€oping University, Link€oping,
Sweden
Ibrahim El-Serafi
Department of Oncology-Pathology, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden
xi
Helder Almeida-Lousada
Algarve Biomedical Center, Campus Gambelas; Centre for Biomedical Research (CBMR),
Universidade do Algarve; Department of Biomedical Sciences and Medicine, Universidade do
Algarve, Faro, Portugal
Lucia Altucci
Department of Precision Medicine, University of Campania “Luigi Vanvitelli”, Naples, Italy
Paola B. Arimondo
Epigenetic Chemical Biology, Department of Structural Biology and Chemistry, Institut Pasteur,
UMR3523 CNRS, Paris, France
Alexandra Binnie
William Osler Health System, Toronto, ON, Canada; Algarve Biomedical Centre, Faro, Portugal
Corentin Bon
Epigenetic Chemical Biology, Department of Structural Biology and Chemistry, Institut Pasteur,
UMR3523 CNRS; Ecole Doctorale MTCI, Universite de Paris, Sorbonne Paris Cite, Paris,
France
Ramon Cacabelos
Department of Genomic Medicine, International Center of Neuroscience and Genomic
Medicine, Bergondo, Corunna, Spain
V^ania Camilo
Cancer Biology and Epigenetics Group, Research Center (CI-IPOP), Portuguese Oncology
Institute of Porto, Porto, Portugal
Pedro Castelo-Branco
Algarve Biomedical Center, Campus Gambelas; Centre for Biomedical Research (CBMR),
Universidade do Algarve; Department of Biomedical Sciences and Medicine, Universidade do
Algarve, Faro, Portugal
Claudia C. dos Santos
Keenan Research Centre for Biomedical Science, St. Michael’s Hospital; Institute of Medical
Sciences, Department of Medicine, University of Toronto, Toronto, ON, Canada
Marta Duen˜as
Biomedical Research Institute I+12, University Hospital; Molecular Oncology Unit, CIEMAT
(Centro de Investigaciones Energeticas, Medioambientales y Tecnolo´gicas); Centro de
Investigacio´n Biomedica en Red de Ca´ncer (CIBERONC), Madrid, Spain
Ahmed El-Serafi
Department of Biomedical and Clinical Sciences (BKV), Link€oping University, Link€oping,
Sweden
Ibrahim El-Serafi
Department of Oncology-Pathology, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden
xi
Bradley S. Ferguson
Center of Biomedical Research Excellence for Molecular and Cellular Signal Transduction in the
Cardiovascular System; Department of Nutrition, University of Nevada, Reno, Reno, NV,
United States
Mo´nica T. Fernandes
School of Health, Universidade do Algarve; Algarve Biomedical Center, Campus Gambelas;
Centre for Biomedical Research (CBMR), Universidade do Algarve, Faro, Portugal
Panagis Filippakopoulos
Nuffield Department of Clinical Medicine, Ludwig Institute for Cancer Research; Nuffield
Department of Clinical Medicine, Structural Genomics Consortium, University of Oxford,
Oxford, United Kingdom
Francesco Fiorentino
Department of Chemistry, University of Oxford, Oxford, United Kingdom
A. Ganesan
School of Pharmacy, University of East Anglia, Norwich, United Kingdom
Aleksander M. Grabiec
Department of Microbiology, Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology,
Jagiellonian University, Krako´w, Poland
Justine S. Habibian
Cellular and Molecular Biology; Center of Biomedical Research Excellence for Molecular and
Cellular Signal Transduction in the Cardiovascular System, University of Nevada, Reno, Reno,
NV, United States
Elizabeth Henderson
Nuffield Department of Clinical Medicine, Ludwig Institute for Cancer Research; Nuffield
Department of Clinical Medicine, Structural Genomics Consortium, University of Oxford,
Oxford, United Kingdom
Rui Henrique
Department of Pathology, Portuguese Oncology Institute of Porto (IPOP); Cancer Biology and
Epigenetics Group, Research Center of Portuguese Oncology Institute of Porto (GEBC
CI-IPOP) & Porto Comprehensive Cancer Center (P.CCC); Department of Pathology and
Molecular Immunology, Institute of Biomedical Sciences Abel Salazar, University of Porto
(ICBAS-UP), Porto, Portugal
Georges Herbein
Department Pathogens & Inflammation-EPILAB, UPRES EA4266, University of Franche-
Comte, University of Bourgogne Franche-Comte; Department of Virology, CHRU Besancon,
Besanc¸on, France
Carmen Jero´nimo
Cancer Biology and Epigenetics Group, Research Center (CI-IPOP), Portuguese Oncology
Institute of Porto; Department of Pathology and Molecular Immunology, Institute of Biomedical
Sciences Abel Salazar (ICBAS), University of Porto, Porto, Portugal
Haroon Khan
Department of Pharmacy, Faculty of Chemical & Life Sciences, Abdul Wali Khan University,
Mardan, Pakistan
xii Contributors
Center of Biomedical Research Excellence for Molecular and Cellular Signal Transduction in the
Cardiovascular System; Department of Nutrition, University of Nevada, Reno, Reno, NV,
United States
Mo´nica T. Fernandes
School of Health, Universidade do Algarve; Algarve Biomedical Center, Campus Gambelas;
Centre for Biomedical Research (CBMR), Universidade do Algarve, Faro, Portugal
Panagis Filippakopoulos
Nuffield Department of Clinical Medicine, Ludwig Institute for Cancer Research; Nuffield
Department of Clinical Medicine, Structural Genomics Consortium, University of Oxford,
Oxford, United Kingdom
Francesco Fiorentino
Department of Chemistry, University of Oxford, Oxford, United Kingdom
A. Ganesan
School of Pharmacy, University of East Anglia, Norwich, United Kingdom
Aleksander M. Grabiec
Department of Microbiology, Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology,
Jagiellonian University, Krako´w, Poland
Justine S. Habibian
Cellular and Molecular Biology; Center of Biomedical Research Excellence for Molecular and
Cellular Signal Transduction in the Cardiovascular System, University of Nevada, Reno, Reno,
NV, United States
Elizabeth Henderson
Nuffield Department of Clinical Medicine, Ludwig Institute for Cancer Research; Nuffield
Department of Clinical Medicine, Structural Genomics Consortium, University of Oxford,
Oxford, United Kingdom
Rui Henrique
Department of Pathology, Portuguese Oncology Institute of Porto (IPOP); Cancer Biology and
Epigenetics Group, Research Center of Portuguese Oncology Institute of Porto (GEBC
CI-IPOP) & Porto Comprehensive Cancer Center (P.CCC); Department of Pathology and
Molecular Immunology, Institute of Biomedical Sciences Abel Salazar, University of Porto
(ICBAS-UP), Porto, Portugal
Georges Herbein
Department Pathogens & Inflammation-EPILAB, UPRES EA4266, University of Franche-
Comte, University of Bourgogne Franche-Comte; Department of Virology, CHRU Besancon,
Besanc¸on, France
Carmen Jero´nimo
Cancer Biology and Epigenetics Group, Research Center (CI-IPOP), Portuguese Oncology
Institute of Porto; Department of Pathology and Molecular Immunology, Institute of Biomedical
Sciences Abel Salazar (ICBAS), University of Porto, Porto, Portugal
Haroon Khan
Department of Pharmacy, Faculty of Chemical & Life Sciences, Abdul Wali Khan University,
Mardan, Pakistan
xii Contributors
Katarzyna B. Lagosz
Department of Microbiology, Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology,
Jagiellonian University, Krako´w, Poland
Joa˜o Lobo
Department of Pathology, Portuguese Oncology Institute of Porto (IPOP); Cancer Biology and
Epigenetics Group, Research Center (CI-IPOP), Portuguese Oncology Institute of Porto
(GEBC CI-IPOP) & Porto Comprehensive Cancer Center (P.CCC); Department of Pathology
and Molecular Immunology, Institute of Biomedical Sciences Abel Salazar, University of Porto
(ICBAS-UP), Porto, Portugal
Antonello Mai
Department of Chemistry and Technology of Drugs, Sapienza University of Rome, Rome, Italy
Olaia Martı´nez-Iglesias
Department of Medical Epigenetics, Euroespes Biomedical Research Center, International
Center of Neuroscience and Genomic Medicine, Bergondo, Corunna, Spain
Ester Munera-Maravilla
Biomedical Research Institute I+12, University Hospital; Molecular Oncology Unit, CIEMAT
(Centro de Investigaciones Energeticas, Medioambientales y Tecnolo´gicas); Centro de
Investigacio´n Biomedica en Red de Ca´ncer (CIBERONC), Madrid, Spain
Angela Nebbioso
Department of Precision Medicine, University of Campania “Luigi Vanvitelli”, Naples, Italy
Zeina Nehme
Department Pathogens & Inflammation-EPILAB, UPRES EA4266, University of Franche-
Comte, University of Bourgogne Franche-Comte, Besanc¸on, France; Lebanese University,
Beirut, Lebanon
Jesu´s M. Paramio
Biomedical Research Institute I+12, University Hospital; Molecular Oncology Unit, CIEMAT
(Centro de Investigaciones Energeticas, Medioambientales y Tecnolo´gicas); Centro de
Investigacio´n Biomedica en Red de Ca´ncer (CIBERONC), Madrid, Spain
Sebastien Pasquereau
Department Pathogens & Inflammation-EPILAB, UPRES EA4266, University of Franche-
Comte, University of Bourgogne Franche-Comte, Besanc¸on, France
Jacob Peedicayil
Department of Pharmacology & Clinical Pharmacology, Christian Medical College, Vellore,
India
Anju M. Philip
Zebrafish Centre for Advanced Drug Discovery, Keenan Research Centre for Biomedical
Science, St. Michael’s Hospital; Department of Physiology, University of Toronto, Toronto,
ON, Canada
Dante Rotili
Department of Chemistry and Technology of Drugs, Sapienza University of Rome, Rome, Italy
Federica Sarno
Department of Precision Medicine, University of Campania “Luigi Vanvitelli”, Naples, Italy
xiiiContributors
Department of Microbiology, Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology,
Jagiellonian University, Krako´w, Poland
Joa˜o Lobo
Department of Pathology, Portuguese Oncology Institute of Porto (IPOP); Cancer Biology and
Epigenetics Group, Research Center (CI-IPOP), Portuguese Oncology Institute of Porto
(GEBC CI-IPOP) & Porto Comprehensive Cancer Center (P.CCC); Department of Pathology
and Molecular Immunology, Institute of Biomedical Sciences Abel Salazar, University of Porto
(ICBAS-UP), Porto, Portugal
Antonello Mai
Department of Chemistry and Technology of Drugs, Sapienza University of Rome, Rome, Italy
Olaia Martı´nez-Iglesias
Department of Medical Epigenetics, Euroespes Biomedical Research Center, International
Center of Neuroscience and Genomic Medicine, Bergondo, Corunna, Spain
Ester Munera-Maravilla
Biomedical Research Institute I+12, University Hospital; Molecular Oncology Unit, CIEMAT
(Centro de Investigaciones Energeticas, Medioambientales y Tecnolo´gicas); Centro de
Investigacio´n Biomedica en Red de Ca´ncer (CIBERONC), Madrid, Spain
Angela Nebbioso
Department of Precision Medicine, University of Campania “Luigi Vanvitelli”, Naples, Italy
Zeina Nehme
Department Pathogens & Inflammation-EPILAB, UPRES EA4266, University of Franche-
Comte, University of Bourgogne Franche-Comte, Besanc¸on, France; Lebanese University,
Beirut, Lebanon
Jesu´s M. Paramio
Biomedical Research Institute I+12, University Hospital; Molecular Oncology Unit, CIEMAT
(Centro de Investigaciones Energeticas, Medioambientales y Tecnolo´gicas); Centro de
Investigacio´n Biomedica en Red de Ca´ncer (CIBERONC), Madrid, Spain
Sebastien Pasquereau
Department Pathogens & Inflammation-EPILAB, UPRES EA4266, University of Franche-
Comte, University of Bourgogne Franche-Comte, Besanc¸on, France
Jacob Peedicayil
Department of Pharmacology & Clinical Pharmacology, Christian Medical College, Vellore,
India
Anju M. Philip
Zebrafish Centre for Advanced Drug Discovery, Keenan Research Centre for Biomedical
Science, St. Michael’s Hospital; Department of Physiology, University of Toronto, Toronto,
ON, Canada
Dante Rotili
Department of Chemistry and Technology of Drugs, Sapienza University of Rome, Rome, Italy
Federica Sarno
Department of Precision Medicine, University of Campania “Luigi Vanvitelli”, Naples, Italy
xiiiContributors
Yang Si
Epigenetic Chemical Biology, Department of Structural Biology and Chemistry, Institut Pasteur,
UMR3523 CNRS, Paris, France
Hammad Ullah
Department of Pharmacy, Faculty of Chemical & Life Sciences, Abdul Wali Khan University,
Mardan, Pakistan
xiv Contributors
Epigenetic Chemical Biology, Department of Structural Biology and Chemistry, Institut Pasteur,
UMR3523 CNRS, Paris, France
Hammad Ullah
Department of Pharmacy, Faculty of Chemical & Life Sciences, Abdul Wali Khan University,
Mardan, Pakistan
xiv Contributors
Editors biography
Pedro Castelo-Brancocompleted his Doctorate in molecular biology at Oxford
University in 2005, followed by postdoctoral fellowships at Harvard University and
the University of Toronto. Since 2014, he is a Professor in the Department of Biomedical
Sciences and Medicine and head of the Epigenetics in Human Disease Laboratory, at
the University of Algarve. His scientific interests include the identification of specific
epigenetic signatures throughout carcinogenesis and targeted methylation/demethyla-
tion as a therapeutic approach.
Carmen Jero´nimois Group Leader of the Cancer Biology & Epigenetics Group and
the Scientific Coordinator of the Biobank at the Portuguese Oncology Institute of Porto
(IPO Porto) as well as Invited Associate Professor in the Department of Pathology and
Molecular Genetics and the Director of the Master Course in Oncology at the University
of Porto, teaching Pathology and Cancer Epigenetics, both undergraduate and postgrad-
uate courses.
She obtained her BSc in Biology (1994), MSc in Oncology (1998), PhD in Biomedical
Sciences (2001), and Habilitation in Pathology and Molecular Genetics (2011) at the Uni-
versity of Porto. She performed her PhD project at Johns Hopkins University (JHU),
United States under the GABBA Program, working on prostate cancer genetic and epi-
genetic alterations. From 2002 until 2007, she was a postdoctoral fellow and Invited
Researcher at IPO Porto, in collaboration with JHU, working on detection of neoplastic
cells by DNA-based technology in clinical samples obtained from noninvasive or minimal
invasive methods. In 2008, she established her independent group at IPO Porto, working
on Cancer Biology and Epigenetics (FCT-2008 Science Program).
She has supervised 4 PhD students and cosupervised 5 PhD students, as well as super-
vised 36 master students and several undergraduate students. Presently she mentors three
junior researchers, one postdoctoral, three PhD students, and four master students.
As an independent Researcher, she served as Principal Investigator of 20 grants,
and participated in other 14 projects granted from different National and International
agencies under competitive concurrence (total amount 2.3K€).
She has authored or coauthored more than 160 international scientific publications
including 5 book chapters and 39 review articles (H-index 43; Scopus 02/2020), includ-
ing in first quartile (Q1) journals;Clin Cancer Res,Cancers,Cancer Letters,Cell Death Dis,
Br J Cancer,Eur J Cancer,J Cell Mol Med,J Hematol Oncol,JNCI,Mol Cancer,Mol Oncoland
Nat Commun,Oncogene, andPNAS. She has collaborated in a patent submission (Methods
and biomarkers for detection of bladder cancer. US 20130210011/EP 2630261
A1/WO 2012052844 A1).
xv
Pedro Castelo-Brancocompleted his Doctorate in molecular biology at Oxford
University in 2005, followed by postdoctoral fellowships at Harvard University and
the University of Toronto. Since 2014, he is a Professor in the Department of Biomedical
Sciences and Medicine and head of the Epigenetics in Human Disease Laboratory, at
the University of Algarve. His scientific interests include the identification of specific
epigenetic signatures throughout carcinogenesis and targeted methylation/demethyla-
tion as a therapeutic approach.
Carmen Jero´nimois Group Leader of the Cancer Biology & Epigenetics Group and
the Scientific Coordinator of the Biobank at the Portuguese Oncology Institute of Porto
(IPO Porto) as well as Invited Associate Professor in the Department of Pathology and
Molecular Genetics and the Director of the Master Course in Oncology at the University
of Porto, teaching Pathology and Cancer Epigenetics, both undergraduate and postgrad-
uate courses.
She obtained her BSc in Biology (1994), MSc in Oncology (1998), PhD in Biomedical
Sciences (2001), and Habilitation in Pathology and Molecular Genetics (2011) at the Uni-
versity of Porto. She performed her PhD project at Johns Hopkins University (JHU),
United States under the GABBA Program, working on prostate cancer genetic and epi-
genetic alterations. From 2002 until 2007, she was a postdoctoral fellow and Invited
Researcher at IPO Porto, in collaboration with JHU, working on detection of neoplastic
cells by DNA-based technology in clinical samples obtained from noninvasive or minimal
invasive methods. In 2008, she established her independent group at IPO Porto, working
on Cancer Biology and Epigenetics (FCT-2008 Science Program).
She has supervised 4 PhD students and cosupervised 5 PhD students, as well as super-
vised 36 master students and several undergraduate students. Presently she mentors three
junior researchers, one postdoctoral, three PhD students, and four master students.
As an independent Researcher, she served as Principal Investigator of 20 grants,
and participated in other 14 projects granted from different National and International
agencies under competitive concurrence (total amount 2.3K€).
She has authored or coauthored more than 160 international scientific publications
including 5 book chapters and 39 review articles (H-index 43; Scopus 02/2020), includ-
ing in first quartile (Q1) journals;Clin Cancer Res,Cancers,Cancer Letters,Cell Death Dis,
Br J Cancer,Eur J Cancer,J Cell Mol Med,J Hematol Oncol,JNCI,Mol Cancer,Mol Oncoland
Nat Commun,Oncogene, andPNAS. She has collaborated in a patent submission (Methods
and biomarkers for detection of bladder cancer. US 20130210011/EP 2630261
A1/WO 2012052844 A1).
xv
Her research interests are focused on the characterization of the epigenome of tumor
cells, and the identification of functional changes involved in cell epigenetic homeostasis
breakdown. In the context of Personalized Medicine, she works in the development of
new cancer epigenetic biomarkers based in liquid biopsies as well as in the drug discovery
based on modulation of epigenetic aberrations. Owing to the relevance that Immuno-
oncology has demonstrated in recent years, she is also investigating the epigenetic expres-
sion modulation of biomolecules involved in immune checkpoint regulation, aiming at
the improvement of immunotherapeutic strategies by combination with epi-drugs. More
recently, she started tackling the contribution of deregulated noncoding RNAs and its
interaction with other epigenetic mechanisms in malignant transformation.
Currently, she serves as Section Editor ofClinical Epigeneticsand a Associate Editors of
International Journal of Molecular Sciences and Epigenomes, and she is also MC member of
COST Action European Epitranscriptomics Network-CA16120-EPITRAN and Board
member of ESUR-Section of Urological Research (ESUR) of European Association of
Urology (EAU).
She usually acts as a Grant Reviewer for multiple national (FCT Investigator Call
2013 e 2015) and international agencies (2003-Health Research Board-HRB)-IR;
2006-Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro; 2006, 2007-National Medical
Research Council, Singapore; 2007, 2015-Cancer Research, UK; 2010-Binational Sci-
ence Foundation, Israel; 2011, 2016, 2018-Swiss National Science Foundation-SNSF;
2012-Williams Barker, MRC, UK; 2013, 2015-Swiss League Against Cancer-KFS;
2013, 2015-FWF Austrian Science Fund; 2014-Prostate Cancer, UK; 2016, 2017-Fund
for Scientific Research-FNRS-BL; 2019-Agence Nationale de la Recherche, FR;
2019-Fundacio`La Marato´, SP.
Links
http://www.ipoporto.pt/en/ensino-investigacao/grupo-de-epigenetica-biologia-do-
cancro/
http://orcid.org/0000-0003-4186-5345
xvi Editors biography
cells, and the identification of functional changes involved in cell epigenetic homeostasis
breakdown. In the context of Personalized Medicine, she works in the development of
new cancer epigenetic biomarkers based in liquid biopsies as well as in the drug discovery
based on modulation of epigenetic aberrations. Owing to the relevance that Immuno-
oncology has demonstrated in recent years, she is also investigating the epigenetic expres-
sion modulation of biomolecules involved in immune checkpoint regulation, aiming at
the improvement of immunotherapeutic strategies by combination with epi-drugs. More
recently, she started tackling the contribution of deregulated noncoding RNAs and its
interaction with other epigenetic mechanisms in malignant transformation.
Currently, she serves as Section Editor ofClinical Epigeneticsand a Associate Editors of
International Journal of Molecular Sciences and Epigenomes, and she is also MC member of
COST Action European Epitranscriptomics Network-CA16120-EPITRAN and Board
member of ESUR-Section of Urological Research (ESUR) of European Association of
Urology (EAU).
She usually acts as a Grant Reviewer for multiple national (FCT Investigator Call
2013 e 2015) and international agencies (2003-Health Research Board-HRB)-IR;
2006-Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro; 2006, 2007-National Medical
Research Council, Singapore; 2007, 2015-Cancer Research, UK; 2010-Binational Sci-
ence Foundation, Israel; 2011, 2016, 2018-Swiss National Science Foundation-SNSF;
2012-Williams Barker, MRC, UK; 2013, 2015-Swiss League Against Cancer-KFS;
2013, 2015-FWF Austrian Science Fund; 2014-Prostate Cancer, UK; 2016, 2017-Fund
for Scientific Research-FNRS-BL; 2019-Agence Nationale de la Recherche, FR;
2019-Fundacio`La Marato´, SP.
Links
http://www.ipoporto.pt/en/ensino-investigacao/grupo-de-epigenetica-biologia-do-
cancro/
http://orcid.org/0000-0003-4186-5345
xvi Editors biography
Preface
Histone posttranslational modifications belong to the rather fascinating world of epige-
netics and constitute an important level of gene expression regulation in the human cells,
and, consequently tissues and body. Remarkably, these covalent modifications have a
unique feature, the reversibility.
This book will offer a comprehensive view of the biology of histones, the diseases
caused by aberrant histone modifications profile, and pathways/molecules potentially tar-
getable. It comprises 17 chapters accommodated in 3 major sections devoted to the cur-
rent knowledge on targeting histone modifications in the most currently relevant
diseases, including cancer (Section I), a major health concern worldwide; infection dis-
eases (Section II); and other pathologies (Section III) such as cardiovascular, diabetes, psy-
chotic and neurodegenerative diseases, and importantly, autoimmune and inflammatory
disorders. Expert chapter authors address the role of histone modifications across each
disorder and identify possible targetable molecules with potential clinical application, also
discussing the mechanisms of action. A final chapter brings together present and future
perspectives for targeting histone modifications mostly based on malignant diseases, as
these are the ones in the forefront of knowledge on histone modifications therapy.
Histone Modifications in Therapywill provide researchers, clinicians, and students with
basic and translational evidence for the role of histone modifications in disease prevention
and treatment.
Pedro Castelo-Branco
Carmen Jero´nimo
xvii
Histone posttranslational modifications belong to the rather fascinating world of epige-
netics and constitute an important level of gene expression regulation in the human cells,
and, consequently tissues and body. Remarkably, these covalent modifications have a
unique feature, the reversibility.
This book will offer a comprehensive view of the biology of histones, the diseases
caused by aberrant histone modifications profile, and pathways/molecules potentially tar-
getable. It comprises 17 chapters accommodated in 3 major sections devoted to the cur-
rent knowledge on targeting histone modifications in the most currently relevant
diseases, including cancer (Section I), a major health concern worldwide; infection dis-
eases (Section II); and other pathologies (Section III) such as cardiovascular, diabetes, psy-
chotic and neurodegenerative diseases, and importantly, autoimmune and inflammatory
disorders. Expert chapter authors address the role of histone modifications across each
disorder and identify possible targetable molecules with potential clinical application, also
discussing the mechanisms of action. A final chapter brings together present and future
perspectives for targeting histone modifications mostly based on malignant diseases, as
these are the ones in the forefront of knowledge on histone modifications therapy.
Histone Modifications in Therapywill provide researchers, clinicians, and students with
basic and translational evidence for the role of histone modifications in disease prevention
and treatment.
Pedro Castelo-Branco
Carmen Jero´nimo
xvii
This page intentionally left blank
CHAPTER 1
Histone modifications in diseases
Mónica T. Fernandes
a,b,c
,Helder Almeida-Lousada
b,c,d
, and
Pedro Castelo-Branco
b,c,d
a
School of Health, Universidade do Algarve, Faro, Portugal
b
Algarve Biomedical Center, Campus Gambelas, Faro, Portugal
c
Centre for Biomedical Research (CBMR), Universidade do Algarve, Faro, Portugal
d
Department of Biomedical Sciences and Medicine, Universidade do Algarve, Faro, Portugal
1.1 The basics of histone modifications
Misregulation of gene expression is implicated in the pathogenesis of diverse human dis-
eases.
1
It can be triggered by genetic alterations, including gene mutations, amplifica-
tions, and translocations, and epigenetic alterations, which are also inherited but do
not involve changes in the DNA sequence. In fact, a growing body of evidence suggests
that epigenetic alterations, affecting mainly noncoding RNAs, DNA methylation, and
posttranslational histone modifications, can significantly modify pivotal transcriptional
programs.
1,2
Both DNA methylation and histone modifications modulate gene expres-
sion chiefly because they impact the chromatin structure.
3,4
Chromatin is the DNA–protein complex found in the eukaryotic cell nucleus, and its
primary function is packaging DNA molecules into a more compact, denser shape. The
basic repeating unit of chromatin is the nucleosome, which is composed of 146 base pairs
of DNA wrapped around an octamer containing two of each core histone H2A, H2B,
H3, and H4.
5,6
DNA is negatively charged due to the phosphate groups in its phosphate-
sugar backbone. However, the amino acids lysine and arginine are preponderant in each
of the core histones, and their positive charges can effectively neutralize the negatively
charged DNA backbone, making the interaction between histones and DNA very tight.
5
Nucleosomes are then connected by a linker DNA of varying length, which is further
folded into arrays with the aid of the linker histone H1 and nonhistone proteins to form
a 30-nm chromatin fiber.
6–8
This ordered structure enables the necessary compaction to
fit the large eukaryotic genomes inside the cell nuclei,
9
prevents DNA damage, and reg-
ulates DNA replication, cell division, and gene expression.
10,11
Gene expression requires the two strands of DNA to separate temporarily, allowing the
access of enzymes involved in transcription to the DNA template. Therefore, although
compact, the structure of chromatin must be highly dynamic, switching between an
“open” and a “closed” state that regulates the access to the underlying DNA in interphase.
Where the chromatin is loosely organized, it is more accessible for transcription and is
referred to as euchromatin. However, chromatin can also be highly compacted and
1
Histone Modifications in Therapy ©2020 Elsevier Inc.
https://doi.org/10.1016/B978-0-12-816422-8.00001-5 All rights reserved.
Histone modifications in diseases
Mónica T. Fernandes
a,b,c
,Helder Almeida-Lousada
b,c,d
, and
Pedro Castelo-Branco
b,c,d
a
School of Health, Universidade do Algarve, Faro, Portugal
b
Algarve Biomedical Center, Campus Gambelas, Faro, Portugal
c
Centre for Biomedical Research (CBMR), Universidade do Algarve, Faro, Portugal
d
Department of Biomedical Sciences and Medicine, Universidade do Algarve, Faro, Portugal
1.1 The basics of histone modifications
Misregulation of gene expression is implicated in the pathogenesis of diverse human dis-
eases.
1
It can be triggered by genetic alterations, including gene mutations, amplifica-
tions, and translocations, and epigenetic alterations, which are also inherited but do
not involve changes in the DNA sequence. In fact, a growing body of evidence suggests
that epigenetic alterations, affecting mainly noncoding RNAs, DNA methylation, and
posttranslational histone modifications, can significantly modify pivotal transcriptional
programs.
1,2
Both DNA methylation and histone modifications modulate gene expres-
sion chiefly because they impact the chromatin structure.
3,4
Chromatin is the DNA–protein complex found in the eukaryotic cell nucleus, and its
primary function is packaging DNA molecules into a more compact, denser shape. The
basic repeating unit of chromatin is the nucleosome, which is composed of 146 base pairs
of DNA wrapped around an octamer containing two of each core histone H2A, H2B,
H3, and H4.
5,6
DNA is negatively charged due to the phosphate groups in its phosphate-
sugar backbone. However, the amino acids lysine and arginine are preponderant in each
of the core histones, and their positive charges can effectively neutralize the negatively
charged DNA backbone, making the interaction between histones and DNA very tight.
5
Nucleosomes are then connected by a linker DNA of varying length, which is further
folded into arrays with the aid of the linker histone H1 and nonhistone proteins to form
a 30-nm chromatin fiber.
6–8
This ordered structure enables the necessary compaction to
fit the large eukaryotic genomes inside the cell nuclei,
9
prevents DNA damage, and reg-
ulates DNA replication, cell division, and gene expression.
10,11
Gene expression requires the two strands of DNA to separate temporarily, allowing the
access of enzymes involved in transcription to the DNA template. Therefore, although
compact, the structure of chromatin must be highly dynamic, switching between an
“open” and a “closed” state that regulates the access to the underlying DNA in interphase.
Where the chromatin is loosely organized, it is more accessible for transcription and is
referred to as euchromatin. However, chromatin can also be highly compacted and
1
Histone Modifications in Therapy ©2020 Elsevier Inc.
https://doi.org/10.1016/B978-0-12-816422-8.00001-5 All rights reserved.
inaccessible for transcription in a “closed” or inactive state, the so-called heterochromatin.
Therefore genes are coordinately activated or repressed to ensure cellular homeostasis
where the chromatin switches between euchromatin and heterochromatin.
6
In addition to some spontaneous DNA unwrapping and rewrapping in the nucleosome,
there are other relevant mechanisms to allow access to the DNA by modulating the chro-
matin structure. First, chromatin structure is thought to be influenced by DNA methyla-
tion, the most abundant epigenetic modification, which involves the addition of a methyl
group to the cytosine pyrimidine ring in CpG dinucleotides by DNA methyltransferases
(DNMTs). Although the mechanisms involved remain largely unknown,
12
DNA meth-
ylation has been associated with nucleosome positioning/remodeling,
13
the recruitment of
methyl-binding domain proteins (MBDs),
14
and the binding of CTCF factors,
15
thus mod-
ifying the chromatin structure. Second, and more important in the context of this book,
core histone modifications are pivotal to chromatin structure and dynamics. Histone mod-
ifications also work jointly with DNA methylation for repression of gene loci.
16,17
Histones are a family of small, positively charged proteins, which are among the most
highly conserved eukaryotic proteins. As previously mentioned, the core histones are
responsible for the chromatin packing in nucleosomes. These are composed of two main
domains: the histone fold that is inserted in the nucleosome and is important for histone/
histone and histone/DNA interactions, and an N-terminal tail, which extends out from
the DNA–histone core.
5
The histone tails are subject to several different types of
enzyme-catalyzed, posttranslational covalent modifications on specific residues that alter
their interaction with DNA and nuclear proteins and, in turn, control critical aspects of
chromatin structure and function.
The most well-studied types of histone modifications are methylation, acetylation,
phosphorylation, and ubiquitination.
18
All these types of modifications are reversible,
with one highly specific enzyme serving to create a particular type of modification
and another to remove it. These enzymes are recruited to specific sites in the chromatin.
Histone methylation involves the addition of one, two, or three methyl groups to
lysine residues, and one or two methyl groups to arginine residues. Methyl groups
can be added by a set of different histone methyltransferases (HMTs) and removed by
histone demethylases (HDMs). Histone methylation in specific lysines and arginines
has been reported to regulate gene expression, either promoting or counteracting it,
in different settings.
19
For example, trimethylation of histone H3 at lysines 9, 27, and
20 is often associated with repressed transcription, whereas methylation of lysines 4,
36, and 79 correlates with active transcription.
20
Histone acetylation is associated with the transfer of the acetyl group from acetyl-
coenzyme A to the target lysine residue. Generally, high levels of histone acetylation
are associated with euchromatin
21,22
and are also prevalent in active promoter regions
and enhancer elements.
23,24
Acetyl groups are added to specific lysines by different
histone acetyltransferases (HATs) and removed by various histone deacetylase complexes
(HDACs).
21
2 Histone modifications in therapy
Therefore genes are coordinately activated or repressed to ensure cellular homeostasis
where the chromatin switches between euchromatin and heterochromatin.
6
In addition to some spontaneous DNA unwrapping and rewrapping in the nucleosome,
there are other relevant mechanisms to allow access to the DNA by modulating the chro-
matin structure. First, chromatin structure is thought to be influenced by DNA methyla-
tion, the most abundant epigenetic modification, which involves the addition of a methyl
group to the cytosine pyrimidine ring in CpG dinucleotides by DNA methyltransferases
(DNMTs). Although the mechanisms involved remain largely unknown,
12
DNA meth-
ylation has been associated with nucleosome positioning/remodeling,
13
the recruitment of
methyl-binding domain proteins (MBDs),
14
and the binding of CTCF factors,
15
thus mod-
ifying the chromatin structure. Second, and more important in the context of this book,
core histone modifications are pivotal to chromatin structure and dynamics. Histone mod-
ifications also work jointly with DNA methylation for repression of gene loci.
16,17
Histones are a family of small, positively charged proteins, which are among the most
highly conserved eukaryotic proteins. As previously mentioned, the core histones are
responsible for the chromatin packing in nucleosomes. These are composed of two main
domains: the histone fold that is inserted in the nucleosome and is important for histone/
histone and histone/DNA interactions, and an N-terminal tail, which extends out from
the DNA–histone core.
5
The histone tails are subject to several different types of
enzyme-catalyzed, posttranslational covalent modifications on specific residues that alter
their interaction with DNA and nuclear proteins and, in turn, control critical aspects of
chromatin structure and function.
The most well-studied types of histone modifications are methylation, acetylation,
phosphorylation, and ubiquitination.
18
All these types of modifications are reversible,
with one highly specific enzyme serving to create a particular type of modification
and another to remove it. These enzymes are recruited to specific sites in the chromatin.
Histone methylation involves the addition of one, two, or three methyl groups to
lysine residues, and one or two methyl groups to arginine residues. Methyl groups
can be added by a set of different histone methyltransferases (HMTs) and removed by
histone demethylases (HDMs). Histone methylation in specific lysines and arginines
has been reported to regulate gene expression, either promoting or counteracting it,
in different settings.
19
For example, trimethylation of histone H3 at lysines 9, 27, and
20 is often associated with repressed transcription, whereas methylation of lysines 4,
36, and 79 correlates with active transcription.
20
Histone acetylation is associated with the transfer of the acetyl group from acetyl-
coenzyme A to the target lysine residue. Generally, high levels of histone acetylation
are associated with euchromatin
21,22
and are also prevalent in active promoter regions
and enhancer elements.
23,24
Acetyl groups are added to specific lysines by different
histone acetyltransferases (HATs) and removed by various histone deacetylase complexes
(HDACs).
21
2 Histone modifications in therapy
Histones are phosphorylated by the addition of a phosphate group, most commonly
to tyrosine, threonine, and serine residues, where it influences processes such as DNA
repair, cell division, and gene regulation. Recently, phosphorylation of histone H1 linker
was also reported to promote chromatin decondensation.
25
Several distinct kinases are
required for the phosphorylation of histones on different residues.
Finally, histones can also be ubiquitinated in lysines. Histone ubiquitination is cata-
lyzed by the formation of an isopeptide bond between the carboxy-terminal glycine of
ubiquitin and a lysine residue on histones. This bond is developed by the sequential inter-
vention of E1-activating and E2-conjugating enzymes and E3 ligases. Ubiquitination of
lysine residues on histones was reported to be involved in DNA repair, heterochromatin
maintenance, and gene regulation. For example, monoubiquitinated histone H2B was
shown to be associated with the transcribed region of highly expressed genes in human
cells.
26
Histone ubiquitination can be reversed by deubiquitinases.
27,28
In general, there are two ways in which histone tail modifications affect gene expres-
sion. First, they can directly modulate chromatin structure dynamics likely due to alter-
ations in histone tail charges caused by the modifications, which influence the interaction
between histones and DNA, and between nucleosomes. For instance, addition of an ace-
tyl group is a modification that neutralizes the positive charge of the target lysine.
18
This
reduces the attraction between the histone and the negatively charged DNA backbone,
thereby reducing the affinity of the histone tails to adjacent nucleosomes. Second, they
can create a binding site and recruit specific proteins to the modified stretch of chromatin.
These proteins are important epigenetic players that are categorized as writers (e.g.,
HMTs, HATs, and kinases), which introduce various chemical modifications on
DNA and histones; readers, which identify and interpret those modifications; and erasers
(e.g., HDMs, HDACs, and deubiquitinases), which remove the chemical tags. In general,
the recruited proteins act with the modified histones to determine how and when genes
will be expressed.
29,30
For example, the addition of one, two, or three methyl groups to
lysine has little effect on the chemistry of the histone, but proteins containing specific
domains, including Tudor, chromo, or PHD, can recognize and bind lysine-methylated
residues and recruit various chromatin-remodeling complexes, thereby regulating the
chromatin structure and gene expression.
19,31
So far, numerous histone modifications have been described and dozens of different
residues reported to be altered, but a functional understanding of several modifications,
alone or in combination, is still lacking. Most functional data concerns individual histone
modifications that are easier to study. Nevertheless, it is thought that combinations of
histone modifications may underlie a complex histone code, whereby each combination
has a specific meaning in each context.
6
Moreover, a higher level of complexity needs to
be accounted for because, in addition to the four highly conserved core histones, eukary-
otic organisms also produce smaller amounts of specialized variant histones that differ in
amino acid sequence from the main ones, which can also assemble into nucleosomes and,
consequently, affect the chromatin structure.
32,33
3Histone modifications in diseases
to tyrosine, threonine, and serine residues, where it influences processes such as DNA
repair, cell division, and gene regulation. Recently, phosphorylation of histone H1 linker
was also reported to promote chromatin decondensation.
25
Several distinct kinases are
required for the phosphorylation of histones on different residues.
Finally, histones can also be ubiquitinated in lysines. Histone ubiquitination is cata-
lyzed by the formation of an isopeptide bond between the carboxy-terminal glycine of
ubiquitin and a lysine residue on histones. This bond is developed by the sequential inter-
vention of E1-activating and E2-conjugating enzymes and E3 ligases. Ubiquitination of
lysine residues on histones was reported to be involved in DNA repair, heterochromatin
maintenance, and gene regulation. For example, monoubiquitinated histone H2B was
shown to be associated with the transcribed region of highly expressed genes in human
cells.
26
Histone ubiquitination can be reversed by deubiquitinases.
27,28
In general, there are two ways in which histone tail modifications affect gene expres-
sion. First, they can directly modulate chromatin structure dynamics likely due to alter-
ations in histone tail charges caused by the modifications, which influence the interaction
between histones and DNA, and between nucleosomes. For instance, addition of an ace-
tyl group is a modification that neutralizes the positive charge of the target lysine.
18
This
reduces the attraction between the histone and the negatively charged DNA backbone,
thereby reducing the affinity of the histone tails to adjacent nucleosomes. Second, they
can create a binding site and recruit specific proteins to the modified stretch of chromatin.
These proteins are important epigenetic players that are categorized as writers (e.g.,
HMTs, HATs, and kinases), which introduce various chemical modifications on
DNA and histones; readers, which identify and interpret those modifications; and erasers
(e.g., HDMs, HDACs, and deubiquitinases), which remove the chemical tags. In general,
the recruited proteins act with the modified histones to determine how and when genes
will be expressed.
29,30
For example, the addition of one, two, or three methyl groups to
lysine has little effect on the chemistry of the histone, but proteins containing specific
domains, including Tudor, chromo, or PHD, can recognize and bind lysine-methylated
residues and recruit various chromatin-remodeling complexes, thereby regulating the
chromatin structure and gene expression.
19,31
So far, numerous histone modifications have been described and dozens of different
residues reported to be altered, but a functional understanding of several modifications,
alone or in combination, is still lacking. Most functional data concerns individual histone
modifications that are easier to study. Nevertheless, it is thought that combinations of
histone modifications may underlie a complex histone code, whereby each combination
has a specific meaning in each context.
6
Moreover, a higher level of complexity needs to
be accounted for because, in addition to the four highly conserved core histones, eukary-
otic organisms also produce smaller amounts of specialized variant histones that differ in
amino acid sequence from the main ones, which can also assemble into nucleosomes and,
consequently, affect the chromatin structure.
32,33
3Histone modifications in diseases
In this context, a nomenclature to represent a specific histone modification was devel-
oped.
34
Briefly, the name of the histone (e.g., H3) is followed by the single-letter amino
acid abbreviation (e.g., R for arginine) and the amino acid position in the protein (e.g.,
17); then, the type of modification (me, methyl; p, phosphate; ac, acetyl; ub, ubiquitin) is
indicated, followed by the number of modifications (e.g., 1, 2, or 3 for mono-, di-, or
trimethylation, respectively). An example is H3R17me1,
34
which refers to monomethy-
lation at arginine 17 of histone H3. This nomenclature allows a clear and unambiguous
representation of specific histone modifications, and its knowledge is central to under-
standing the paragraphs that follow.
1.2 Alterations of histone modifications in human diseases
Increasing evidence has shown that aberrant profiles of histone posttranslational modifi-
cations are associated with a variety of human diseases, mainly because the dysregulation
of these modifications alters the chromatin structure and induces abnormal gene expres-
sion. The altered profiles often result from dysregulation of histone-modifying enzymes,
the key players underlying these changes.
35–37
Indeed, mutations and cytogenetic
alterations affecting genes encoding chromatin regulatory proteins are the main causes
of pathogenic alterations in histone modifications.
38–41
Histone modification alterations are especially linked to cancer. Modifications of all
four histones have been reported, although those affecting H3 and H4 are best under-
stood, and acetylation and methylation are the most intensively studied histone marks
affecting tumor development, disease progression, and response to therapy.
42
Human
tumors undergo a global loss of H4K16 acetylation and H4K20 trimethylation, which
are considered epigenetic markers of malignant transformation.
43,44
Interestingly, these
alterations have been assigned to DNA repetitive regions that undergo DNA hypo-
methylation in cancer cells, another hallmark of malignant transformation,
43
posing
the question of what takes place first. Regarding histone H3, the most studied residues
that undergo methylation are lysines 9 and 27 (H3K9 and H3K27), which results in sup-
pression of gene expression.
42,45
Conversely, methylation of lysines 4 and 36 of the same
histone (H3K4 and H3K36) promotes gene transcription.
42,45
For example, alterations in
H3K4 and H3K9 methylation are associated with several types of cancers
46
and result
from disturbance in the balance between histone methyltransferases (HMTs, writers)
and histone demethylases (HDMs, erasers). As expected, mutations and translocations
affecting genes encoding chromatin regulatory proteins are some of the causes leading
to this imbalance.
35–37,42
For example, among the various HMT enzymes, EZH2, NSD2, and DOT1L were
shown to be highly expressed in tumors,
42,46
and MLL is involved in chromosomal trans-
locations with various partners, especially in leukemia.
42,46
4 Histone modifications in therapy
oped.
34
Briefly, the name of the histone (e.g., H3) is followed by the single-letter amino
acid abbreviation (e.g., R for arginine) and the amino acid position in the protein (e.g.,
17); then, the type of modification (me, methyl; p, phosphate; ac, acetyl; ub, ubiquitin) is
indicated, followed by the number of modifications (e.g., 1, 2, or 3 for mono-, di-, or
trimethylation, respectively). An example is H3R17me1,
34
which refers to monomethy-
lation at arginine 17 of histone H3. This nomenclature allows a clear and unambiguous
representation of specific histone modifications, and its knowledge is central to under-
standing the paragraphs that follow.
1.2 Alterations of histone modifications in human diseases
Increasing evidence has shown that aberrant profiles of histone posttranslational modifi-
cations are associated with a variety of human diseases, mainly because the dysregulation
of these modifications alters the chromatin structure and induces abnormal gene expres-
sion. The altered profiles often result from dysregulation of histone-modifying enzymes,
the key players underlying these changes.
35–37
Indeed, mutations and cytogenetic
alterations affecting genes encoding chromatin regulatory proteins are the main causes
of pathogenic alterations in histone modifications.
38–41
Histone modification alterations are especially linked to cancer. Modifications of all
four histones have been reported, although those affecting H3 and H4 are best under-
stood, and acetylation and methylation are the most intensively studied histone marks
affecting tumor development, disease progression, and response to therapy.
42
Human
tumors undergo a global loss of H4K16 acetylation and H4K20 trimethylation, which
are considered epigenetic markers of malignant transformation.
43,44
Interestingly, these
alterations have been assigned to DNA repetitive regions that undergo DNA hypo-
methylation in cancer cells, another hallmark of malignant transformation,
43
posing
the question of what takes place first. Regarding histone H3, the most studied residues
that undergo methylation are lysines 9 and 27 (H3K9 and H3K27), which results in sup-
pression of gene expression.
42,45
Conversely, methylation of lysines 4 and 36 of the same
histone (H3K4 and H3K36) promotes gene transcription.
42,45
For example, alterations in
H3K4 and H3K9 methylation are associated with several types of cancers
46
and result
from disturbance in the balance between histone methyltransferases (HMTs, writers)
and histone demethylases (HDMs, erasers). As expected, mutations and translocations
affecting genes encoding chromatin regulatory proteins are some of the causes leading
to this imbalance.
35–37,42
For example, among the various HMT enzymes, EZH2, NSD2, and DOT1L were
shown to be highly expressed in tumors,
42,46
and MLL is involved in chromosomal trans-
locations with various partners, especially in leukemia.
42,46
4 Histone modifications in therapy
The lysine methyltransferase EZH2 is the catalytic subunit of the polycomb repressive
complex 2 (PRC2) and mediates the mono-, di-, and trimethylation of lysine 27 of
histone H3 (H3K27).
47
EZH2-catalyzed trimethylation of H3K27 induces the suppres-
sion of gene expression and high expression correlates with the onset and development of
various types of cancer, including non-Hodgkin lymphomas and prostate cancer.
36,48
NSD2 mediates dimethylation of H3K36, and it has been shown to primarily func-
tion as a transcriptional activator by increasing intragenic dimethylated H3K36 at active
genes.
49,50
For instance, NSD2 overexpression results from recurrent chromosomal
translocation t(4; 14) in multiple myeloma (MM)
51
or recurrent gain-of-function muta-
tions in lymphoid malignancies.
52,53
Chromosomal rearrangements at 11q23, which include the MLL gene (KMT2A,
lysine methyltransferase 2A), are associated with acute leukemia.
54–57
MLL is thought
to function primarily as a transcriptional activator, at least in part through trimethylation
of H3K4 at the promoters of active genes.
46
The HMT DOT1L, which was implicated in
the development of MLL-rearranged acute myeloid leukemia (AML), catalyzes the
methylation of H3K79.
58–60
H3K79me3 is often observed at the transcriptional start sites
of active genes and is believed to be important for efficient transcriptional elongation and
active gene expression.
60
Histone demethylases (HDMs), the “erasers” of methylation, form another family of
enzymes regulating histone methylation, which plays a role in tumor development.
46
LSD1 is a member of the FAD-dependent monooxidase family of enzymes and was
the first HDM to be discovered. It catalyzes the demethylation of the mono- and
dimethylated forms of H3K4 and H3K9.
61,62
Increased LSD1 expression was reported
in several cancers, including neuroblastoma,
63
prostate cancer,
64
colorectal and lung
cancer,
65
and hematopoietic cancers such as myelodysplastic syndrome (MDS) and
AML,
66
where it correlates with tumor onset and progression.
Loss of histone H3 acetylation at tumor suppressor genes is also observed in a variety
of cancers, where it correlates with gene repression.
67
Moreover, H3K4 acetylation in
breast cancer is associated with both early and late breast cancer cell phenotypes and is
overrepresented at promoters of genes associated with estrogen response and
epithelial-to-mesenchymal transition pathways.
68
Similarly to histone methylation, alterations in the histone acetylation status results
usually from an imbalance between histone acetyltransferase (HATs, writers) and histone
deacetylase (HDACs, erasers) activities.
Several HAT genes are altered by mutations, deletions, or translocations in various
types of cancers, resulting in HAT enzyme dysregulation.
67,69
HAT activity can also
be dysregulated by viral oncoproteins.
70
HATs play an important role in oncogenesis
by dysregulating not only the acetylation status of histones but also other nonhistone
proteins.
67
For example, MOF, a member of the MYST family, which preferentially cat-
alyzes acetylation of lysine 16 in H3 (H3K16), shows aberrant expression in some types of
5Histone modifications in diseases
complex 2 (PRC2) and mediates the mono-, di-, and trimethylation of lysine 27 of
histone H3 (H3K27).
47
EZH2-catalyzed trimethylation of H3K27 induces the suppres-
sion of gene expression and high expression correlates with the onset and development of
various types of cancer, including non-Hodgkin lymphomas and prostate cancer.
36,48
NSD2 mediates dimethylation of H3K36, and it has been shown to primarily func-
tion as a transcriptional activator by increasing intragenic dimethylated H3K36 at active
genes.
49,50
For instance, NSD2 overexpression results from recurrent chromosomal
translocation t(4; 14) in multiple myeloma (MM)
51
or recurrent gain-of-function muta-
tions in lymphoid malignancies.
52,53
Chromosomal rearrangements at 11q23, which include the MLL gene (KMT2A,
lysine methyltransferase 2A), are associated with acute leukemia.
54–57
MLL is thought
to function primarily as a transcriptional activator, at least in part through trimethylation
of H3K4 at the promoters of active genes.
46
The HMT DOT1L, which was implicated in
the development of MLL-rearranged acute myeloid leukemia (AML), catalyzes the
methylation of H3K79.
58–60
H3K79me3 is often observed at the transcriptional start sites
of active genes and is believed to be important for efficient transcriptional elongation and
active gene expression.
60
Histone demethylases (HDMs), the “erasers” of methylation, form another family of
enzymes regulating histone methylation, which plays a role in tumor development.
46
LSD1 is a member of the FAD-dependent monooxidase family of enzymes and was
the first HDM to be discovered. It catalyzes the demethylation of the mono- and
dimethylated forms of H3K4 and H3K9.
61,62
Increased LSD1 expression was reported
in several cancers, including neuroblastoma,
63
prostate cancer,
64
colorectal and lung
cancer,
65
and hematopoietic cancers such as myelodysplastic syndrome (MDS) and
AML,
66
where it correlates with tumor onset and progression.
Loss of histone H3 acetylation at tumor suppressor genes is also observed in a variety
of cancers, where it correlates with gene repression.
67
Moreover, H3K4 acetylation in
breast cancer is associated with both early and late breast cancer cell phenotypes and is
overrepresented at promoters of genes associated with estrogen response and
epithelial-to-mesenchymal transition pathways.
68
Similarly to histone methylation, alterations in the histone acetylation status results
usually from an imbalance between histone acetyltransferase (HATs, writers) and histone
deacetylase (HDACs, erasers) activities.
Several HAT genes are altered by mutations, deletions, or translocations in various
types of cancers, resulting in HAT enzyme dysregulation.
67,69
HAT activity can also
be dysregulated by viral oncoproteins.
70
HATs play an important role in oncogenesis
by dysregulating not only the acetylation status of histones but also other nonhistone
proteins.
67
For example, MOF, a member of the MYST family, which preferentially cat-
alyzes acetylation of lysine 16 in H3 (H3K16), shows aberrant expression in some types of
5Histone modifications in diseases
cancers, including breast cancer, medulloblastoma, ovarian cancer, and renal cell carci-
noma.
71
Conversely, decreased expression of Tip60 induces hypoacetylation of the p53
protein, thereby suppressing apoptotic signals and playing an antitumor role.
45,72
Mono-
allelic loss of the Tip60 gene was observed in lymphomas, mammary carcinomas, and
head and neck tumors.
72
In contrast to HATs, HDACs catalyze the removal of acetyl groups from lysine res-
idues and promote gene repression. The dysregulation of HDACs has been extensively
correlated with the occurrence of several cancers,
73,74
such as neuroblastoma, lung and
liver cancer, cutaneous T-cell lymphoma, and multiple myeloma, and, in most cases,
high levels of HDACs are associated with advanced disease and poor outcome.
75–79
In addition, these enzymes also deacetylate a large number of nonhistone proteins, which
may be involved in the regulation of cell cycle, apoptosis, DNA-damage response, metas-
tasis, and other cellular processes central to tumorigenesis.
74
Acetylated lysine residues in histones also provide a specific binding site for the
bromodomain and extra-terminal (BET) family of proteins via their bromodomains.
These proteins are considered readers of chromatin status and are able to recruit positive
transcription elongation factors (pTEFb) and mediator complexes to chromatin.
42,80
BET proteins have been reported to participate in the development of various cancers,
including AML, MDS, lymphoma, multiple myeloma, and prostate and pancreatic
cancers.
81
In addition to the dysregulation of histone-modifying enzymes, nucleosome
dynamics can be altered by mutations targeting residues that are subjected to posttrans-
lational modifications or are in close proximity to them.
82–84
For example, exon
sequencing has identified K27M mutationsin the H3F3A gene, a variant encoding his-
tone H3.3, in pediatric glioblastomas,whichleadtoaglobalreductioninH3K27
trimethylation.
85
Also, in the context of cancer therapy, some recent studies have shown that, in addi-
tion to regulating the behavior of cancer cells, posttranslational modification of histones
may also regulate immune response. In this regard, histone modifications were reported
to influence the behavior of immune cells, such as dendritic cells (DCs), macrophages,
cytotoxic T cells, NK cells, regulatory T cells (Tregs), and myeloid-derived suppressor
cells (MDSCs), involved in the recognition and elimination of cancer cells.
86
Indeed,
histone acetylation and methylation were shown to regulate the immune response by
modulating the immunogenicity of cancer cells and affecting the expression of effector
molecules and the differentiation and function of immune cells.
69
Therefore histone
modification modulators in combination with immunotherapy should result in greater
therapeutic efficacy. This hypothesis was corroborated by recent studies that have shown
that immunotherapy in combination with HDAC inhibitors, and also HMT inhibitors or
HDM inhibitors, although less commonly, is able to enhance immune response and
overcome acquired resistance to immunotherapy.
69,87–91
6 Histone modifications in therapy
noma.
71
Conversely, decreased expression of Tip60 induces hypoacetylation of the p53
protein, thereby suppressing apoptotic signals and playing an antitumor role.
45,72
Mono-
allelic loss of the Tip60 gene was observed in lymphomas, mammary carcinomas, and
head and neck tumors.
72
In contrast to HATs, HDACs catalyze the removal of acetyl groups from lysine res-
idues and promote gene repression. The dysregulation of HDACs has been extensively
correlated with the occurrence of several cancers,
73,74
such as neuroblastoma, lung and
liver cancer, cutaneous T-cell lymphoma, and multiple myeloma, and, in most cases,
high levels of HDACs are associated with advanced disease and poor outcome.
75–79
In addition, these enzymes also deacetylate a large number of nonhistone proteins, which
may be involved in the regulation of cell cycle, apoptosis, DNA-damage response, metas-
tasis, and other cellular processes central to tumorigenesis.
74
Acetylated lysine residues in histones also provide a specific binding site for the
bromodomain and extra-terminal (BET) family of proteins via their bromodomains.
These proteins are considered readers of chromatin status and are able to recruit positive
transcription elongation factors (pTEFb) and mediator complexes to chromatin.
42,80
BET proteins have been reported to participate in the development of various cancers,
including AML, MDS, lymphoma, multiple myeloma, and prostate and pancreatic
cancers.
81
In addition to the dysregulation of histone-modifying enzymes, nucleosome
dynamics can be altered by mutations targeting residues that are subjected to posttrans-
lational modifications or are in close proximity to them.
82–84
For example, exon
sequencing has identified K27M mutationsin the H3F3A gene, a variant encoding his-
tone H3.3, in pediatric glioblastomas,whichleadtoaglobalreductioninH3K27
trimethylation.
85
Also, in the context of cancer therapy, some recent studies have shown that, in addi-
tion to regulating the behavior of cancer cells, posttranslational modification of histones
may also regulate immune response. In this regard, histone modifications were reported
to influence the behavior of immune cells, such as dendritic cells (DCs), macrophages,
cytotoxic T cells, NK cells, regulatory T cells (Tregs), and myeloid-derived suppressor
cells (MDSCs), involved in the recognition and elimination of cancer cells.
86
Indeed,
histone acetylation and methylation were shown to regulate the immune response by
modulating the immunogenicity of cancer cells and affecting the expression of effector
molecules and the differentiation and function of immune cells.
69
Therefore histone
modification modulators in combination with immunotherapy should result in greater
therapeutic efficacy. This hypothesis was corroborated by recent studies that have shown
that immunotherapy in combination with HDAC inhibitors, and also HMT inhibitors or
HDM inhibitors, although less commonly, is able to enhance immune response and
overcome acquired resistance to immunotherapy.
69,87–91
6 Histone modifications in therapy
Besides what has been reported for cancer, the modulation of histone modifications is
also common in diseases wherein the immune system has a central role, including infec-
tious and autoimmune diseases.
Although less studied than cancer, a wide body of evidence has related pathogen
infection with the alteration of histone marks in cells involved in the immune response
triggered to neutralize them. Indeed, it is now recognized that infectious pathogens have
the ability to shape gene expression in host cells for their own benefit, dampening host
immune responses and potentiating their growth. Accordingly, some reports have shown
that this can be achieved by inducing chromatin structure alterations through mecha-
nisms such as histone posttranslational modifications.
92–100
Briefly, following infection,
bacterial components such as lipopolysaccharide (LPS) are sensed by immune cells, which
promote an inflammatory response with the objective of eliminating the pathogen.
101
However, for pathogenic bacteria to maintain a long-term presence, they develop mech-
anisms to limit the inflammatory response by silencing certain immunomodulatory genes
through the alteration of histone marks.
92
Some studies have shown that bacteria target histone modifications on immune cells
through effectors that can change signaling events involved in the recruitment or inhibi-
tion of host chromatin-modifying enzymes and/or factors that mimic them.
92
For
instance,Pseudomonas aeruginosa, apathogen responsiblefor nosocomialinfections,secretes
2-aminoacetophenone, which has antiinflammatory effects through increasing HDAC
expression in monocytes and consequent deacetylation of histone H3K18 at promoters
of inflammatory genes, including the tumor necrosis factor alpha (TNFα).
102
As another
example, the Rv1988 protein, which is secreted by pathogenicMycobacterium tuberculosis,
translocates to the nucleus, where it works as a methyltransferase, specifically targeting
H3R42me2 in promoters of critical immune response genes, including NOX1,
NOX4, and NOS2, and therefore repressing their transcription.
103
Most histone modifications studies in infectious diseases are related to bacteria, includ-
ingHelicobacter pylori, which causes gastritis and stomach ulcers;Shigella flexneri, the etiologic
agent of dysentery in humans; andLegionella pneumophila, which is the causative agent of
Legionnaires’ disease (also known as legionellosis).
92,104–106
Additionally, there have also
been reports regarding viruses (e.g., influenza virus, human immunodeficiency virus,
and herpes simplex virus)
93–96,100,106
and protozoans (e.g.,Trichomonas vaginalisand
Leishmania).
97,99
Altogether, these studies uncover the potential of manipulating histone
modifications to treat infectious diseases.
Autoimmune diseases are chronic inflammatory disorders characterized by the loss of
immunological tolerance to self-antigens and the presence of autoantibodies, autoreac-
tive T and B cells, and/or impaired suppressive function of regulatory T cells. Even
though the pathogenesis remains largely unknown due to its inherent complexity, accu-
mulating evidence has indicated a potential role for epigenetic mechanisms, including
histone modifications, in the development of autoimmune diseases such as rheumatoid
7Histone modifications in diseases
also common in diseases wherein the immune system has a central role, including infec-
tious and autoimmune diseases.
Although less studied than cancer, a wide body of evidence has related pathogen
infection with the alteration of histone marks in cells involved in the immune response
triggered to neutralize them. Indeed, it is now recognized that infectious pathogens have
the ability to shape gene expression in host cells for their own benefit, dampening host
immune responses and potentiating their growth. Accordingly, some reports have shown
that this can be achieved by inducing chromatin structure alterations through mecha-
nisms such as histone posttranslational modifications.
92–100
Briefly, following infection,
bacterial components such as lipopolysaccharide (LPS) are sensed by immune cells, which
promote an inflammatory response with the objective of eliminating the pathogen.
101
However, for pathogenic bacteria to maintain a long-term presence, they develop mech-
anisms to limit the inflammatory response by silencing certain immunomodulatory genes
through the alteration of histone marks.
92
Some studies have shown that bacteria target histone modifications on immune cells
through effectors that can change signaling events involved in the recruitment or inhibi-
tion of host chromatin-modifying enzymes and/or factors that mimic them.
92
For
instance,Pseudomonas aeruginosa, apathogen responsiblefor nosocomialinfections,secretes
2-aminoacetophenone, which has antiinflammatory effects through increasing HDAC
expression in monocytes and consequent deacetylation of histone H3K18 at promoters
of inflammatory genes, including the tumor necrosis factor alpha (TNFα).
102
As another
example, the Rv1988 protein, which is secreted by pathogenicMycobacterium tuberculosis,
translocates to the nucleus, where it works as a methyltransferase, specifically targeting
H3R42me2 in promoters of critical immune response genes, including NOX1,
NOX4, and NOS2, and therefore repressing their transcription.
103
Most histone modifications studies in infectious diseases are related to bacteria, includ-
ingHelicobacter pylori, which causes gastritis and stomach ulcers;Shigella flexneri, the etiologic
agent of dysentery in humans; andLegionella pneumophila, which is the causative agent of
Legionnaires’ disease (also known as legionellosis).
92,104–106
Additionally, there have also
been reports regarding viruses (e.g., influenza virus, human immunodeficiency virus,
and herpes simplex virus)
93–96,100,106
and protozoans (e.g.,Trichomonas vaginalisand
Leishmania).
97,99
Altogether, these studies uncover the potential of manipulating histone
modifications to treat infectious diseases.
Autoimmune diseases are chronic inflammatory disorders characterized by the loss of
immunological tolerance to self-antigens and the presence of autoantibodies, autoreac-
tive T and B cells, and/or impaired suppressive function of regulatory T cells. Even
though the pathogenesis remains largely unknown due to its inherent complexity, accu-
mulating evidence has indicated a potential role for epigenetic mechanisms, including
histone modifications, in the development of autoimmune diseases such as rheumatoid
7Histone modifications in diseases
arthritis, systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis, and type 1 diabetes.
40
Hence,
histone modifications in immune cells (e.g., B lymphocytes, monocytes, and
T lymphocytes) may contribute to the dysregulation of immune response.
40,107–110
The previous findings will most likely lead to the development of new epigenetic ther-
apeutic strategies. Nevertheless, further studies are required to understand the function of
several histone modifications implicated in the pathogenesis of autoimmune diseases.
Over the past two decades, the role of epigenetic mechanisms in the function and
homeostasis of the central nervous system (CNS) has been unveiled. Moreover, several
neurological disorders have been associated with long-term changes in gene expression
related to chromatin structure alterations.
111
Indeed, the two most common neurode-
generative diseases, Alzheimer‘s disease and Parkinson’s disease, have been shown to
be affected by alterations in histone modifications,
112
and several HDAC, HMT, and
HAT inhibitors are currently under clinical trials to treat these and other neurodegener-
ative diseases.
113
Finally, although current knowledge regarding epigenetic mechanisms in cardiovas-
cular diseases (CVDs) is still limited, preclinical studies in animal models have given some
clues on the important role of histone posttranslational modifications in the pathogenesis
of CVDs, which are the primary cause of death worldwide. Endothelial cell dysfunction
and vascular smooth muscle cell dedifferentiation, proliferation, and migration are
phenotypic changes characteristic of CVD manifestation and result from broad changes
in gene expression. Supporting a role for histone modifications in regulating gene expres-
sion in CVD, inhibition of HDACs, HMTs, HDMs, or BET family of proteins were
shown to prevent many of the cell phenotype changes associated with its pathogene-
sis.
114–118
Specifically, histone methylation and histone acetylation in monocytes, mac-
rophages, smooth muscle cells, and endothelial cells during atherosclerosis development
have been reported.
119,120
Also, substantial evidence suggests HDACs as therapeutic
targets for heart failure.
121–124
In addition, other conditions that are important cardiovascular risk factors, such as
hypertension, diabetes, and obesity (especially visceral obesity and ectopic fat accumula-
tion), are also affected by epigenetic alterations. Therefore targeting the mechanisms
behind these alterations are currently considered as potential preventive and therapeutic
approaches.
Hypertension results from complex interactions between genes and environmental
factors, and recent evidence implicates posttranslational histone modifications, such as
methylation, acetylation, and phosphorylation, in its development.
125–127
Like other vas-
cular pathologies, HDAC and BET inhibition tend to have similar beneficial effects on
hypertension.
128,129
Nevertheless, HDAC-mediated regulation of hypertension appears
to depend on the experimental model used, as other authors did not find HDAC
inhibitor-mediated effects on blood pressure.
130
8 Histone modifications in therapy
40
Hence,
histone modifications in immune cells (e.g., B lymphocytes, monocytes, and
T lymphocytes) may contribute to the dysregulation of immune response.
40,107–110
The previous findings will most likely lead to the development of new epigenetic ther-
apeutic strategies. Nevertheless, further studies are required to understand the function of
several histone modifications implicated in the pathogenesis of autoimmune diseases.
Over the past two decades, the role of epigenetic mechanisms in the function and
homeostasis of the central nervous system (CNS) has been unveiled. Moreover, several
neurological disorders have been associated with long-term changes in gene expression
related to chromatin structure alterations.
111
Indeed, the two most common neurode-
generative diseases, Alzheimer‘s disease and Parkinson’s disease, have been shown to
be affected by alterations in histone modifications,
112
and several HDAC, HMT, and
HAT inhibitors are currently under clinical trials to treat these and other neurodegener-
ative diseases.
113
Finally, although current knowledge regarding epigenetic mechanisms in cardiovas-
cular diseases (CVDs) is still limited, preclinical studies in animal models have given some
clues on the important role of histone posttranslational modifications in the pathogenesis
of CVDs, which are the primary cause of death worldwide. Endothelial cell dysfunction
and vascular smooth muscle cell dedifferentiation, proliferation, and migration are
phenotypic changes characteristic of CVD manifestation and result from broad changes
in gene expression. Supporting a role for histone modifications in regulating gene expres-
sion in CVD, inhibition of HDACs, HMTs, HDMs, or BET family of proteins were
shown to prevent many of the cell phenotype changes associated with its pathogene-
sis.
114–118
Specifically, histone methylation and histone acetylation in monocytes, mac-
rophages, smooth muscle cells, and endothelial cells during atherosclerosis development
have been reported.
119,120
Also, substantial evidence suggests HDACs as therapeutic
targets for heart failure.
121–124
In addition, other conditions that are important cardiovascular risk factors, such as
hypertension, diabetes, and obesity (especially visceral obesity and ectopic fat accumula-
tion), are also affected by epigenetic alterations. Therefore targeting the mechanisms
behind these alterations are currently considered as potential preventive and therapeutic
approaches.
Hypertension results from complex interactions between genes and environmental
factors, and recent evidence implicates posttranslational histone modifications, such as
methylation, acetylation, and phosphorylation, in its development.
125–127
Like other vas-
cular pathologies, HDAC and BET inhibition tend to have similar beneficial effects on
hypertension.
128,129
Nevertheless, HDAC-mediated regulation of hypertension appears
to depend on the experimental model used, as other authors did not find HDAC
inhibitor-mediated effects on blood pressure.
130
8 Histone modifications in therapy
The study of epigenetics in metabolic diseases is still a young research field. Never-
theless, a wide body of evidence suggests that when people with obesity and diabetes fol-
low an unhealthy diet, it may affect their epigenome and thereby disease pathogenesis.
131
Indeed, it is already known that disruption of histone modifications impacting on gene
expression contributes to type 2 diabetes (T2D) and obesity.
T2D is characterized by chronically elevated blood glucose levels, which develop due
to insulin resistance, for which aging, a sedentary lifestyle, and obesity are important con-
tributing factors, in combination with impaired insulin secretion. Importantly, five mil-
lion people die due to diabetes every year, most often because of cardiovascular
incidents,
132
and epigenetic changes in patients with diabetes may effectively contribute
to vascular complications. Notably, there are some studies showing that HDACs regulate
glucose homeostasis, pancreatic islet function, and inflammation.
133–138
However,
HDAC inhibition has been known to enhance insulin secretion, decrease inflammation,
and improve insulin sensitivity.
139–142
Moreover, BET protein inhibition appears to pro-
mote insulin production and pancreatic beta cell differentiation.
143,144
The potential role of epigenetic modifications in developing an obese phenotype was
also unveiled. For example, when fed with the same high-fat diet, wild-type mice gained
weight, became obese, and had reduced glucose tolerance with increased serum insulin,
whereas HDAC3 knockout mice did not develop obesity and had less liver fat and smaller
adipocytes.
145
Importantly, disruption of HDAC3 in intestinal epithelial cells of obese
mice led to weight loss and improved the metabolic profile.
145
Another study has shown
that quercitine and a derivative were able to prevent obesity in rats through the induction
of repressive histone modifications leading to reduced expression of c/EBPαand
PPARγ.
146
Therefore interfering with histone modifications is currently seen as a prom-
ising therapeutic strategy in both T2D and obesity.
131
Importantly, the reversibility and accessibility of epigenetic modifications offer an
opportunity to develop new strategies for the treatment of diseases.
42
Therefore advances
in our understanding of the roles of histone modifications and alterations will prompt the
development of new targeted therapeutic strategies for a range of human diseases. Several
of these epigenetic therapies are inclusively already in clinical use and even more are
being evaluated in clinical trials.
References
1.Lee TI, Young RA. Transcriptional regulation and its misregulation in disease.Cell. 2013;
152(6):1237–1251.
2.Bhaumik SR, Smith E, Shilatifard A. Covalent modifications of histones during development and
disease pathogenesis.Nat Struct Mol Biol. 2007;14(11):1008–1016.
3.Zheng H, Xie W. The role of 3D genome organization in development and cell differentiation.Nat
Rev Mol Cell Biol. 2019;20:535–550.
9
Histone modifications in diseases
theless, a wide body of evidence suggests that when people with obesity and diabetes fol-
low an unhealthy diet, it may affect their epigenome and thereby disease pathogenesis.
131
Indeed, it is already known that disruption of histone modifications impacting on gene
expression contributes to type 2 diabetes (T2D) and obesity.
T2D is characterized by chronically elevated blood glucose levels, which develop due
to insulin resistance, for which aging, a sedentary lifestyle, and obesity are important con-
tributing factors, in combination with impaired insulin secretion. Importantly, five mil-
lion people die due to diabetes every year, most often because of cardiovascular
incidents,
132
and epigenetic changes in patients with diabetes may effectively contribute
to vascular complications. Notably, there are some studies showing that HDACs regulate
glucose homeostasis, pancreatic islet function, and inflammation.
133–138
However,
HDAC inhibition has been known to enhance insulin secretion, decrease inflammation,
and improve insulin sensitivity.
139–142
Moreover, BET protein inhibition appears to pro-
mote insulin production and pancreatic beta cell differentiation.
143,144
The potential role of epigenetic modifications in developing an obese phenotype was
also unveiled. For example, when fed with the same high-fat diet, wild-type mice gained
weight, became obese, and had reduced glucose tolerance with increased serum insulin,
whereas HDAC3 knockout mice did not develop obesity and had less liver fat and smaller
adipocytes.
145
Importantly, disruption of HDAC3 in intestinal epithelial cells of obese
mice led to weight loss and improved the metabolic profile.
145
Another study has shown
that quercitine and a derivative were able to prevent obesity in rats through the induction
of repressive histone modifications leading to reduced expression of c/EBPαand
PPARγ.
146
Therefore interfering with histone modifications is currently seen as a prom-
ising therapeutic strategy in both T2D and obesity.
131
Importantly, the reversibility and accessibility of epigenetic modifications offer an
opportunity to develop new strategies for the treatment of diseases.
42
Therefore advances
in our understanding of the roles of histone modifications and alterations will prompt the
development of new targeted therapeutic strategies for a range of human diseases. Several
of these epigenetic therapies are inclusively already in clinical use and even more are
being evaluated in clinical trials.
References
1.Lee TI, Young RA. Transcriptional regulation and its misregulation in disease.Cell. 2013;
152(6):1237–1251.
2.Bhaumik SR, Smith E, Shilatifard A. Covalent modifications of histones during development and
disease pathogenesis.Nat Struct Mol Biol. 2007;14(11):1008–1016.
3.Zheng H, Xie W. The role of 3D genome organization in development and cell differentiation.Nat
Rev Mol Cell Biol. 2019;20:535–550.
9
Histone modifications in diseases
4.Turner BM. Defining an epigenetic code.Nat Cell Biol. 2007;9(1):2–6.
5.Luger K, M€ader AW, Richmond RK, Sargent DF, Richmond TJ. Crystal structure of the nucleosome
core particle at 2.8 A
˚
resolution.Nature. 1997;389(6648):251–260.
6.Jenuwein T, Allis CD. Translating the histone code.Science. 2001;293(5532):1074–1080.
7.Andrews AJ, Luger K. Nucleosome structure(s) and stability: variations on a theme.Annu Rev Biophys.
2011;40:99–117.
8.Grigoryev SA, Woodcock CL. Chromatin organization—the 30 nm fiber.Exp Cell Res. 2012;318
(12):1448–1455.
9.Post CB, Zimm BH. Theory of DNA condensation: collapse versus aggregation.Biopolymers. 1982;21
(11):2123–2137.
10.Ehrenhofer-Murray AE. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair.Eur
J Biochem. 2004;271(12):2335–2349.
11.Wolffe AP, Guschin D. Review: chromatin structural features and targets that regulate transcription.
J Struct Biol. 2000;129(2–3):102–122.
12.Zhang L, Xie WJ, Liu S, Meng L, Gu C, Gao YQ. DNA methylation landscape reflects the spatial
organization of chromatin in different cells.Biophys J. 2017;113(7):1395–1404.
13.Chodavarapu RK, Feng S, Bernatavichute YV, et al. Relationship between nucleosome positioning
and DNA methylation.Nature. 2010;466(7304):388–392.
14.Bird AP, Wolffe AP. Methylation-induced repression—belts, braces, and chromatin.Cell. 1999;99
(5):451– 454.
15.Bell AC, Felsenfeld G. Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of
the Igf2 gene.Nature. 2000;405(6785):482–485.
16.Bartke T, Vermeulen M, Xhemalce B, Robson SC, Mann M, Kouzarides T. Nucleosome-interacting
proteins regulated by DNA and histone methylation.Cell. 2010;143(3):470–484.
17.Rose NR, Klose RJ. Understanding the relationship between DNA methylation and histone lysine
methylation.Biochim Biophys Acta. 2014;1839(12):1362–1372.
18.Bannister
AJ, Kouzarides T. Regulation of chromatin by histone modifications.Cell Res. 2011;21
(3):381– 395.
19.Torres IO, Fujimori DG. Functional coupling between writers, erasers and readers of histone and
DNA methylation.Curr Opin Struct Biol. 2015;35:68–75.
20.Kaelin WG, McKnight SL. Influence of metabolism on epigenetics and disease.Cell. 2013;153
(1):56–69.
21.Eberharter A, Becker PB. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin.
Second in review series on chromatin dynamics.EMBO Rep. 2002;3(3):224–229.
22.G€orisch SM, Wachsmuth M, To´th KF, Lichter P, Rippe K. Histone acetylation increases chromatin
accessibility.J Cell Sci. 2005;118(pt 24):5825–5834.
23.Wang Z, Zang C, Rosenfeld JA, et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations
in the human genome.Nat Genet. 2008;40(7):897–903.
24.Roh T, Wei G, Farrell CM, Zhao K. Genome-wide prediction of conserved and nonconserved
enhancers by histone acetylation patterns.Genome Res. 2007;17(1):74–81.
25.Fyodorov DV, Zhou B-R, Skoultchi AI, Bai Y. Emerging roles of linker histones in regulating chro-
matin structure and function.Nat Rev Mol Cell Biol. 2018;19(3):192–206.
26.Minsky N, Shema E, Field Y, Schuster M, Segal E, Oren M. Monoubiquitinated H2B is associated
with the transcribed region of highly expressed genes in human cells.Nat Cell Biol. 2008;10
(4):483– 488.
27.Shilatifard A. Chromatin modifications by methylation and ubiquitination: implications in the regu-
lation of gene expression.Annu Rev Biochem. 2006;75:243–269.
28.Zhang Y. Transcriptional regulation by histone ubiquitination and deubiquitination.Genes Dev.
2003;17(22):2733–2740.
29.Ruthenburg AJ, Li H, Patel DJ, Allis CD. Multivalent engagement of chromatin modifications by
linked binding modules.Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8(12):983–994.
30.Musselman CA, Lalonde M-E, C^ote
histone readers.Nat Struct Mol Biol. 2012;19(12):1218–1227.
10
Histone modifications in therapy
5.Luger K, M€ader AW, Richmond RK, Sargent DF, Richmond TJ. Crystal structure of the nucleosome
core particle at 2.8 A
˚
resolution.Nature. 1997;389(6648):251–260.
6.Jenuwein T, Allis CD. Translating the histone code.Science. 2001;293(5532):1074–1080.
7.Andrews AJ, Luger K. Nucleosome structure(s) and stability: variations on a theme.Annu Rev Biophys.
2011;40:99–117.
8.Grigoryev SA, Woodcock CL. Chromatin organization—the 30 nm fiber.Exp Cell Res. 2012;318
(12):1448–1455.
9.Post CB, Zimm BH. Theory of DNA condensation: collapse versus aggregation.Biopolymers. 1982;21
(11):2123–2137.
10.Ehrenhofer-Murray AE. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair.Eur
J Biochem. 2004;271(12):2335–2349.
11.Wolffe AP, Guschin D. Review: chromatin structural features and targets that regulate transcription.
J Struct Biol. 2000;129(2–3):102–122.
12.Zhang L, Xie WJ, Liu S, Meng L, Gu C, Gao YQ. DNA methylation landscape reflects the spatial
organization of chromatin in different cells.Biophys J. 2017;113(7):1395–1404.
13.Chodavarapu RK, Feng S, Bernatavichute YV, et al. Relationship between nucleosome positioning
and DNA methylation.Nature. 2010;466(7304):388–392.
14.Bird AP, Wolffe AP. Methylation-induced repression—belts, braces, and chromatin.Cell. 1999;99
(5):451– 454.
15.Bell AC, Felsenfeld G. Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of
the Igf2 gene.Nature. 2000;405(6785):482–485.
16.Bartke T, Vermeulen M, Xhemalce B, Robson SC, Mann M, Kouzarides T. Nucleosome-interacting
proteins regulated by DNA and histone methylation.Cell. 2010;143(3):470–484.
17.Rose NR, Klose RJ. Understanding the relationship between DNA methylation and histone lysine
methylation.Biochim Biophys Acta. 2014;1839(12):1362–1372.
18.Bannister
AJ, Kouzarides T. Regulation of chromatin by histone modifications.Cell Res. 2011;21
(3):381– 395.
19.Torres IO, Fujimori DG. Functional coupling between writers, erasers and readers of histone and
DNA methylation.Curr Opin Struct Biol. 2015;35:68–75.
20.Kaelin WG, McKnight SL. Influence of metabolism on epigenetics and disease.Cell. 2013;153
(1):56–69.
21.Eberharter A, Becker PB. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin.
Second in review series on chromatin dynamics.EMBO Rep. 2002;3(3):224–229.
22.G€orisch SM, Wachsmuth M, To´th KF, Lichter P, Rippe K. Histone acetylation increases chromatin
accessibility.J Cell Sci. 2005;118(pt 24):5825–5834.
23.Wang Z, Zang C, Rosenfeld JA, et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations
in the human genome.Nat Genet. 2008;40(7):897–903.
24.Roh T, Wei G, Farrell CM, Zhao K. Genome-wide prediction of conserved and nonconserved
enhancers by histone acetylation patterns.Genome Res. 2007;17(1):74–81.
25.Fyodorov DV, Zhou B-R, Skoultchi AI, Bai Y. Emerging roles of linker histones in regulating chro-
matin structure and function.Nat Rev Mol Cell Biol. 2018;19(3):192–206.
26.Minsky N, Shema E, Field Y, Schuster M, Segal E, Oren M. Monoubiquitinated H2B is associated
with the transcribed region of highly expressed genes in human cells.Nat Cell Biol. 2008;10
(4):483– 488.
27.Shilatifard A. Chromatin modifications by methylation and ubiquitination: implications in the regu-
lation of gene expression.Annu Rev Biochem. 2006;75:243–269.
28.Zhang Y. Transcriptional regulation by histone ubiquitination and deubiquitination.Genes Dev.
2003;17(22):2733–2740.
29.Ruthenburg AJ, Li H, Patel DJ, Allis CD. Multivalent engagement of chromatin modifications by
linked binding modules.Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8(12):983–994.
30.Musselman CA, Lalonde M-E, C^ote
histone readers.Nat Struct Mol Biol. 2012;19(12):1218–1227.
10
Histone modifications in therapy
31.Rothbart SB, Strahl BD. Interpreting the language of histone and DNA modifications.Biochim Biophys
Acta. 2014;1839(8):627–643.
32.Talbert PB, Henikoff S. Histone variants on the move: substrates for chromatin dynamics.Nat Rev Mol
Cell Biol. 2017;18(2):115–126.
33.Henikoff S, Smith MM. Histone variants and epigenetics.Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;7(1):
a019364.
34.Turner BM. Reading signals on the nucleosome with a new nomenclature for modified histones.Nat
Struct Mol Biol. 2005;12(2):110–112.
35.Van Haaften G, Dalgliesh GL, Davies H, et al. Somatic mutations of the histone H3K27 demethylase
gene UTX in human cancer.Nat Genet. 2009;41(5):521–523.
36.Morin RD, Mendez-Lago M, Mungall AJ, et al. Frequent mutation of histone-modifying genes in
non-Hodgkin lymphoma.Nature. 2011;476(7360):298–303.
37.Nikoloski G, Langemeijer SMC, Kuiper RP, et al. Somatic mutations of the histone methyltransferase
gene EZH2 in myelodysplastic syndromes.Nat Genet. 2010;42(8):665–667.
38.Garraway LA, Lander ES. Lessons from the cancer genome.Cell. 2013;153(1):17–37.
39.Vogelstein B, Papadopoulos N, Velculescu VE, Zhou S, Diaz LA, Kinzler KW. Cancer genome
landscapes.Science. 2013;339(6127):1546–1558.
40.Araki Y, Mimura T. The histone modification code in the pathogenesis of autoimmune diseases.Med-
iat Inflamm. 2017;2017:2608605.
41.Keating ST, van Diepen JA, Riksen NP, El-Osta A. Epigenetics in diabetic nephropathy, immunity
and metabolism.Diabetologia. 2018;61(1):6–20.
42.Brien GL, Valerio DG, Armstrong SA. Exploiting the epigenome to control cancer-promoting gene-
expression programs.Cancer Cell. 2016;29(4):464 –476.
43.Fraga MF, Ballestar E, Villar-Garea A, et al. Loss of acetylation at Lys16 and trimethylation at Lys20 of
histone H4 is a common hallmark of human cancer.Nat Genet. 2005;37(4):391–400.
44.Fraga MF, Esteller M. Towards the human cancer epigenome: a first draft of histone modifications.Cell
Cycle. 2005;4(10):1377–1381.
45.Ellis L, Atadja PW, Johnstone RW. Epigenetics in cancer: targeting chromatin modifications.Mol Can-
cer Ther. 2009;8(6):1409–1420.
46.Hyun K, Jeon J, Park K, Kim J. Writing, erasing and reading histone lysine methylations.Exp
Mol Med.
2017;49(4):e324.
47.Conway E, Healy E, Bracken AP. PRC2 mediated H3K27 methylations in cellular identity and cancer.
Curr Opin Cell Biol. 2015;37:42–48.
48.Xu K, Wu ZJ, Groner AC, et al. EZH2 oncogenic activity in castration-resistant prostate cancer cells is
Polycomb-independent.Science. 2012;338(6113):1465–1469.
49.Huang Z, Wu H, Chuai S, et al. NSD2 is recruited through its PHD domain to oncogenic gene loci to
drive multiple myeloma.Cancer Res. 2013;73(20):6277–6288.
50.Kuo AJ, Cheung P, Chen K, et al. NSD2 links dimethylation of histone H3 at lysine 36 to oncogenic
programming.Mol Cell. 2011;44(4):609–620.
51.Chesi M, Nardini E, Lim RS, Smith KD, Kuehl WM, Bergsagel PL. The t(4;14) translocation in
myeloma dysregulates both FGFR3 and a novel gene, MMSET, resulting in IgH/MMSET hybrid
transcripts.Blood. 1998;92(9):3025–3034.
52.Jaffe JD, Wang Y, Chan HM, et al. Global chromatin profiling reveals NSD2 mutations in pediatric
acute lymphoblastic leukemia.Nat Genet. 2013;45(11):1386–1391.
53.Oyer JA, Huang X, Zheng Y, et al. Point mutation E1099K in MMSET/NSD2 enhances its methyl-
transferase activity and leads to altered global chromatin methylation in lymphoid malignancies.
Leukemia. 2014;28(1):198–201.
54.Djabali M, Selleri L, Parry P, Bower M, Young B, Evans GA. A trithorax-like gene is interrupted by
chromosome 11q23 translocations in acute leukaemias.Nat Genet. 1993;4(4):431.
55.Gu Y, Nakamura T, Alder H, et al. The t(4;11) chromosome translocation of human acute leukemias
fuses the ALL-1 gene, related to Drosophila trithorax, to the AF-4 gene.Cell. 1992;71(4):701–708.
56.Tkachuk DC, Kohler S, Cleary ML. Involvement of a homolog of Drosophila trithorax by 11q23
chromosomal translocations in acute leukemias.Cell. 1992;71(4):691–700.
11
Histone modifications in diseases
Acta. 2014;1839(8):627–643.
32.Talbert PB, Henikoff S. Histone variants on the move: substrates for chromatin dynamics.Nat Rev Mol
Cell Biol. 2017;18(2):115–126.
33.Henikoff S, Smith MM. Histone variants and epigenetics.Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;7(1):
a019364.
34.Turner BM. Reading signals on the nucleosome with a new nomenclature for modified histones.Nat
Struct Mol Biol. 2005;12(2):110–112.
35.Van Haaften G, Dalgliesh GL, Davies H, et al. Somatic mutations of the histone H3K27 demethylase
gene UTX in human cancer.Nat Genet. 2009;41(5):521–523.
36.Morin RD, Mendez-Lago M, Mungall AJ, et al. Frequent mutation of histone-modifying genes in
non-Hodgkin lymphoma.Nature. 2011;476(7360):298–303.
37.Nikoloski G, Langemeijer SMC, Kuiper RP, et al. Somatic mutations of the histone methyltransferase
gene EZH2 in myelodysplastic syndromes.Nat Genet. 2010;42(8):665–667.
38.Garraway LA, Lander ES. Lessons from the cancer genome.Cell. 2013;153(1):17–37.
39.Vogelstein B, Papadopoulos N, Velculescu VE, Zhou S, Diaz LA, Kinzler KW. Cancer genome
landscapes.Science. 2013;339(6127):1546–1558.
40.Araki Y, Mimura T. The histone modification code in the pathogenesis of autoimmune diseases.Med-
iat Inflamm. 2017;2017:2608605.
41.Keating ST, van Diepen JA, Riksen NP, El-Osta A. Epigenetics in diabetic nephropathy, immunity
and metabolism.Diabetologia. 2018;61(1):6–20.
42.Brien GL, Valerio DG, Armstrong SA. Exploiting the epigenome to control cancer-promoting gene-
expression programs.Cancer Cell. 2016;29(4):464 –476.
43.Fraga MF, Ballestar E, Villar-Garea A, et al. Loss of acetylation at Lys16 and trimethylation at Lys20 of
histone H4 is a common hallmark of human cancer.Nat Genet. 2005;37(4):391–400.
44.Fraga MF, Esteller M. Towards the human cancer epigenome: a first draft of histone modifications.Cell
Cycle. 2005;4(10):1377–1381.
45.Ellis L, Atadja PW, Johnstone RW. Epigenetics in cancer: targeting chromatin modifications.Mol Can-
cer Ther. 2009;8(6):1409–1420.
46.Hyun K, Jeon J, Park K, Kim J. Writing, erasing and reading histone lysine methylations.Exp
Mol Med.
2017;49(4):e324.
47.Conway E, Healy E, Bracken AP. PRC2 mediated H3K27 methylations in cellular identity and cancer.
Curr Opin Cell Biol. 2015;37:42–48.
48.Xu K, Wu ZJ, Groner AC, et al. EZH2 oncogenic activity in castration-resistant prostate cancer cells is
Polycomb-independent.Science. 2012;338(6113):1465–1469.
49.Huang Z, Wu H, Chuai S, et al. NSD2 is recruited through its PHD domain to oncogenic gene loci to
drive multiple myeloma.Cancer Res. 2013;73(20):6277–6288.
50.Kuo AJ, Cheung P, Chen K, et al. NSD2 links dimethylation of histone H3 at lysine 36 to oncogenic
programming.Mol Cell. 2011;44(4):609–620.
51.Chesi M, Nardini E, Lim RS, Smith KD, Kuehl WM, Bergsagel PL. The t(4;14) translocation in
myeloma dysregulates both FGFR3 and a novel gene, MMSET, resulting in IgH/MMSET hybrid
transcripts.Blood. 1998;92(9):3025–3034.
52.Jaffe JD, Wang Y, Chan HM, et al. Global chromatin profiling reveals NSD2 mutations in pediatric
acute lymphoblastic leukemia.Nat Genet. 2013;45(11):1386–1391.
53.Oyer JA, Huang X, Zheng Y, et al. Point mutation E1099K in MMSET/NSD2 enhances its methyl-
transferase activity and leads to altered global chromatin methylation in lymphoid malignancies.
Leukemia. 2014;28(1):198–201.
54.Djabali M, Selleri L, Parry P, Bower M, Young B, Evans GA. A trithorax-like gene is interrupted by
chromosome 11q23 translocations in acute leukaemias.Nat Genet. 1993;4(4):431.
55.Gu Y, Nakamura T, Alder H, et al. The t(4;11) chromosome translocation of human acute leukemias
fuses the ALL-1 gene, related to Drosophila trithorax, to the AF-4 gene.Cell. 1992;71(4):701–708.
56.Tkachuk DC, Kohler S, Cleary ML. Involvement of a homolog of Drosophila trithorax by 11q23
chromosomal translocations in acute leukemias.Cell. 1992;71(4):691–700.
11
Histone modifications in diseases
57.Ziemin-van der Poel S, McCabe NR, Gill HJ, et al. Identification of a gene, MLL, that spans the break-
point in 11q23 translocations associated with human leukemias.Proc Natl Acad Sci USA. 1991;88
(23):10735– 10739.
58.Krivtsov AV, Armstrong SA. MLL translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell
development.Nat Rev Cancer. 2007;7(11):823–833.
59.Bernt KM, Zhu N, Sinha AU, et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 meth-
ylation by DOT1L.Cancer Cell. 2011;20(1):66 –78.
60.Nguyen AT, Zhang Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation.Genes Dev. 2011;25
(13):1345–1358.
61.Metzger E, Wissmann M, Yin N, et al. LSD1 demethylates repressive histone marks to promote
androgen-receptor-dependent transcription.Nature. 2005;437(7057):436–439.
62.Shi Y, Lan F, Matson C, et al. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog
LSD1.Cell. 2004;119(7):941–953.
63.Schulte JH, Lim S, Schramm A, et al. Lysine-specific demethylase 1 is strongly expressed in poorly
differentiated neuroblastoma: implications for therapy.Cancer Res. 2009;69(5):2065–2071.
64.Kahl P, Gullotti L, Heukamp LC, et al. Androgen receptor coactivators lysine-specific histone
demethylase 1 and four and a half LIM domain protein 2 predict risk of prostate cancer recurrence.
Cancer Res. 2006;66(23):11341–11347.
65.Hayami S, Kelly JD, Cho H-S, et al. Overexpression of LSD1 contributes to human carcinogenesis
through chromatin regulation in various cancers.Int J Cancer. 2011;128(3):574–586.
66.Harris WJ, Huang X, Lynch JT, et al. The histone demethylase KDM1A sustains the oncogenic poten-
tial of MLL-AF9 leukemia stem cells.Cancer Cell. 2012;21(4):473 –487.
67.Gibbons RJ. Histone modifying and chromatin remodelling enzymes in cancer and dysplastic syn-
dromes.Hum Mol Genet. 2005;14:R85–R92. Spec No 1.
68.Messier TL, Gordon JAR, Boyd JR, et al. Histone H3 lysine 4 acetylation and methylation dynamics
define breast cancer subtypes.Oncotarget. 2016;7(5):5094–5109.
69.Sun W, Lv S, Li H, Cui W, Wang L. Enhancing the anticancer efficacy of immunotherapy through
combination with histone modification inhibitors.Genes. 2018;9(12):633.
70.Eckner R, Ewen ME, Newsome D, et al. Molecular cloning and functional analysis of the adenovirus
E1A-associated 300-kD protein (p300) reveals a protein with properties of a transcriptional adaptor.
Genes Dev. 1994;8(8):869–884.
71.Su J, Wang F, Cai Y, Jin J. The functional analysis of histone acetyltransferase MOF in tumorigenesis.
Int J Mol Sci. 2016;17(1):99.
72.Gorrini C, Squatrito M, Luise C, et al. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an
oncogene-induced
DNA damage response.Nature. 2007;448(7157):1063–1067.
73.Parbin S, Kar S, Shilpi A, et al. Histone deacetylases: a saga of perturbed acetylation homeostasis in
cancer.J Histochem Cytochem Off J Histochem Soc. 2014;62(1):11–33.
74.Li Y, Seto E. HDACs and HDAC inhibitors in cancer development and therapy.Cold Spring Harb
Perspect Med. 2016;6(10):a026831.
75.Rettig I, Koeneke E, Trippel F, et al. Selective inhibition of HDAC8 decreases neuroblastoma
growth in vitro and in vivo and enhances retinoic acid-mediated differentiation.Cell Death Dis.
2015;6.
76.Jung KH, Noh JH, Kim JK, et al. HDAC2 overexpression confers oncogenic potential to human lung
cancer cells by deregulating expression of apoptosis and cell cycle proteins.J Cell Biochem. 2012;113
(6):2167–2177.
77.Buurman R, G€urlevik E, Sch€affer V, et al. Histone deacetylases activate hepatocyte growth factor sig-
naling by repressing microRNA-449 in hepatocellular carcinoma cells.Gastroenterology. 2012;143
(3):811– 820.e15.
78.Marquard L, Gjerdrum LM, Christensen IJ, Jensen PB, Sehested M, Ralfkiaer E. Prognostic signifi-
cance of the therapeutic targets histone deacetylase 1, 2, 6 and acetylated histone H4 in cutaneous
T-cell lymphoma.Histopathology. 2008;53(3):267–277.
79.Mithraprabhu S, Kalff A, Chow A, Khong T, Spencer A. Dysregulated Class I histone deacetylases are
indicators of poor prognosis in multiple myeloma.Epigenetics. 2014;9(11):1511–1520.
12
Histone modifications in therapy
point in 11q23 translocations associated with human leukemias.Proc Natl Acad Sci USA. 1991;88
(23):10735– 10739.
58.Krivtsov AV, Armstrong SA. MLL translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell
development.Nat Rev Cancer. 2007;7(11):823–833.
59.Bernt KM, Zhu N, Sinha AU, et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 meth-
ylation by DOT1L.Cancer Cell. 2011;20(1):66 –78.
60.Nguyen AT, Zhang Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation.Genes Dev. 2011;25
(13):1345–1358.
61.Metzger E, Wissmann M, Yin N, et al. LSD1 demethylates repressive histone marks to promote
androgen-receptor-dependent transcription.Nature. 2005;437(7057):436–439.
62.Shi Y, Lan F, Matson C, et al. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog
LSD1.Cell. 2004;119(7):941–953.
63.Schulte JH, Lim S, Schramm A, et al. Lysine-specific demethylase 1 is strongly expressed in poorly
differentiated neuroblastoma: implications for therapy.Cancer Res. 2009;69(5):2065–2071.
64.Kahl P, Gullotti L, Heukamp LC, et al. Androgen receptor coactivators lysine-specific histone
demethylase 1 and four and a half LIM domain protein 2 predict risk of prostate cancer recurrence.
Cancer Res. 2006;66(23):11341–11347.
65.Hayami S, Kelly JD, Cho H-S, et al. Overexpression of LSD1 contributes to human carcinogenesis
through chromatin regulation in various cancers.Int J Cancer. 2011;128(3):574–586.
66.Harris WJ, Huang X, Lynch JT, et al. The histone demethylase KDM1A sustains the oncogenic poten-
tial of MLL-AF9 leukemia stem cells.Cancer Cell. 2012;21(4):473 –487.
67.Gibbons RJ. Histone modifying and chromatin remodelling enzymes in cancer and dysplastic syn-
dromes.Hum Mol Genet. 2005;14:R85–R92. Spec No 1.
68.Messier TL, Gordon JAR, Boyd JR, et al. Histone H3 lysine 4 acetylation and methylation dynamics
define breast cancer subtypes.Oncotarget. 2016;7(5):5094–5109.
69.Sun W, Lv S, Li H, Cui W, Wang L. Enhancing the anticancer efficacy of immunotherapy through
combination with histone modification inhibitors.Genes. 2018;9(12):633.
70.Eckner R, Ewen ME, Newsome D, et al. Molecular cloning and functional analysis of the adenovirus
E1A-associated 300-kD protein (p300) reveals a protein with properties of a transcriptional adaptor.
Genes Dev. 1994;8(8):869–884.
71.Su J, Wang F, Cai Y, Jin J. The functional analysis of histone acetyltransferase MOF in tumorigenesis.
Int J Mol Sci. 2016;17(1):99.
72.Gorrini C, Squatrito M, Luise C, et al. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an
oncogene-induced
DNA damage response.Nature. 2007;448(7157):1063–1067.
73.Parbin S, Kar S, Shilpi A, et al. Histone deacetylases: a saga of perturbed acetylation homeostasis in
cancer.J Histochem Cytochem Off J Histochem Soc. 2014;62(1):11–33.
74.Li Y, Seto E. HDACs and HDAC inhibitors in cancer development and therapy.Cold Spring Harb
Perspect Med. 2016;6(10):a026831.
75.Rettig I, Koeneke E, Trippel F, et al. Selective inhibition of HDAC8 decreases neuroblastoma
growth in vitro and in vivo and enhances retinoic acid-mediated differentiation.Cell Death Dis.
2015;6.
76.Jung KH, Noh JH, Kim JK, et al. HDAC2 overexpression confers oncogenic potential to human lung
cancer cells by deregulating expression of apoptosis and cell cycle proteins.J Cell Biochem. 2012;113
(6):2167–2177.
77.Buurman R, G€urlevik E, Sch€affer V, et al. Histone deacetylases activate hepatocyte growth factor sig-
naling by repressing microRNA-449 in hepatocellular carcinoma cells.Gastroenterology. 2012;143
(3):811– 820.e15.
78.Marquard L, Gjerdrum LM, Christensen IJ, Jensen PB, Sehested M, Ralfkiaer E. Prognostic signifi-
cance of the therapeutic targets histone deacetylase 1, 2, 6 and acetylated histone H4 in cutaneous
T-cell lymphoma.Histopathology. 2008;53(3):267–277.
79.Mithraprabhu S, Kalff A, Chow A, Khong T, Spencer A. Dysregulated Class I histone deacetylases are
indicators of poor prognosis in multiple myeloma.Epigenetics. 2014;9(11):1511–1520.
12
Histone modifications in therapy
80.Shin D-G, Bayarsaihan D. A novel epi-drug therapy based on the suppression of BET family epigenetic
readers.Yale J Biol Med. 2017;90(1):63–71.
81. Taniguchi Y. The Bromodomain and Extra-Terminal Domain (BET) Family: Functional Anatomy of
BET Paralogous Proteins. PubMed - NCBI [Internet]. cited. Available from,https://www.ncbi.nlm.
nih.gov/pubmed/27827996; 2019.
82.Liu H, Wang P, Liu L, Min Z, Luo K, Wan Y. Nucleosome alterations caused by mutations at mod-
ifiable histone residues inSaccharomyces cerevisiae.Sci Rep. 2015;5:15583.
83.Gielen GH, Gessi M, Hammes J, Kramm CM, Waha A, Pietsch T. H3F3A K27M mutation in pedi-
atric CNS tumors: a marker for diffuse high-grade astrocytomas.Am J Clin Pathol. 2013;139
(3):345– 349.
84.Behjati S, Tarpey PS, Presneau N, et al. Distinct H3F3A and H3F3B driver mutations define chon-
droblastoma and giant cell tumor of bone.Nat Genet. 2013;45(12):1479–1482.
85.Bender S, Tang Y, Lindroth AM, et al. Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major
drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas.Cancer Cell. 2013;24(5):
660–672.
86.Liu M, Zhou J, Chen Z, Cheng AS-L. Understanding the epigenetic regulation of tumours and their
microenvironments: opportunities and problems for epigenetic therapy.J Pathol. 2017;241(1):10–24.
87.Conte M, De Palma R, Altucci L. HDAC inhibitors as epigenetic regulators for cancer immunother-
apy.Int J Biochem Cell Biol. 2018;98:65–74.
88.Barrero MJ. Epigenetic strategies to boost cancer immunotherapies.Int J Mol Sci. 2017;18(6):1108.
89.Dunn J, Rao S. Epigenetics and immunotherapy: the current state of play.Mol Immunol.
2017;87:227–239.
90.Chiappinelli KB, Zahnow CA, Ahuja N, Baylin SB. Combining epigenetic and immunotherapy to
combat cancer.Cancer Res. 2016;76(7):1683–1689.
91.Mazzone R, Zwergel C, Mai A, Valente S. Epi-drugs in combination with immunotherapy: a new
avenue to improve anticancer efficacy.Clin Epigenetics. 2017;9:59.
92.Connor M, Arbibe L, Hamon M. Customizing host chromatin: a bacterial tale.Microbiol Spectr.
2019;7(2). BAI-0015-2019.
93.Boehm D, Ott M. Host methyltransferases and demethylases: potential new epigenetic targets for HIV
cure strategies and beyond.AIDS Res Hum Retrovir. 2017;33(S1):S8–22.
94.Liu X, Yang C, Sun X, et al. Evidence for a novel mechanism of influenza A virus host adaption mod-
ulated by PB2-627.FEBS J. 2019;286:3389–3400.
95.Marcos-Villar L, Dı´az-Colunga J, Sandoval J, et al. Epigenetic control of influenza virus: role of H3K79
methylation
in interferon-induced antiviral response.Sci Rep. 2018;8(1):1230.
96.Kulej K, Avgousti DC, Sidoli S, et al. Time-resolved global and chromatin proteomics during herpes
simplex virus type 1 (HSV-1) infection.Mol Cell Proteomics. 2017;16(4 suppl 1):S92–107.
97.Afrin F, Khan I, Hemeg HA. Leishmania-host interactions—an epigenetic paradigm.Front Immunol.
2019;10:492.
98.Song M-J, Kim M, Choi Y, et al. Epigenome mapping highlights chromatin-mediated gene regulation
in the protozoan parasiteTrichomonas vaginalis.Sci Rep. 2017;7:45365.
99.Pachano T, Nievas YR, Lizarraga A, Johnson PJ, Strobl-Mazzulla PH, de Miguel N. Epigenetics
regulates transcription and pathogenesis in the parasiteTrichomonas vaginalis.Cell Microbiol. 2017;
19(6).
100.Menachery VD, Sch€afer A, Burnum-Johnson KE, et al. MERS-CoV and H5N1 influenza virus antag-
onize antigen presentation by altering the epigenetic landscape.Proc Natl Acad Sci USA. 2018;115(5):
E1012–E1021.
101.Aung HT, Schroder K, Himes SR, et al. LPS regulates proinflammatory gene expression in macro-
phages by altering histone deacetylase expression.FASEB J. 2006;20(9):1315–1327.
102.Bandyopadhaya A, Tsurumi A, Maura D, Jeffrey KL, Rahme LG. A quorum-sensing signal promotes
host tolerance training through HDAC1-mediated epigenetic reprogramming.Nat Microbiol.
2016;1:16174.
103.Yaseen I, Kaur P, Nandicoori VK, Khosla S. Mycobacteria modulate host epigenetic machinery by
Rv1988 methylation of a non-tail arginine of histone H3.Nat Commun. 2015;6:8922.
13
Histone modifications in diseases
readers.Yale J Biol Med. 2017;90(1):63–71.
81. Taniguchi Y. The Bromodomain and Extra-Terminal Domain (BET) Family: Functional Anatomy of
BET Paralogous Proteins. PubMed - NCBI [Internet]. cited. Available from,https://www.ncbi.nlm.
nih.gov/pubmed/27827996; 2019.
82.Liu H, Wang P, Liu L, Min Z, Luo K, Wan Y. Nucleosome alterations caused by mutations at mod-
ifiable histone residues inSaccharomyces cerevisiae.Sci Rep. 2015;5:15583.
83.Gielen GH, Gessi M, Hammes J, Kramm CM, Waha A, Pietsch T. H3F3A K27M mutation in pedi-
atric CNS tumors: a marker for diffuse high-grade astrocytomas.Am J Clin Pathol. 2013;139
(3):345– 349.
84.Behjati S, Tarpey PS, Presneau N, et al. Distinct H3F3A and H3F3B driver mutations define chon-
droblastoma and giant cell tumor of bone.Nat Genet. 2013;45(12):1479–1482.
85.Bender S, Tang Y, Lindroth AM, et al. Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major
drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas.Cancer Cell. 2013;24(5):
660–672.
86.Liu M, Zhou J, Chen Z, Cheng AS-L. Understanding the epigenetic regulation of tumours and their
microenvironments: opportunities and problems for epigenetic therapy.J Pathol. 2017;241(1):10–24.
87.Conte M, De Palma R, Altucci L. HDAC inhibitors as epigenetic regulators for cancer immunother-
apy.Int J Biochem Cell Biol. 2018;98:65–74.
88.Barrero MJ. Epigenetic strategies to boost cancer immunotherapies.Int J Mol Sci. 2017;18(6):1108.
89.Dunn J, Rao S. Epigenetics and immunotherapy: the current state of play.Mol Immunol.
2017;87:227–239.
90.Chiappinelli KB, Zahnow CA, Ahuja N, Baylin SB. Combining epigenetic and immunotherapy to
combat cancer.Cancer Res. 2016;76(7):1683–1689.
91.Mazzone R, Zwergel C, Mai A, Valente S. Epi-drugs in combination with immunotherapy: a new
avenue to improve anticancer efficacy.Clin Epigenetics. 2017;9:59.
92.Connor M, Arbibe L, Hamon M. Customizing host chromatin: a bacterial tale.Microbiol Spectr.
2019;7(2). BAI-0015-2019.
93.Boehm D, Ott M. Host methyltransferases and demethylases: potential new epigenetic targets for HIV
cure strategies and beyond.AIDS Res Hum Retrovir. 2017;33(S1):S8–22.
94.Liu X, Yang C, Sun X, et al. Evidence for a novel mechanism of influenza A virus host adaption mod-
ulated by PB2-627.FEBS J. 2019;286:3389–3400.
95.Marcos-Villar L, Dı´az-Colunga J, Sandoval J, et al. Epigenetic control of influenza virus: role of H3K79
methylation
in interferon-induced antiviral response.Sci Rep. 2018;8(1):1230.
96.Kulej K, Avgousti DC, Sidoli S, et al. Time-resolved global and chromatin proteomics during herpes
simplex virus type 1 (HSV-1) infection.Mol Cell Proteomics. 2017;16(4 suppl 1):S92–107.
97.Afrin F, Khan I, Hemeg HA. Leishmania-host interactions—an epigenetic paradigm.Front Immunol.
2019;10:492.
98.Song M-J, Kim M, Choi Y, et al. Epigenome mapping highlights chromatin-mediated gene regulation
in the protozoan parasiteTrichomonas vaginalis.Sci Rep. 2017;7:45365.
99.Pachano T, Nievas YR, Lizarraga A, Johnson PJ, Strobl-Mazzulla PH, de Miguel N. Epigenetics
regulates transcription and pathogenesis in the parasiteTrichomonas vaginalis.Cell Microbiol. 2017;
19(6).
100.Menachery VD, Sch€afer A, Burnum-Johnson KE, et al. MERS-CoV and H5N1 influenza virus antag-
onize antigen presentation by altering the epigenetic landscape.Proc Natl Acad Sci USA. 2018;115(5):
E1012–E1021.
101.Aung HT, Schroder K, Himes SR, et al. LPS regulates proinflammatory gene expression in macro-
phages by altering histone deacetylase expression.FASEB J. 2006;20(9):1315–1327.
102.Bandyopadhaya A, Tsurumi A, Maura D, Jeffrey KL, Rahme LG. A quorum-sensing signal promotes
host tolerance training through HDAC1-mediated epigenetic reprogramming.Nat Microbiol.
2016;1:16174.
103.Yaseen I, Kaur P, Nandicoori VK, Khosla S. Mycobacteria modulate host epigenetic machinery by
Rv1988 methylation of a non-tail arginine of histone H3.Nat Commun. 2015;6:8922.
13
Histone modifications in diseases
104.Bierne H, Hamon M, Cossart P. Epigenetics and bacterial infections.Cold Spring Harb Perspect Med.
2012;2(12):a010272.
105.Hamon MA, Cossart P. Histone modifications and chromatin remodeling during bacterial infections.
Cell Host Microbe. 2008;4(2):100–109.
106.Paschos K, Allday MJ. Epigenetic reprogramming of host genes in viral and microbial pathogenesis.
Trends Microbiol. 2010;18(10):439–447.
107.Meda F, Folci M, Baccarelli A, Selmi C. The epigenetics of autoimmunity.Cell Mol Immunol. 2011;8
(3):226– 236.
108.Nielsen HM, Tost J. Epigenetic changes in inflammatory and autoimmune diseases.Subcell Biochem.
2013;61:455–478.
109.Zhao M, Wang Z, Yung S, Lu Q. Epigenetic dynamics in immunity and autoimmunity.Int J Biochem
Cell Biol. 2015;67:65–74.
110.Nemtsova MV, Zaletaev DV, Bure IV, et al. Epigenetic changes in the pathogenesis of rheumatoid
arthritis.Front Genet. 2019;10:570.
111.Landgrave-Go´mez J, Mercado-Go´mez O, Guevara-Guzma´n R. Epigenetic mechanisms in neurolog-
ical and neurodegenerative diseases.Front Cell Neurosci. 2015;9:58.
112.Wen K-X, Milic ¸J, El-Khodor B, et al. The role of DNA methylation and histone modifications in
neurodegenerative diseases: a systematic review.PLoS One. 2016;11(12).
113.Teijido O, Cacabelos R. Pharmacoepigenomic interventions as novel potential treatments for Alzhei-
mer’s and Parkinson’s diseases.Int J Mol Sci. 2018;19(10):3199.
114.Zampetaki A, Zeng L, Margariti A, et al. Histone deacetylase 3 is critical in endothelial survival and
atherosclerosis development in response to disturbed flow.Circulation. 2010;121(1):132–142.
115.Cao DJ, Wang ZV, Battiprolu PK, et al. Histone deacetylase (HDAC) inhibitors attenuate cardiac
hypertrophy by suppressing autophagy.Proc Natl Acad Sci USA. 2011;108(10):4123–4128.
116.Jahagirdar R, Zhang H, Azhar S, et al. A novel BET bromodomain inhibitor, RVX-208, shows reduc-
tion of atherosclerosis in hyperlipidemic ApoE deficient mice.Atherosclerosis. 2014;236(1):91–100.
117.Lv Y-C, Tang Y-Y, Zhang P, et al. Histone methyltransferase enhancer of zeste homolog 2-mediated
ABCA1 promoter DNA methylation contributes to the progression of atherosclerosis.PLoS One.
2016;11(6).
118.Mokou M, Klein J, Makridakis M, et al. Proteomics based identification of KDM5 histone demethy-
lases associated with cardiovascular disease.EBioMedicine. 2019;41:91–104.
119.Jiang W, Agrawal DK, Boosani CS. Cell-specific histone modifications in atherosclerosis (review).Mol
Med
Rep. 2018;18(2):1215–1224.
120.Wierda RJ, Rietveld IM, van Eggermond MCJA, et al. Global histone H3 lysine 27 triple methylation
levels are reduced in vessels with advanced atherosclerotic plaques.Life Sci. 2015;129:3–9.
121.Habibian J, Ferguson BS. The crosstalk between acetylation and phosphorylation: emerging new roles
for HDAC inhibitors in the heart.Int J Mol Sci. 2018;20(1):102.
122.Demos-Davies KM, Ferguson BS, Cavasin MA, et al. HDAC6 contributes to pathological responses of
heart and skeletal muscle to chronic angiotensin-II signaling.Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2014;307
(2):H252–H258.
123.McKinsey TA. Therapeutic potential for HDAC inhibitors in the heart.Annu Rev Pharmacol Toxicol.
2012;52:303–319.
124.Kong Y, Tannous P, Lu G, et al. Suppression of class I and II histone deacetylases blunts pressure-
overload cardiac hypertrophy.Circulation. 2006;113(22):2579–2588.
125.Wise IA, Charchar FJ. Epigenetic modifications in essential hypertension.Int J Mol Sci. 2016;17(4):451.
126.Arif M, Sadayappan S, Becker RC, Martin LJ, Urbina EM. Epigenetic modification: a regulatory
mechanism in essential hypertension.Hypertens Res. 2019;42:1099–1113.
127.Wang J, Gong L, Tan Y, Hui R, Wang Y. Hypertensive epigenetics: from DNA methylation to
microRNAs.J Hum Hypertens. 2015;29(10):575–582.
128.Cardinale JP, Sriramula S, Pariaut R, et al. HDAC inhibition attenuates inflammatory, hypertrophic,
and hypertensive responses in spontaneously hypertensive rats.Hypertension. 2010;56(3):437–444.
129.Yang Y-M, Shi R-H, Xu C-X, Li L. BRD4 expression in patients with essential hypertension and its
effect on blood pressure in spontaneously hypertensive rats.J Am Soc Hypertens. 2018;12(12):
e107–e117.
14
Histone modifications in therapy
2012;2(12):a010272.
105.Hamon MA, Cossart P. Histone modifications and chromatin remodeling during bacterial infections.
Cell Host Microbe. 2008;4(2):100–109.
106.Paschos K, Allday MJ. Epigenetic reprogramming of host genes in viral and microbial pathogenesis.
Trends Microbiol. 2010;18(10):439–447.
107.Meda F, Folci M, Baccarelli A, Selmi C. The epigenetics of autoimmunity.Cell Mol Immunol. 2011;8
(3):226– 236.
108.Nielsen HM, Tost J. Epigenetic changes in inflammatory and autoimmune diseases.Subcell Biochem.
2013;61:455–478.
109.Zhao M, Wang Z, Yung S, Lu Q. Epigenetic dynamics in immunity and autoimmunity.Int J Biochem
Cell Biol. 2015;67:65–74.
110.Nemtsova MV, Zaletaev DV, Bure IV, et al. Epigenetic changes in the pathogenesis of rheumatoid
arthritis.Front Genet. 2019;10:570.
111.Landgrave-Go´mez J, Mercado-Go´mez O, Guevara-Guzma´n R. Epigenetic mechanisms in neurolog-
ical and neurodegenerative diseases.Front Cell Neurosci. 2015;9:58.
112.Wen K-X, Milic ¸J, El-Khodor B, et al. The role of DNA methylation and histone modifications in
neurodegenerative diseases: a systematic review.PLoS One. 2016;11(12).
113.Teijido O, Cacabelos R. Pharmacoepigenomic interventions as novel potential treatments for Alzhei-
mer’s and Parkinson’s diseases.Int J Mol Sci. 2018;19(10):3199.
114.Zampetaki A, Zeng L, Margariti A, et al. Histone deacetylase 3 is critical in endothelial survival and
atherosclerosis development in response to disturbed flow.Circulation. 2010;121(1):132–142.
115.Cao DJ, Wang ZV, Battiprolu PK, et al. Histone deacetylase (HDAC) inhibitors attenuate cardiac
hypertrophy by suppressing autophagy.Proc Natl Acad Sci USA. 2011;108(10):4123–4128.
116.Jahagirdar R, Zhang H, Azhar S, et al. A novel BET bromodomain inhibitor, RVX-208, shows reduc-
tion of atherosclerosis in hyperlipidemic ApoE deficient mice.Atherosclerosis. 2014;236(1):91–100.
117.Lv Y-C, Tang Y-Y, Zhang P, et al. Histone methyltransferase enhancer of zeste homolog 2-mediated
ABCA1 promoter DNA methylation contributes to the progression of atherosclerosis.PLoS One.
2016;11(6).
118.Mokou M, Klein J, Makridakis M, et al. Proteomics based identification of KDM5 histone demethy-
lases associated with cardiovascular disease.EBioMedicine. 2019;41:91–104.
119.Jiang W, Agrawal DK, Boosani CS. Cell-specific histone modifications in atherosclerosis (review).Mol
Med
Rep. 2018;18(2):1215–1224.
120.Wierda RJ, Rietveld IM, van Eggermond MCJA, et al. Global histone H3 lysine 27 triple methylation
levels are reduced in vessels with advanced atherosclerotic plaques.Life Sci. 2015;129:3–9.
121.Habibian J, Ferguson BS. The crosstalk between acetylation and phosphorylation: emerging new roles
for HDAC inhibitors in the heart.Int J Mol Sci. 2018;20(1):102.
122.Demos-Davies KM, Ferguson BS, Cavasin MA, et al. HDAC6 contributes to pathological responses of
heart and skeletal muscle to chronic angiotensin-II signaling.Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2014;307
(2):H252–H258.
123.McKinsey TA. Therapeutic potential for HDAC inhibitors in the heart.Annu Rev Pharmacol Toxicol.
2012;52:303–319.
124.Kong Y, Tannous P, Lu G, et al. Suppression of class I and II histone deacetylases blunts pressure-
overload cardiac hypertrophy.Circulation. 2006;113(22):2579–2588.
125.Wise IA, Charchar FJ. Epigenetic modifications in essential hypertension.Int J Mol Sci. 2016;17(4):451.
126.Arif M, Sadayappan S, Becker RC, Martin LJ, Urbina EM. Epigenetic modification: a regulatory
mechanism in essential hypertension.Hypertens Res. 2019;42:1099–1113.
127.Wang J, Gong L, Tan Y, Hui R, Wang Y. Hypertensive epigenetics: from DNA methylation to
microRNAs.J Hum Hypertens. 2015;29(10):575–582.
128.Cardinale JP, Sriramula S, Pariaut R, et al. HDAC inhibition attenuates inflammatory, hypertrophic,
and hypertensive responses in spontaneously hypertensive rats.Hypertension. 2010;56(3):437–444.
129.Yang Y-M, Shi R-H, Xu C-X, Li L. BRD4 expression in patients with essential hypertension and its
effect on blood pressure in spontaneously hypertensive rats.J Am Soc Hypertens. 2018;12(12):
e107–e117.
14
Histone modifications in therapy
130.Jeong MY, Lin YH, Wennersten SA, et al. Histone deacetylase activity governs diastolic dysfunction
through a nongenomic mechanism.Sci Transl Med. 2018;10(427): eaao0144.
131.Ling C, R€onn T. Epigenetics in human obesity and type 2 diabetes.Cell Metab. 2019;29(5):1028–1044.
132.Cho NH, Shaw JE, Karuranga S, et al. IDF diabetes atlas: global estimates of diabetes prevalence for
2017 and projections for 2045.Diabetes Res Clin Pract. 2018;138:271–281.
133.Lenoir O, Flosseau K, Ma FX, et al. Specific control of pancreatic endocrineβ- andδ-cell mass by class
IIa histone deacetylases HDAC4, HDAC5, and HDAC9.Diabetes. 2011;60(11):2861–2871.
134.Lundh M, Galbo T, Poulsen SS, Mandrup-Poulsen T. Histone deacetylase 3 inhibition improves
glycaemia and insulin secretion in obese diabetic rats.Diabetes Obes Metab. 2015;17(7):703–707.
135.Mihaylova MM, Vasquez DS, Ravnskjaer K, et al. Class IIa histone deacetylases are hormone-activated
regulators of FOXO and mammalian glucose homeostasis.Cell. 2011;145(4):607–621.
136.Daneshpajooh M, Bacos K, Bysani M, et al. HDAC7 is overexpressed in human diabetic islets and
impairs insulin secretion in rat islets and clonal beta cells.Diabetologia. 2017;60(1):116–125.
137.Sathishkumar C, Prabu P, Balakumar M, et al. Augmentation of histone deacetylase 3 (HDAC3)
epigenetic signature at the interface of proinflammation and insulin resistance in patients with type
2 diabetes.Clin Epigenetics. 2016;8:125.
138.Miao F, Gonzalo IG, Lanting L, Natarajan R. In vivo chromatin remodeling events leading to inflam-
matory gene transcription under diabetic conditions.J Biol Chem. 2004;279(17):18091 –18097.
139.Daneshpajooh M, Eliasson L, Bacos K, Ling C. MC1568 improves insulin secretion in islets from
type 2 diabetes patients and rescuesβ-cell dysfunction caused by Hdac7 upregulation.Acta Diabetol.2018;
55(12):1231–1235.
140.Sharma S, Taliyan R. Histone deacetylase inhibitors: future therapeutics for insulin resistance and type
2 diabetes.Pharmacol Res. 2016;113(pt A):320– 326.
141.Ye J. Improving insulin sensitivity with HDAC inhibitor.Diabetes. 2013;62(3):685–687.
142.Larsen L, Tonnesen M, Ronn SG, et al. Inhibition of histone deacetylases prevents cytokine-induced
toxicity in beta cells.Diabetologia. 2007;50(4):779–789.
143.Fu W, Farache J, Clardy SM, et al. Epigenetic modulation of type-1 diabetes via a dual effect on pan-
creatic macrophages andβcells.elife. 2014;3.
144.Deeney
JT, Belkina AC, Shirihai OS, Corkey BE, Denis GV. BET bromodomain proteins Brd2, Brd3
and Brd4 selectively regulate metabolic pathways in the pancreaticβ-Cell.PLoS One. 2016;11(3).
145.Whitt J, Woo V, Lee P, et al. Disruption of epithelial HDAC3 in intestine prevents diet-induced
obesity in mice.Gastroenterology. 2018;155(2):501–513.
146.Nettore IC, Rocca C, Mancino G, et al. Quercetin and its derivative Q2 modulate chromatin dynam-
ics in adipogenesis and Q2 prevents obesity and metabolic disorders in rats.J Nutr Biochem.
2019;69:151–162.
15
Histone modifications in diseases
through a nongenomic mechanism.Sci Transl Med. 2018;10(427): eaao0144.
131.Ling C, R€onn T. Epigenetics in human obesity and type 2 diabetes.Cell Metab. 2019;29(5):1028–1044.
132.Cho NH, Shaw JE, Karuranga S, et al. IDF diabetes atlas: global estimates of diabetes prevalence for
2017 and projections for 2045.Diabetes Res Clin Pract. 2018;138:271–281.
133.Lenoir O, Flosseau K, Ma FX, et al. Specific control of pancreatic endocrineβ- andδ-cell mass by class
IIa histone deacetylases HDAC4, HDAC5, and HDAC9.Diabetes. 2011;60(11):2861–2871.
134.Lundh M, Galbo T, Poulsen SS, Mandrup-Poulsen T. Histone deacetylase 3 inhibition improves
glycaemia and insulin secretion in obese diabetic rats.Diabetes Obes Metab. 2015;17(7):703–707.
135.Mihaylova MM, Vasquez DS, Ravnskjaer K, et al. Class IIa histone deacetylases are hormone-activated
regulators of FOXO and mammalian glucose homeostasis.Cell. 2011;145(4):607–621.
136.Daneshpajooh M, Bacos K, Bysani M, et al. HDAC7 is overexpressed in human diabetic islets and
impairs insulin secretion in rat islets and clonal beta cells.Diabetologia. 2017;60(1):116–125.
137.Sathishkumar C, Prabu P, Balakumar M, et al. Augmentation of histone deacetylase 3 (HDAC3)
epigenetic signature at the interface of proinflammation and insulin resistance in patients with type
2 diabetes.Clin Epigenetics. 2016;8:125.
138.Miao F, Gonzalo IG, Lanting L, Natarajan R. In vivo chromatin remodeling events leading to inflam-
matory gene transcription under diabetic conditions.J Biol Chem. 2004;279(17):18091 –18097.
139.Daneshpajooh M, Eliasson L, Bacos K, Ling C. MC1568 improves insulin secretion in islets from
type 2 diabetes patients and rescuesβ-cell dysfunction caused by Hdac7 upregulation.Acta Diabetol.2018;
55(12):1231–1235.
140.Sharma S, Taliyan R. Histone deacetylase inhibitors: future therapeutics for insulin resistance and type
2 diabetes.Pharmacol Res. 2016;113(pt A):320– 326.
141.Ye J. Improving insulin sensitivity with HDAC inhibitor.Diabetes. 2013;62(3):685–687.
142.Larsen L, Tonnesen M, Ronn SG, et al. Inhibition of histone deacetylases prevents cytokine-induced
toxicity in beta cells.Diabetologia. 2007;50(4):779–789.
143.Fu W, Farache J, Clardy SM, et al. Epigenetic modulation of type-1 diabetes via a dual effect on pan-
creatic macrophages andβcells.elife. 2014;3.
144.Deeney
JT, Belkina AC, Shirihai OS, Corkey BE, Denis GV. BET bromodomain proteins Brd2, Brd3
and Brd4 selectively regulate metabolic pathways in the pancreaticβ-Cell.PLoS One. 2016;11(3).
145.Whitt J, Woo V, Lee P, et al. Disruption of epithelial HDAC3 in intestine prevents diet-induced
obesity in mice.Gastroenterology. 2018;155(2):501–513.
146.Nettore IC, Rocca C, Mancino G, et al. Quercetin and its derivative Q2 modulate chromatin dynam-
ics in adipogenesis and Q2 prevents obesity and metabolic disorders in rats.J Nutr Biochem.
2019;69:151–162.
15
Histone modifications in diseases
This page intentionally left blank
SECTION I
Targetinghistone
modificationsforcancer
treatment
Targetinghistone
modificationsforcancer
treatment
This page intentionally left blank
CHAPTER 2
HDAC inhibitors in cancer therapy
A. Ganesan
School of Pharmacy, University of East Anglia, Norwich, United Kingdom
2.1 HDACs: The most successful epigenetic drug discovery target
Epigenetic drug discovery is truly a 21st century success story.
1, 2
In fact, the first “epi-
drugs,” azacitidine and decitabine, advanced to clinical development as early as the 1960s
on the basis of their powerful cytotoxic effects. However, these compounds were
believed to be purine antimetabolites that interfered with nucleic acid biosynthesis. It
was only in the 1980s that their epigenetic connection as DNA methyltransferase
(DNMT) inhibitors was uncovered, eventually leading to FDA approval for the drugs
in 2004 and 2006, respectively. Meanwhile, other key players involved in epigenetic reg-
ulation were rapidly being identified. These new insights transformed epigenetic drug
discovery programs. A toolkit of in vitro assays became available to determine target affin-
ity and selectivity together with corresponding biomarkers to evaluate in vitro and in
vivo target engagement. The appearance of X-ray structures of native proteins and
cocrystals bound to small molecules facilitated a structure-based approach to lead discov-
ery and optimization.
The revolution in epigenetic drug discovery now encompasses all three major target
families: the so-called “writer” enzymes that covalently modify proteins or nucleic acids;
the “reader” domains that recognize these structural modifications; and the “eraser”
enzymes that reverse the process by removing epigenetic marks. Nevertheless, one epi-
genetic target is exceptional in its translation from bench to bedside, namely the zinc-
dependent histone deacetylases (HDACs). Over 30 small molecule HDAC inhibitors
have progressed to clinical trials, of which five are on the market (Table 2.1).
3
There
are several reasons why HDAC inhibitor discovery has been so successful. First, the
HDACs are a mature epigenetic target, being chronologically second only to DNMTs
in receiving intense scrutiny for drug discovery. Second, the pharmacophore require-
ments for potent HDAC inhibition are less complex than for other epigenetic targets.
This provided organizations with freedom to operate and build up independent lead
series that could be optimized to diverse compounds with nanomolar potency in bio-
chemical enzyme assays. Third, the potency in enzyme inhibition was readily translated
to antiproliferative effects across a broad spectrum of cancer cell lines. Unlike other epi-
genetic targets, these effects could be observed after short exposure times, as acetylation
19
Histone Modifications in Therapy ©2020 Elsevier Inc.
https://doi.org/10.1016/B978-0-12-816422-8.00002-7 All rights reserved.
HDAC inhibitors in cancer therapy
A. Ganesan
School of Pharmacy, University of East Anglia, Norwich, United Kingdom
2.1 HDACs: The most successful epigenetic drug discovery target
Epigenetic drug discovery is truly a 21st century success story.
1, 2
In fact, the first “epi-
drugs,” azacitidine and decitabine, advanced to clinical development as early as the 1960s
on the basis of their powerful cytotoxic effects. However, these compounds were
believed to be purine antimetabolites that interfered with nucleic acid biosynthesis. It
was only in the 1980s that their epigenetic connection as DNA methyltransferase
(DNMT) inhibitors was uncovered, eventually leading to FDA approval for the drugs
in 2004 and 2006, respectively. Meanwhile, other key players involved in epigenetic reg-
ulation were rapidly being identified. These new insights transformed epigenetic drug
discovery programs. A toolkit of in vitro assays became available to determine target affin-
ity and selectivity together with corresponding biomarkers to evaluate in vitro and in
vivo target engagement. The appearance of X-ray structures of native proteins and
cocrystals bound to small molecules facilitated a structure-based approach to lead discov-
ery and optimization.
The revolution in epigenetic drug discovery now encompasses all three major target
families: the so-called “writer” enzymes that covalently modify proteins or nucleic acids;
the “reader” domains that recognize these structural modifications; and the “eraser”
enzymes that reverse the process by removing epigenetic marks. Nevertheless, one epi-
genetic target is exceptional in its translation from bench to bedside, namely the zinc-
dependent histone deacetylases (HDACs). Over 30 small molecule HDAC inhibitors
have progressed to clinical trials, of which five are on the market (Table 2.1).
3
There
are several reasons why HDAC inhibitor discovery has been so successful. First, the
HDACs are a mature epigenetic target, being chronologically second only to DNMTs
in receiving intense scrutiny for drug discovery. Second, the pharmacophore require-
ments for potent HDAC inhibition are less complex than for other epigenetic targets.
This provided organizations with freedom to operate and build up independent lead
series that could be optimized to diverse compounds with nanomolar potency in bio-
chemical enzyme assays. Third, the potency in enzyme inhibition was readily translated
to antiproliferative effects across a broad spectrum of cancer cell lines. Unlike other epi-
genetic targets, these effects could be observed after short exposure times, as acetylation
19
Histone Modifications in Therapy ©2020 Elsevier Inc.
https://doi.org/10.1016/B978-0-12-816422-8.00002-7 All rights reserved.
and deacetylation occur on a much faster time scale than methylation and demethylation.
Finally, HDAC enzymes are highly expressed in many human cancer types, providing a
biological rationale for the hypothesis that HDAC inhibition would be beneficial in che-
motherapy. Cancer cells have artificially evolved into a rapidly dividing state, and it was
believed that an epigenetic intervention would act as a brake on proliferation to promote
alternative cell fates leading ultimately to cell death. The positive results obtained with
HDAC inhibitors in mouse tumor xenograft models for a variety of human cancer types
lent further support to the validation of HDACs as a pharmaceutical target and its explo-
ration by academia and industry. The resulting clinical candidates were the result of an
effort spanning universities, biotech companies, and multinational pharmaceuticals and
global in origin, coming from the United States, Canada, United Kingdom, Germany,
Belgium, Italy, Japan, China, South Korea, and Singapore.
The HDACs are metalloenzymes that appear to have evolved from arginase, an
enzyme that hydrolyses arginine to ornithine. In arginase, an active site manganese cation
is present whereas this is replaced by zinc in HDACs. The zinc cation sits at the end of a
narrow hydrophobic channel, approximately11A
˚
long and 5A
˚
in diameter.
4
The acet-
yllysine sidechain of the protein substrate sits in this channel, stabilized by hydrogen
bonding between the carbonyl oxygen and an active site residue. A charge relay system,
akin to serine proteases, deprotonates a water molecule which then attacks the amide
bond. The resulting tetrahedral oxyanion (Fig. 2.1) is stabilized by coordination to
the zinc cation before collapsing into the lysine and acetate products. A side-by-side com-
parison between the oxyanion intermediate and trichostatin A (1), a bacterial natural
product and the first compound to be identified as a potent HDAC inhibitor in 1990,
illustrates their common structural features. The key “warhead” in the inhibitor is a
“zinc-binding group” that coordinates to the metal in a similar fashion to the oxyanion.
Next is a hydrophobic “linker” that occupies the acetyllysine substrate-binding channel,
and a “cap,” which protrudes beyond the enzyme rim into the solvent exposed exterior.
Table 2.1The five HDAC inhibitors approved for cancer therapy.
Drug, year of
approval Discovery Development
Acquirer/
Licensee Indication
Vorinostat
2006
Columbia
University, USA
Aton Merck T-cell lymphoma
Romidepsin
2009
Fujisawa, Japan Gloucester Bristol Myers
Squibb
T-cell lymphoma
Belinostat
2014
Prolifix, UK TopoTarget Onxeo,
Spectrum
T-cell lymphoma
Panobinostat
2015
Novartis, USA Novartis – Multiple myeloma
Tucidinostat
2015
Chipscreen,
China
Huya Eisai T-cell lymphoma
20 Histone modifications in therapy
Finally, HDAC enzymes are highly expressed in many human cancer types, providing a
biological rationale for the hypothesis that HDAC inhibition would be beneficial in che-
motherapy. Cancer cells have artificially evolved into a rapidly dividing state, and it was
believed that an epigenetic intervention would act as a brake on proliferation to promote
alternative cell fates leading ultimately to cell death. The positive results obtained with
HDAC inhibitors in mouse tumor xenograft models for a variety of human cancer types
lent further support to the validation of HDACs as a pharmaceutical target and its explo-
ration by academia and industry. The resulting clinical candidates were the result of an
effort spanning universities, biotech companies, and multinational pharmaceuticals and
global in origin, coming from the United States, Canada, United Kingdom, Germany,
Belgium, Italy, Japan, China, South Korea, and Singapore.
The HDACs are metalloenzymes that appear to have evolved from arginase, an
enzyme that hydrolyses arginine to ornithine. In arginase, an active site manganese cation
is present whereas this is replaced by zinc in HDACs. The zinc cation sits at the end of a
narrow hydrophobic channel, approximately11A
˚
long and 5A
˚
in diameter.
4
The acet-
yllysine sidechain of the protein substrate sits in this channel, stabilized by hydrogen
bonding between the carbonyl oxygen and an active site residue. A charge relay system,
akin to serine proteases, deprotonates a water molecule which then attacks the amide
bond. The resulting tetrahedral oxyanion (Fig. 2.1) is stabilized by coordination to
the zinc cation before collapsing into the lysine and acetate products. A side-by-side com-
parison between the oxyanion intermediate and trichostatin A (1), a bacterial natural
product and the first compound to be identified as a potent HDAC inhibitor in 1990,
illustrates their common structural features. The key “warhead” in the inhibitor is a
“zinc-binding group” that coordinates to the metal in a similar fashion to the oxyanion.
Next is a hydrophobic “linker” that occupies the acetyllysine substrate-binding channel,
and a “cap,” which protrudes beyond the enzyme rim into the solvent exposed exterior.
Table 2.1The five HDAC inhibitors approved for cancer therapy.
Drug, year of
approval Discovery Development
Acquirer/
Licensee Indication
Vorinostat
2006
Columbia
University, USA
Aton Merck T-cell lymphoma
Romidepsin
2009
Fujisawa, Japan Gloucester Bristol Myers
Squibb
T-cell lymphoma
Belinostat
2014
Prolifix, UK TopoTarget Onxeo,
Spectrum
T-cell lymphoma
Panobinostat
2015
Novartis, USA Novartis – Multiple myeloma
Tucidinostat
2015
Chipscreen,
China
Huya Eisai T-cell lymphoma
20 Histone modifications in therapy
Although the pharmacophore for HDAC inhibition is relatively simple, a further
complication is the existence of 11 human isoforms of the enzyme.
5
The 11 HDACs
perform nonredundant functions and mouse knockouts of individual isoforms result
in lethal or defective phenotypes except for HDAC6. The isoforms are classified accord-
ing to their structural homology, with the class I isoforms comprising HDAC1, HDAC2,
HDAC3, and HDAC8. The HDAC1, HDAC2, and HDAC3 isoforms are localized in
the nucleus, associate with multiprotein transcriptional repressor complexes such as
NuRD, Sin3A, CoREST, MiDAC, and SMRT/N-CoR, and robustly deacetylate acet-
yllysine substrates in cell-free biochemical assays.
6
HDAC8, on the other hand, is smaller
in size and weaker in catalytic activity. It is predominantly nuclear, and functions inde-
pendently of multiprotein complexes. Together, the class I isoforms can be considered
truly epigenetic as histone proteins are a major substrate for these enzymes. Since acet-
yllysine is a neutral sidechain whereas lysine is protonated (Fig. 2.1), the consequence of
increased histone acetylation is to decrease electrostatic interactions with DNA, opening
up chromatin to permit access to the transcriptional machinery and gene expression.
7
Furthermore, acetyllysine residues are recognized by bromodomain-containing proteins
that are present in transcriptional activators.
8
However, there is a fine balance between
histone acetylation and deacetylation. If it is unregulated, acetylation destabilizes chro-
matin and causes errors in gene transcription, and this is one of the mechanisms by which
HDAC inhibitors exert their effect in cancer cells.
9
The class IIa isoforms HDAC4, HDAC5, HDAC7, and HDAC9 are larger proteins
that contain motifs to promote interactions with binding partners. They are tissue specific
in their distribution and move between the nucleus and the cytoplasm depending on their
phosphorylation state. The biological roles of the class IIa HDACs are poorly understood,
and their catalytic activity is very low compared to the class I isoforms due to the sub-
stitution of a conserved tyrosine residue in the active site. The class IIb isoform HDAC6 is
HN
Tetrahedral oxyanion
O
O
H
Zn
2+
Linker
Cap
Zinc
binding
group
HN
Acetyl lysine
substrate
O
HDAC
H
3
N
Lysine
product
HN
O
OH
O
N
Trichostatin A (1)
Fig. 2.1The hydrolysis of acetyllysine to lysine catalyzed by HDAC enzymes via a tetrahedral oxyanion
intermediate. The HDAC inhibitor trichostatin A is shown in comparison.
21
HDAC inhibitors in cancer therapy
complication is the existence of 11 human isoforms of the enzyme.
5
The 11 HDACs
perform nonredundant functions and mouse knockouts of individual isoforms result
in lethal or defective phenotypes except for HDAC6. The isoforms are classified accord-
ing to their structural homology, with the class I isoforms comprising HDAC1, HDAC2,
HDAC3, and HDAC8. The HDAC1, HDAC2, and HDAC3 isoforms are localized in
the nucleus, associate with multiprotein transcriptional repressor complexes such as
NuRD, Sin3A, CoREST, MiDAC, and SMRT/N-CoR, and robustly deacetylate acet-
yllysine substrates in cell-free biochemical assays.
6
HDAC8, on the other hand, is smaller
in size and weaker in catalytic activity. It is predominantly nuclear, and functions inde-
pendently of multiprotein complexes. Together, the class I isoforms can be considered
truly epigenetic as histone proteins are a major substrate for these enzymes. Since acet-
yllysine is a neutral sidechain whereas lysine is protonated (Fig. 2.1), the consequence of
increased histone acetylation is to decrease electrostatic interactions with DNA, opening
up chromatin to permit access to the transcriptional machinery and gene expression.
7
Furthermore, acetyllysine residues are recognized by bromodomain-containing proteins
that are present in transcriptional activators.
8
However, there is a fine balance between
histone acetylation and deacetylation. If it is unregulated, acetylation destabilizes chro-
matin and causes errors in gene transcription, and this is one of the mechanisms by which
HDAC inhibitors exert their effect in cancer cells.
9
The class IIa isoforms HDAC4, HDAC5, HDAC7, and HDAC9 are larger proteins
that contain motifs to promote interactions with binding partners. They are tissue specific
in their distribution and move between the nucleus and the cytoplasm depending on their
phosphorylation state. The biological roles of the class IIa HDACs are poorly understood,
and their catalytic activity is very low compared to the class I isoforms due to the sub-
stitution of a conserved tyrosine residue in the active site. The class IIb isoform HDAC6 is
HN
Tetrahedral oxyanion
O
O
H
Zn
2+
Linker
Cap
Zinc
binding
group
HN
Acetyl lysine
substrate
O
HDAC
H
3
N
Lysine
product
HN
O
OH
O
N
Trichostatin A (1)
Fig. 2.1The hydrolysis of acetyllysine to lysine catalyzed by HDAC enzymes via a tetrahedral oxyanion
intermediate. The HDAC inhibitor trichostatin A is shown in comparison.
21
HDAC inhibitors in cancer therapy
unique in having two catalytic domains, CD1 and CD2. While CD2 deacetylates a
diverse array of cytoplasmic proteins, CD1 is less catalytically active with a preference
for C-terminal acetyllysine substrates.
10
The remaining two HDAC isoforms, the class
IIb HDAC10 and the class IV isoform HDAC11, both have unusual features. HDAC10
is cytoplasmic in location with an extended C-terminal domain, and more efficient in the
deacetylation of polyamines such as spermidine rather than protein substrates.
11
HDAC11 has features that resemble both the class I and class II enzymes. It is nuclear
in localization, and its preferred substrates are longer chain fatty acyl-lysine residues of
8–18 carbons rather than acetyllysine.
12
Lysine acetylation was first observed in the abundant histone proteins and the
enzymes responsible for acetyl group removal were logically named as histone deacety-
lases. However, the HDAC nomenclature is misleading and obscures the heterogeneity
within the family. Only four isoforms, the nuclear HDAC1, HDAC2, HDAC3, and the
cytoplasmic HDAC6 are catalytically efficient as lysine deacetylases in vitro. All the other
isoforms have reduced activity, suggesting that their true function may be the deacylation
of other substrates. Alternatively, they may play a role in the recognition of acetyllysine
for protein– protein interactions rather than its destruction. A further ambiguity in the
HDAC nomenclature lies in the existence of lysine residues acylated with a plethora
of short chain groups. These range from the C1–C4 short chain formyl, acetyl, propionyl,
and butyryl to fatty acids of medium or longer chains such as the C14 myristoyl, as well as
fatty acids bearing additional functional groups such as malonyl, succinyl, crotonyl, and
β-hydroxybutyrate. These nonacetyl posttranslational modifications also serve as sub-
strates for HDACs, to varying degrees depending on the isoform.
13
Nor are the effects
of HDACs limited to histones as suggested by the name. Reversible lysine acylation is in
fact a major posttranslational modification in prokaryotes and eukaryotes, accomplished
by enzymes (the histone acetyltransferases or HATs) as well as nonenzymatic mecha-
nisms.
14
In humans, the HDACs play an important role in the deacetylation of over a
1000 nonhistone proteins in various cellular compartments (Table 2.2).
2.2 Clinically approved HDAC inhibitors
Since the nature of the zinc-binding group drives binding affinity, HDAC inhibitors are
usually grouped according to the identity of this warhead. Thus far, HDAC inhibitors
containing one of three zinc-binding groups have achieved regulatory approval: the
hydroxamic acids, thiol prodrugs, andortho-aminoanilides (Fig. 2.2). In addition, a fourth
class of HDAC inhibitors contains a carboxylic acid zinc-binding group. Although car-
boxylic acids such as butyrate derivatives and the repurposed valproic acid have entered
clinical trials as HDAC inhibitors, their level of potency is weak (high millimolar IC
50
values) and they will not be discussed further. A critical point for HDAC inhibitor design
is the fact that substrate recognition is limited to the acetyllysine sidechain rather than the
22 Histone modifications in therapy
diverse array of cytoplasmic proteins, CD1 is less catalytically active with a preference
for C-terminal acetyllysine substrates.
10
The remaining two HDAC isoforms, the class
IIb HDAC10 and the class IV isoform HDAC11, both have unusual features. HDAC10
is cytoplasmic in location with an extended C-terminal domain, and more efficient in the
deacetylation of polyamines such as spermidine rather than protein substrates.
11
HDAC11 has features that resemble both the class I and class II enzymes. It is nuclear
in localization, and its preferred substrates are longer chain fatty acyl-lysine residues of
8–18 carbons rather than acetyllysine.
12
Lysine acetylation was first observed in the abundant histone proteins and the
enzymes responsible for acetyl group removal were logically named as histone deacety-
lases. However, the HDAC nomenclature is misleading and obscures the heterogeneity
within the family. Only four isoforms, the nuclear HDAC1, HDAC2, HDAC3, and the
cytoplasmic HDAC6 are catalytically efficient as lysine deacetylases in vitro. All the other
isoforms have reduced activity, suggesting that their true function may be the deacylation
of other substrates. Alternatively, they may play a role in the recognition of acetyllysine
for protein– protein interactions rather than its destruction. A further ambiguity in the
HDAC nomenclature lies in the existence of lysine residues acylated with a plethora
of short chain groups. These range from the C1–C4 short chain formyl, acetyl, propionyl,
and butyryl to fatty acids of medium or longer chains such as the C14 myristoyl, as well as
fatty acids bearing additional functional groups such as malonyl, succinyl, crotonyl, and
β-hydroxybutyrate. These nonacetyl posttranslational modifications also serve as sub-
strates for HDACs, to varying degrees depending on the isoform.
13
Nor are the effects
of HDACs limited to histones as suggested by the name. Reversible lysine acylation is in
fact a major posttranslational modification in prokaryotes and eukaryotes, accomplished
by enzymes (the histone acetyltransferases or HATs) as well as nonenzymatic mecha-
nisms.
14
In humans, the HDACs play an important role in the deacetylation of over a
1000 nonhistone proteins in various cellular compartments (Table 2.2).
2.2 Clinically approved HDAC inhibitors
Since the nature of the zinc-binding group drives binding affinity, HDAC inhibitors are
usually grouped according to the identity of this warhead. Thus far, HDAC inhibitors
containing one of three zinc-binding groups have achieved regulatory approval: the
hydroxamic acids, thiol prodrugs, andortho-aminoanilides (Fig. 2.2). In addition, a fourth
class of HDAC inhibitors contains a carboxylic acid zinc-binding group. Although car-
boxylic acids such as butyrate derivatives and the repurposed valproic acid have entered
clinical trials as HDAC inhibitors, their level of potency is weak (high millimolar IC
50
values) and they will not be discussed further. A critical point for HDAC inhibitor design
is the fact that substrate recognition is limited to the acetyllysine sidechain rather than the
22 Histone modifications in therapy
protein backbone or adjacent amino acid residues. Thus, the interactions are not
sequence specific and can be recapitulated within the dimensions of small molecules that
are compliant with physicochemical guidelines for oral bioavailability.
Although hydroxamic acids have a long history of investigation as reversible inhib-
itors of zinc metalloenzymes, their most successful application is in targeting HDACs.
The classic example vorinostat (SAHA,2,Fig. 2.3) arose from lead optimization by
Breslow’s group at Columbia University and was later acquired by Merck. It was the first
HDAC inhibitor in the clinic, receiving FDA approval for the treatment of cutaneous
T-cell lymphoma in 2006.
15
X-ray structures of vorinostat-HDAC complexes indicate
that the hydroxamic acid is engaged in bidentate chelation to the HDAC active site zinc,
O
N
H
OH
Hydroxamic
acid
S
R
Thiol prodrug
Activation SH
Thiol
N
H
O
H
2
N
or tho-Aminoanilide
Fig. 2.2The three classes of HDAC zinc-binding group that have led to clinically approved agents. The
circles represent the linker and cap portions of a HDAC inhibitor.
Table 2.2Examples of proteins undergoing reversible lysine acetylation, the resulting consequences,
and the major HDAC isoforms involved in deacetylation.
Acetylated protein Consequence
Deacetylating HDAC
isoforms
Histones Transcriptional activation 1, 2, 3, 8
p53 Stability, transcriptional activation 1
E2F DNA binding 1
DNMT1 Degradation 1
ATM kinase Transcriptional activation 1, 2
CAF1 mRNA decay 1, 2
Aurora B kinase Reduced kinase activity 3
STAT3 Nuclear and mitochondrial
localization
3
SMC3 Chromatid cohesion 8
GCMA Transcriptional activation 1, 3, 4, 5
PLAG1 Transcriptional activation 7
Hsp90 Reduced p23 binding 6
Ku70 Reduced Bax binding 6
Tubulin Mechanical stability 6
Cortactin Reduced KEAP1 binding 6
Tau Reduced aggregation 6
23HDAC inhibitors in cancer therapy
sequence specific and can be recapitulated within the dimensions of small molecules that
are compliant with physicochemical guidelines for oral bioavailability.
Although hydroxamic acids have a long history of investigation as reversible inhib-
itors of zinc metalloenzymes, their most successful application is in targeting HDACs.
The classic example vorinostat (SAHA,2,Fig. 2.3) arose from lead optimization by
Breslow’s group at Columbia University and was later acquired by Merck. It was the first
HDAC inhibitor in the clinic, receiving FDA approval for the treatment of cutaneous
T-cell lymphoma in 2006.
15
X-ray structures of vorinostat-HDAC complexes indicate
that the hydroxamic acid is engaged in bidentate chelation to the HDAC active site zinc,
O
N
H
OH
Hydroxamic
acid
S
R
Thiol prodrug
Activation SH
Thiol
N
H
O
H
2
N
or tho-Aminoanilide
Fig. 2.2The three classes of HDAC zinc-binding group that have led to clinically approved agents. The
circles represent the linker and cap portions of a HDAC inhibitor.
Table 2.2Examples of proteins undergoing reversible lysine acetylation, the resulting consequences,
and the major HDAC isoforms involved in deacetylation.
Acetylated protein Consequence
Deacetylating HDAC
isoforms
Histones Transcriptional activation 1, 2, 3, 8
p53 Stability, transcriptional activation 1
E2F DNA binding 1
DNMT1 Degradation 1
ATM kinase Transcriptional activation 1, 2
CAF1 mRNA decay 1, 2
Aurora B kinase Reduced kinase activity 3
STAT3 Nuclear and mitochondrial
localization
3
SMC3 Chromatid cohesion 8
GCMA Transcriptional activation 1, 3, 4, 5
PLAG1 Transcriptional activation 7
Hsp90 Reduced p23 binding 6
Ku70 Reduced Bax binding 6
Tubulin Mechanical stability 6
Cortactin Reduced KEAP1 binding 6
Tau Reduced aggregation 6
23HDAC inhibitors in cancer therapy
conforming to the model (Fig. 2.1) for HDAC inhibition. Nearly a decade later, two
other hydroxamic acids were also approved by the FDA, TopoTarget’s belinostat
16
(PXD-101,3) for peripheral T-cell lymphoma and Novartis’s panobinostat
17
(LBH-
589,4) for refractory or relapsed multiple myeloma. Both3and4contain a more rigid
cinnamoyl linker compared to the aliphatic chain present in vorinostat. Despite the pop-
ularity of hydroxamic acids as zinc-binding groups, they do suffer from extensive phase II
conjugation through glucuronidation to produce inactive metabolites. Furthermore,
there are potential concerns regarding nonspecific metal binding and mutagenicity.
18
The depsipeptide HDAC inhibitors containing a thiol prodrug are a family of bac-
terial natural products. The first to be discovered, romidepsin (FK228,5,Fig. 2.4)
was isolated from the fermentation broth ofChromobacterium violaceum. The molecule’s
disulfide bridge serves to enhance cell permeability relative to the free thiol. Within
the cell’s reducing environment, the disulfide is reduced to release a free thiol that
O
O
O
N
H
O
HN
N
H
O
HN
O
S
S
Romidepsin (5) O
O
O
N
H
O
N
H
N
H
O
HN
O
SH
Zn
2+
S
Disulfide
reduction
Romidepsin thiol
coordinated to Zn
2+
H
N
O
N
H
O
N
F
H
2
NTucidinostat (6)
Fig. 2.4Romidepsin and tucidinostat, approved HDAC inhibitors with thiol andortho-aminoanilide
zinc-binding groups, respectively.
N
H
O
H
N
HN
Panobinostat (4)
N
H
OH
O
Belinostat (3)
S
N H
H
N
N
H
OH
O
O
Vorinostat (2)
OO
OH
Fig. 2.3The three FDA approved hydroxamic acid HDAC inhibitors.
24
Histone modifications in therapy
other hydroxamic acids were also approved by the FDA, TopoTarget’s belinostat
16
(PXD-101,3) for peripheral T-cell lymphoma and Novartis’s panobinostat
17
(LBH-
589,4) for refractory or relapsed multiple myeloma. Both3and4contain a more rigid
cinnamoyl linker compared to the aliphatic chain present in vorinostat. Despite the pop-
ularity of hydroxamic acids as zinc-binding groups, they do suffer from extensive phase II
conjugation through glucuronidation to produce inactive metabolites. Furthermore,
there are potential concerns regarding nonspecific metal binding and mutagenicity.
18
The depsipeptide HDAC inhibitors containing a thiol prodrug are a family of bac-
terial natural products. The first to be discovered, romidepsin (FK228,5,Fig. 2.4)
was isolated from the fermentation broth ofChromobacterium violaceum. The molecule’s
disulfide bridge serves to enhance cell permeability relative to the free thiol. Within
the cell’s reducing environment, the disulfide is reduced to release a free thiol that
O
O
O
N
H
O
HN
N
H
O
HN
O
S
S
Romidepsin (5) O
O
O
N
H
O
N
H
N
H
O
HN
O
SH
Zn
2+
S
Disulfide
reduction
Romidepsin thiol
coordinated to Zn
2+
H
N
O
N
H
O
N
F
H
2
NTucidinostat (6)
Fig. 2.4Romidepsin and tucidinostat, approved HDAC inhibitors with thiol andortho-aminoanilide
zinc-binding groups, respectively.
N
H
O
H
N
HN
Panobinostat (4)
N
H
OH
O
Belinostat (3)
S
N H
H
N
N
H
OH
O
O
Vorinostat (2)
OO
OH
Fig. 2.3The three FDA approved hydroxamic acid HDAC inhibitors.
24
Histone modifications in therapy
functions as a monodentate zinc-binding group. The active form, romidepsin thiol, is a
potent HDAC inhibitor selective for the class I isoforms, and received FDA approval for
the treatment of cutaneous and peripheral T-cell lymphoma.
19
Finally, tucidinostat (chi-
damide,6) is a representative of the syntheticortho-aminoanilide (benzamide) class of
HDAC inhibitors. Like the hydroxamic acids, theortho-aminoanilides function as biden-
tate coordinators through the carbonyl oxygen and the aniline. Tucidinostat was the most
recently approved HDAC inhibitor, by the Chinese FDA for peripheral T-cell
lymphoma.
20
At the pharmacological level, the five approved drugs have individual patterns of
selectivity (Table 2.3). All potently inhibit the class I nuclear isoforms HDAC1, HDAC2,
and HDAC3 that physiologically exist in multiprotein complexes. The three hydroxamic
acids2–4display the lowest selectivity, acting as pan-HDAC inhibitors against all 11 iso-
forms. Among these three, vorinostat (2) has the lowest level of inhibition, due to a con-
scious decision during candidate selection to avoid more potent compounds as these were
predicted to have a lower safety and tolerability profile. Panobinostat (4), the newest
hydroxamic acid to be approved, has the strongest pan inhibition, with single-digitK
i
values against both class I and class II HDAC isoforms. Meanwhile, romidepsin (5)is
selective for the class I isoforms HDAC1, HDAC2, HDAC3, as well as HDAC10
and HDAC11, while sparing class II isoforms and HDAC6.
22
A similar pattern of inhi-
bition, albeit at a lower potency, is observed for tucidinostat (6).
23
The promising activity of2–6against human cancer cell lines in vitro and tumor
xenograft animal models in vivo led to the above compounds being entered into a series
of phase I/II clinical trials. Thanks to the resources available in big pharma, this was most
extensively carried out for vorinostat and panobinostat by Merck and Novartis, respec-
tively (Table 2.4). Overall, the results of these studies were disappointing compared to the
encouraging data from preclinical animal models. In the majority of cases, a lack of effi-
cacy and dose-limiting toxicities were observed, chiefly fatigue, diarrhea, bone marrow
toxicity, thrombocytopenia, and cardiac arrhythmia. A therapeutic window was possible
in hematological cancers, and this eventually led to the approvals for cutaneous T-cell
lymphoma for vorinostat and romidepsin. Since this is a relatively rare cancer, and the
HDAC inhibitors are not first-line therapy, it has limited their commercial success.
Romidepsin later received approval for peripheral T-cell lymphoma, as did the newer
drugs belinostat and tucidinostat. Meanwhile, Novartis successfully launched panobino-
stat for the treatment of refractory or relapsed multiple myeloma, a significantly larger
market than T-cell lymphoma and reflected in panobinostat being the only HDAC
inhibitor submitted for approval to both the FDA and the EMA.
There are two complex questions regarding the clinical performance of the approved
HDAC inhibitors: First, why are they unsatisfactory outside T-cell lymphomas? Second,
why are T-cell lymphomas particularly responsive? Although a complete answer is elu-
sive, there are likely to be a number of contributing factors. The early clinical trials were
carried out on terminally ill patients or those unresponsive to other drugs and may not
25HDAC inhibitors in cancer therapy
potent HDAC inhibitor selective for the class I isoforms, and received FDA approval for
the treatment of cutaneous and peripheral T-cell lymphoma.
19
Finally, tucidinostat (chi-
damide,6) is a representative of the syntheticortho-aminoanilide (benzamide) class of
HDAC inhibitors. Like the hydroxamic acids, theortho-aminoanilides function as biden-
tate coordinators through the carbonyl oxygen and the aniline. Tucidinostat was the most
recently approved HDAC inhibitor, by the Chinese FDA for peripheral T-cell
lymphoma.
20
At the pharmacological level, the five approved drugs have individual patterns of
selectivity (Table 2.3). All potently inhibit the class I nuclear isoforms HDAC1, HDAC2,
and HDAC3 that physiologically exist in multiprotein complexes. The three hydroxamic
acids2–4display the lowest selectivity, acting as pan-HDAC inhibitors against all 11 iso-
forms. Among these three, vorinostat (2) has the lowest level of inhibition, due to a con-
scious decision during candidate selection to avoid more potent compounds as these were
predicted to have a lower safety and tolerability profile. Panobinostat (4), the newest
hydroxamic acid to be approved, has the strongest pan inhibition, with single-digitK
i
values against both class I and class II HDAC isoforms. Meanwhile, romidepsin (5)is
selective for the class I isoforms HDAC1, HDAC2, HDAC3, as well as HDAC10
and HDAC11, while sparing class II isoforms and HDAC6.
22
A similar pattern of inhi-
bition, albeit at a lower potency, is observed for tucidinostat (6).
23
The promising activity of2–6against human cancer cell lines in vitro and tumor
xenograft animal models in vivo led to the above compounds being entered into a series
of phase I/II clinical trials. Thanks to the resources available in big pharma, this was most
extensively carried out for vorinostat and panobinostat by Merck and Novartis, respec-
tively (Table 2.4). Overall, the results of these studies were disappointing compared to the
encouraging data from preclinical animal models. In the majority of cases, a lack of effi-
cacy and dose-limiting toxicities were observed, chiefly fatigue, diarrhea, bone marrow
toxicity, thrombocytopenia, and cardiac arrhythmia. A therapeutic window was possible
in hematological cancers, and this eventually led to the approvals for cutaneous T-cell
lymphoma for vorinostat and romidepsin. Since this is a relatively rare cancer, and the
HDAC inhibitors are not first-line therapy, it has limited their commercial success.
Romidepsin later received approval for peripheral T-cell lymphoma, as did the newer
drugs belinostat and tucidinostat. Meanwhile, Novartis successfully launched panobino-
stat for the treatment of refractory or relapsed multiple myeloma, a significantly larger
market than T-cell lymphoma and reflected in panobinostat being the only HDAC
inhibitor submitted for approval to both the FDA and the EMA.
There are two complex questions regarding the clinical performance of the approved
HDAC inhibitors: First, why are they unsatisfactory outside T-cell lymphomas? Second,
why are T-cell lymphomas particularly responsive? Although a complete answer is elu-
sive, there are likely to be a number of contributing factors. The early clinical trials were
carried out on terminally ill patients or those unresponsive to other drugs and may not
25HDAC inhibitors in cancer therapy
Table 2.3The activity profile of the five approved drugs against the 11 individual human HDAC isoforms: K
i
values for the hydroxamic acids are
taken from a side-by-side comparison in Ref. 21.
HDAC isoformK
i
or IC
50
(nM)
Cpd. 1 2 3 84579610 11
260 42 36 173 20 36 129 49 29 60 31
326 22 19 22 15 25 51 24 10 59 27
43222211211314
511 1>1000 647>1000>1000>1000 226 1 0.3
695 160 67 733>30,000>30,000>30,000>30,000>30,000 78 432 IC
50
values for romidepsin ( 5) in its reduced thiol state and tucidinostat ( 6) are from Refs.22 and 23, respectively.
i
values for the hydroxamic acids are
taken from a side-by-side comparison in Ref. 21.
HDAC isoformK
i
or IC
50
(nM)
Cpd. 1 2 3 84579610 11
260 42 36 173 20 36 129 49 29 60 31
326 22 19 22 15 25 51 24 10 59 27
43222211211314
511 1>1000 647>1000>1000>1000 226 1 0.3
695 160 67 733>30,000>30,000>30,000>30,000>30,000 78 432 IC
50
values for romidepsin ( 5) in its reduced thiol state and tucidinostat ( 6) are from Refs.22 and 23, respectively.
reflect the true potential of HDAC inhibitors. On the pharmacokinetic side, it is possible
that these drugs did not reach a sufficiently high concentration within the interior of solid
tumors, thus limiting their efficacy. Neither was there patient stratification in terms of
their histone acetylation status or predisposition to resistance. The development of tumor
resistance is a major issue and several common mechanisms of resistance have been iden-
tified. First, the tumor can respond through compensating changes in HAT/HDAC
expression levels or their catalytic activity to maintain the cancerous state. Second,
HDAC inhibitors induce p21, thioredoxin, and ABC transporters, all of which contrib-
ute to reduce dug efficacy.
On the pharmacodynamic side, all five approved drugs powerfully increase the acet-
ylation levels of histone proteins through their inhibition of the nuclear class I isoforms.
Apparently, the consequent global activation of silenced transcription is a double-edged
sword: on the one hand, acting to interrupt uncontrolled proliferation in cancer cells, but
on the other responsible for on-target toxic side effects in normal cells. While romidepsin
and tucidinostat are sparing in their inhibition of class II isoforms, this has not yielded a
clear therapeutic advantage for these two drugs compared to the more promiscuous pan
inhibition of the hydroxamic acids. Beyond the direct impact on histone acetylation,
another unknown factor is the effect on lysine acylation in nonhistone proteins and poly-
amine acylation in both the nucleus and the cytoplasm. The multitude of pathways and
Table 2.4Cancer types investigated in clinical trials for
vorinostat and panobinostat.
Hematological cancers
Leukemia
Lymphoma
Other cancers
Breast cancer
Colorectal cancer
Cystic carcinoma
Gastric cancer
Glioma
Mesothelioma
Neuroendocrine cancer
Nonsmall-cell lung cancer
Ovarian cancer
Pancreatic cancer
Pelvic and ureter cancer
Prostate cancer
Renal cancer
Sarcoma
Small cell lung cancer
Thyroid carcinoma
27HDAC inhibitors in cancer therapy
that these drugs did not reach a sufficiently high concentration within the interior of solid
tumors, thus limiting their efficacy. Neither was there patient stratification in terms of
their histone acetylation status or predisposition to resistance. The development of tumor
resistance is a major issue and several common mechanisms of resistance have been iden-
tified. First, the tumor can respond through compensating changes in HAT/HDAC
expression levels or their catalytic activity to maintain the cancerous state. Second,
HDAC inhibitors induce p21, thioredoxin, and ABC transporters, all of which contrib-
ute to reduce dug efficacy.
On the pharmacodynamic side, all five approved drugs powerfully increase the acet-
ylation levels of histone proteins through their inhibition of the nuclear class I isoforms.
Apparently, the consequent global activation of silenced transcription is a double-edged
sword: on the one hand, acting to interrupt uncontrolled proliferation in cancer cells, but
on the other responsible for on-target toxic side effects in normal cells. While romidepsin
and tucidinostat are sparing in their inhibition of class II isoforms, this has not yielded a
clear therapeutic advantage for these two drugs compared to the more promiscuous pan
inhibition of the hydroxamic acids. Beyond the direct impact on histone acetylation,
another unknown factor is the effect on lysine acylation in nonhistone proteins and poly-
amine acylation in both the nucleus and the cytoplasm. The multitude of pathways and
Table 2.4Cancer types investigated in clinical trials for
vorinostat and panobinostat.
Hematological cancers
Leukemia
Lymphoma
Other cancers
Breast cancer
Colorectal cancer
Cystic carcinoma
Gastric cancer
Glioma
Mesothelioma
Neuroendocrine cancer
Nonsmall-cell lung cancer
Ovarian cancer
Pancreatic cancer
Pelvic and ureter cancer
Prostate cancer
Renal cancer
Sarcoma
Small cell lung cancer
Thyroid carcinoma
27HDAC inhibitors in cancer therapy
HDAC substrates helps to explain the pleiotropic effects observed in cells treated with
HDAC inhibitors including differentiation, immunomodulation, reduced angiogenesis,
cell cycle arrest, defective DNA repair, apoptosis, and autophagy.
Now we turn to the utility of HDAC inhibitors in the treatment of hematological
cancers. All blood cells are derived from hematopoietic stem cells by a complex process
of differentiation in which epigenetic programming by HDACs plays a central role.
24
These derived lineages are more plastic and likely to be more susceptible to reprogram-
ming by HDAC inhibition compared to other terminally differentiated cancer types.
Meanwhile, the treatment of T-cell lymphoma has been the most promising therapeutic
indication for HDAC inhibitors.
25
In this condition, malignant cells release a set of cyto-
kines that results in immune suppression and creates an inflammatory environment.
26, 27
The reduction of this cytokine storm appears to be a key consequence of the treatment of
T-cell lymphoma by HDAC inhibitors that is unique to these cancers.
28
In the NCI clin-
ical trials of romidepsin, DNA microarray studies with T-cell lymphoma patient-derived
samples indicate that hundreds of genes undergo induction or repression.
29
However, the
effects were transient with a return to basal levels observed 24h after drug treatment. This
rapid cycle of response and reversal might be sufficient to disrupt proliferation in hema-
tological cancers but not more aggressive solid tumors.
2.3 Hydroxamic acid HDAC inhibitor clinical candidates
In addition to the five approved drugs, a series of other HDAC inhibitors are at various
stages of clinical development with the hydroxamic acid being the most common zinc-
binding group. Tefinostat (CHR-2845,7,Fig. 2.5) was developed by Chroma Thera-
peutics that was subsequently acquired by GlaxoSmithKline. The molecule is identical to
vorinostat (2) except for substitution of the phenyl ring to incorporate an ester group for
selective targeting. The ester undergoes hydrolysis in cells expressing carboxylesterase-1
(hCE-1), namely hepatocytes and monocytes. In normal cells, uptake of the neutral drug
is balanced by efflux leading to a reduced effect whereas hCE-1 expressing cells produce
(8) which is ionized and retained. Both7and8are vorinostat-like in their HDAC inhi-
bition, with IC
50values of 90 and 113nM, respectively, against HDACs from HeLa cell
extracts. In a phase I study in patients with refractory or relapsed hematological cancers,
dose-limiting toxicity was not observed at the highest dose of 640mg and adverse events
limited to Grade 1/2.
30
A shorter aliphatic linker was employed by Crystal Genomics in
their candidate CG200745 (9).
31
Although details of its activity are undisclosed,
CG200745 is likely to be a pan-HDAC inhibitor with nanomolar IC
50values. Results
from a phase I trial in patients in patients with refractory solid tumors suggested a dose of
250mg/m
2
for further studies,
32
and CG200745 is being evaluated for the treatment of
myelodysplastic syndrome.
28 Histone modifications in therapy
HDAC inhibitors including differentiation, immunomodulation, reduced angiogenesis,
cell cycle arrest, defective DNA repair, apoptosis, and autophagy.
Now we turn to the utility of HDAC inhibitors in the treatment of hematological
cancers. All blood cells are derived from hematopoietic stem cells by a complex process
of differentiation in which epigenetic programming by HDACs plays a central role.
24
These derived lineages are more plastic and likely to be more susceptible to reprogram-
ming by HDAC inhibition compared to other terminally differentiated cancer types.
Meanwhile, the treatment of T-cell lymphoma has been the most promising therapeutic
indication for HDAC inhibitors.
25
In this condition, malignant cells release a set of cyto-
kines that results in immune suppression and creates an inflammatory environment.
26, 27
The reduction of this cytokine storm appears to be a key consequence of the treatment of
T-cell lymphoma by HDAC inhibitors that is unique to these cancers.
28
In the NCI clin-
ical trials of romidepsin, DNA microarray studies with T-cell lymphoma patient-derived
samples indicate that hundreds of genes undergo induction or repression.
29
However, the
effects were transient with a return to basal levels observed 24h after drug treatment. This
rapid cycle of response and reversal might be sufficient to disrupt proliferation in hema-
tological cancers but not more aggressive solid tumors.
2.3 Hydroxamic acid HDAC inhibitor clinical candidates
In addition to the five approved drugs, a series of other HDAC inhibitors are at various
stages of clinical development with the hydroxamic acid being the most common zinc-
binding group. Tefinostat (CHR-2845,7,Fig. 2.5) was developed by Chroma Thera-
peutics that was subsequently acquired by GlaxoSmithKline. The molecule is identical to
vorinostat (2) except for substitution of the phenyl ring to incorporate an ester group for
selective targeting. The ester undergoes hydrolysis in cells expressing carboxylesterase-1
(hCE-1), namely hepatocytes and monocytes. In normal cells, uptake of the neutral drug
is balanced by efflux leading to a reduced effect whereas hCE-1 expressing cells produce
(8) which is ionized and retained. Both7and8are vorinostat-like in their HDAC inhi-
bition, with IC
50values of 90 and 113nM, respectively, against HDACs from HeLa cell
extracts. In a phase I study in patients with refractory or relapsed hematological cancers,
dose-limiting toxicity was not observed at the highest dose of 640mg and adverse events
limited to Grade 1/2.
30
A shorter aliphatic linker was employed by Crystal Genomics in
their candidate CG200745 (9).
31
Although details of its activity are undisclosed,
CG200745 is likely to be a pan-HDAC inhibitor with nanomolar IC
50values. Results
from a phase I trial in patients in patients with refractory solid tumors suggested a dose of
250mg/m
2
for further studies,
32
and CG200745 is being evaluated for the treatment of
myelodysplastic syndrome.
28 Histone modifications in therapy
Ricolinostat (ACY-1215,10,Fig. 2.6) originates from Acetylon Pharmaceuticals and
is now being developed by Regenacy Pharmaceuticals following the acquisition of Acet-
ylon by Celgene. Although it contains the same six carbon methylene linker as vorinostat
or tefinostat, the branching within the cap leads to isoform selectivity (Table 2.5) with a
bias toward inhibition of the cytoplasmic HDAC6.
33
Nevertheless, like the approved
hydroxamic acids, ricolinostat also inhibits the nuclear isoforms HDAC1, HDAC2,
H
N
N
H
OH
O
O
H
N
O
O
Tefinostat (7)
H
N
N
H
OH
O
O
H
N
HO
O
Carboxylesterase-1
(8)
N
H
OH
O
H
N
O
N
O
CG200745(9)
Fig. 2.5The aliphatic hydroxamic acid clinical candidates tefinostat and CG200745.
N
H
OH
O
N
N
N
Pracinostat (13)
N
H
N H
OH
O
N
N
O
N Ricolinostat (10)
N H N
H
OH
O
N
N
O
N Citarinostat (11)
Cl
N
H
OH
O
N
S
OO
N
Resminostat (12)
Fig. 2.6Clinical candidate HDAC inhibitors from Acetylon, 4SC and S*Bio with aliphatic and alkenyl
hydroxamic acids, respectively.
29
HDAC inhibitors in cancer therapy
is now being developed by Regenacy Pharmaceuticals following the acquisition of Acet-
ylon by Celgene. Although it contains the same six carbon methylene linker as vorinostat
or tefinostat, the branching within the cap leads to isoform selectivity (Table 2.5) with a
bias toward inhibition of the cytoplasmic HDAC6.
33
Nevertheless, like the approved
hydroxamic acids, ricolinostat also inhibits the nuclear isoforms HDAC1, HDAC2,
H
N
N
H
OH
O
O
H
N
O
O
Tefinostat (7)
H
N
N
H
OH
O
O
H
N
HO
O
Carboxylesterase-1
(8)
N
H
OH
O
H
N
O
N
O
CG200745(9)
Fig. 2.5The aliphatic hydroxamic acid clinical candidates tefinostat and CG200745.
N
H
OH
O
N
N
N
Pracinostat (13)
N
H
N H
OH
O
N
N
O
N Ricolinostat (10)
N H N
H
OH
O
N
N
O
N Citarinostat (11)
Cl
N
H
OH
O
N
S
OO
N
Resminostat (12)
Fig. 2.6Clinical candidate HDAC inhibitors from Acetylon, 4SC and S*Bio with aliphatic and alkenyl
hydroxamic acids, respectively.
29
HDAC inhibitors in cancer therapy
Table 2.5The activity profile reported for clinical candidates 10–13.
HDAC isoformK
i
or IC
50
(nM)
Cpd. 1 2 3 8 457 96 10 11
1058 48 51 100 7000 5000 1400>10,000 5–>10,000
1135 45 46 137>20,000>20,000 7300>20,000 3––
1243–50 877––––72––
1328 27 19 48 16 21 104 24 247 23 24 IC
50
values for ricolinostat ( 10), citarinostat ( 11), and resminostat ( 12) are taken from Refs.33–35, respectively, and K
i
values for pracinostat ( 13) from Ref.21.
HDAC isoformK
i
or IC
50
(nM)
Cpd. 1 2 3 8 457 96 10 11
1058 48 51 100 7000 5000 1400>10,000 5–>10,000
1135 45 46 137>20,000>20,000 7300>20,000 3––
1243–50 877––––72––
1328 27 19 48 16 21 104 24 247 23 24 IC
50
values for ricolinostat ( 10), citarinostat ( 11), and resminostat ( 12) are taken from Refs.33–35, respectively, and K
i
values for pracinostat ( 13) from Ref.21.
and HDAC3 with IC50values below 100nM. While phase I/II trials in hematological
malignancies were promising, the current focus at Regenacy is a phase II trial for diabetic
peripheral neuropathy. Acetylon has also reported a chlorinated version of ricolinostat as
the second-generation analogue citarinostat (ACY-241,11). Citarinostat has a similar
pattern of isoform selectivity to ricolinostat,
34
and is now part of Bristol Myers Squibb’s
portfolio following the acquisition of Celgene. It is in phase I clinical trials for relapsed
and refractory multiple myeloma.
Resminostat (12) from 4SC has anα,β-unsaturated alkenyl hydroxamic acid similar to
belinostat and panobinostat attached to a pyrrole heterocycle, and inhibits both nuclear
HDACs and the cytoplasmic HDAC6.
35
In a phase II trial in patients with relapsed or
refractory Hodgkin’s lymphoma, the drug was orally dosed at either 600 or 800mg daily
for 5 days every 2 weeks.
36
An objective response rate of 34% was reported with adverse
events mainly limited to Grade 1 or 2. Resminostat is undergoing a pivotal phase II trial
for the treatment of cutaneous T-cell lymphoma.
Pracinostat (13) was discovered at S*Bio and is currently in clinical development by the
Helsinn and Menarini groups. Like resminostat, it has an unsaturated linker, but with a
benzimidazole scaffold containing a tertiary amine for improved aqueous solubility. Phar-
macodynamically, pracinostat is a pan inhibitor that inhibits all 11 isoforms (Table 2.5).
21
The compound displayed good pharmacokinetics, with an oral bioavailability of 34% and
65% in mice and dogs, respectively. The phase II trial results for myelofibrosis were
modest,
37
and the attention has shifted to combination therapy to be described later.
Four hydroxamic acids in clinical development feature a rigid aromatic phenyl linker,
as opposed to the more flexible aliphatic or alkenyl versions found in the first-generation
approved drugs. Givinostat was discovered at Italfarmaco (ITF2357,14,Fig. 2.7) and is a
pan-HDAC inhibitor (Table 2.6) with predominant activity against the nuclear isoforms
N
H
OH
O
O
H
N
O
O
N
Abexinostat (15)
N H
OH
O
N HO
O
N
Givinostat (14)
O
N
H
O
AR-42 (16)
N H
OH
O
N
H
OH
H
N
O
N
S
N
S
Bisthianostat(17)
Fig. 2.7Clinical candidate HDAC inhibitors with phenyl hydroxamic acids.
31
HDAC inhibitors in cancer therapy
malignancies were promising, the current focus at Regenacy is a phase II trial for diabetic
peripheral neuropathy. Acetylon has also reported a chlorinated version of ricolinostat as
the second-generation analogue citarinostat (ACY-241,11). Citarinostat has a similar
pattern of isoform selectivity to ricolinostat,
34
and is now part of Bristol Myers Squibb’s
portfolio following the acquisition of Celgene. It is in phase I clinical trials for relapsed
and refractory multiple myeloma.
Resminostat (12) from 4SC has anα,β-unsaturated alkenyl hydroxamic acid similar to
belinostat and panobinostat attached to a pyrrole heterocycle, and inhibits both nuclear
HDACs and the cytoplasmic HDAC6.
35
In a phase II trial in patients with relapsed or
refractory Hodgkin’s lymphoma, the drug was orally dosed at either 600 or 800mg daily
for 5 days every 2 weeks.
36
An objective response rate of 34% was reported with adverse
events mainly limited to Grade 1 or 2. Resminostat is undergoing a pivotal phase II trial
for the treatment of cutaneous T-cell lymphoma.
Pracinostat (13) was discovered at S*Bio and is currently in clinical development by the
Helsinn and Menarini groups. Like resminostat, it has an unsaturated linker, but with a
benzimidazole scaffold containing a tertiary amine for improved aqueous solubility. Phar-
macodynamically, pracinostat is a pan inhibitor that inhibits all 11 isoforms (Table 2.5).
21
The compound displayed good pharmacokinetics, with an oral bioavailability of 34% and
65% in mice and dogs, respectively. The phase II trial results for myelofibrosis were
modest,
37
and the attention has shifted to combination therapy to be described later.
Four hydroxamic acids in clinical development feature a rigid aromatic phenyl linker,
as opposed to the more flexible aliphatic or alkenyl versions found in the first-generation
approved drugs. Givinostat was discovered at Italfarmaco (ITF2357,14,Fig. 2.7) and is a
pan-HDAC inhibitor (Table 2.6) with predominant activity against the nuclear isoforms
N
H
OH
O
O
H
N
O
O
N
Abexinostat (15)
N H
OH
O
N HO
O
N
Givinostat (14)
O
N
H
O
AR-42 (16)
N H
OH
O
N
H
OH
H
N
O
N
S
N
S
Bisthianostat(17)
Fig. 2.7Clinical candidate HDAC inhibitors with phenyl hydroxamic acids.
31
HDAC inhibitors in cancer therapy
Random documents with unrelated
content Scribd suggests to you:
content Scribd suggests to you:
Sudanilainen havahtui ja vastasi:
— Kyllä minä näin, kuinka sinä karkasit Gebrin kurkkuun. Vannon
kautta Allahin: sinä jalopeuranpenikka et kuole, mutta tyttö…
Idrys katsoi Neliin, joka nukkui pää vanhan Dinahin sylissä, ja
lisäsi lempeästi:
— Hänelle laitamme kamelin kyttyrälle pesän kuin linnulle, jottei
hän rasittuisi, vaan saisi matkalla nukkua yhtä rauhallisesti kuin nyt.
Sen sanottuaan hän meni erään kamelin luo ja alkoi yhdessä
beduiinien kanssa laittaa parhaan dromedaarin kyttyrälle sijaa Neliä
varten. Sitä tehdessään he keskustelivat, vieläpä riitelivätkin, mutta
vihdoin köysistä, peitteistä ja bamburuo'oista syntyi laite, joka
muistutti syvää koria. Siinä Nel saattoi istua ja maata tarvitsematta
pelätä putoavansa. Korin yli, joka oli niin suuri, että Dinahkin mahtui
siihen, pingotettiin vaate katoksi.
Stas oli iloinen, kun sai edes tämän aikaan. Ajateltuaan heidän
asemaansa hän tuli siihen johtopäätökseen, että heidät
saavutettaisiin ennen ensimmäistä koskipaikkaa, ja tämä ajatus
lohdutti häntä. Mutta nyt hän oli väsynyt, ja hän päätti sitoa itsensä
köydellä kiinni satulaan voidakseen nukkua kun hänen ei enää
tarvinnut tukea Neliä.
Yö kului ja sakaalien ulvonta lakkasi. Karavaanin oli määrä lähteä
liikkeelle. Nähdessään aamun koittavan sudanilaiset menivät
muutaman askelen päässä olevan kallion taa ja alkoivat siellä
peseytyä Koraanin määräysten mukaisesti käyttäen siihen hiekkaa
veden asemesta, jota katsoivat parhaaksi säästää. Kuului kuinka he
lukivat aamurukousta nimeltä "subg". Syvässä hiljaisuudessa saattoi
— Kyllä minä näin, kuinka sinä karkasit Gebrin kurkkuun. Vannon
kautta Allahin: sinä jalopeuranpenikka et kuole, mutta tyttö…
Idrys katsoi Neliin, joka nukkui pää vanhan Dinahin sylissä, ja
lisäsi lempeästi:
— Hänelle laitamme kamelin kyttyrälle pesän kuin linnulle, jottei
hän rasittuisi, vaan saisi matkalla nukkua yhtä rauhallisesti kuin nyt.
Sen sanottuaan hän meni erään kamelin luo ja alkoi yhdessä
beduiinien kanssa laittaa parhaan dromedaarin kyttyrälle sijaa Neliä
varten. Sitä tehdessään he keskustelivat, vieläpä riitelivätkin, mutta
vihdoin köysistä, peitteistä ja bamburuo'oista syntyi laite, joka
muistutti syvää koria. Siinä Nel saattoi istua ja maata tarvitsematta
pelätä putoavansa. Korin yli, joka oli niin suuri, että Dinahkin mahtui
siihen, pingotettiin vaate katoksi.
Stas oli iloinen, kun sai edes tämän aikaan. Ajateltuaan heidän
asemaansa hän tuli siihen johtopäätökseen, että heidät
saavutettaisiin ennen ensimmäistä koskipaikkaa, ja tämä ajatus
lohdutti häntä. Mutta nyt hän oli väsynyt, ja hän päätti sitoa itsensä
köydellä kiinni satulaan voidakseen nukkua kun hänen ei enää
tarvinnut tukea Neliä.
Yö kului ja sakaalien ulvonta lakkasi. Karavaanin oli määrä lähteä
liikkeelle. Nähdessään aamun koittavan sudanilaiset menivät
muutaman askelen päässä olevan kallion taa ja alkoivat siellä
peseytyä Koraanin määräysten mukaisesti käyttäen siihen hiekkaa
veden asemesta, jota katsoivat parhaaksi säästää. Kuului kuinka he
lukivat aamurukousta nimeltä "subg". Syvässä hiljaisuudessa saattoi
selvästi erottaa sanatkin: "Armollisen ja laupiaan Jumalan nimeen.
Ylistetty olkoon Herra, maailman valtias, armollinen ja laupias
tuomari! Sinua me kunnioitamme, Sinuun uskomme. Sinulta apua
rukoilemme. Johdata meitä sitä tietä pitkin, joka tuottaa Sinun
armosi ja hyvyytesi, mutta ei tielle syntisten, jotka ovat vihasi
ansainneet ja kulkevat eksyksissä. Amen."
Kuullessaan rukouksen Stas kohotti katseensa taivasta kohti ja
tässä kaukaisessa seudussa, keskellä autioita hietikoita, lausui:
— "Sinuun turvaten me iloitsemme, pyhä Jumalan Äiti…"
8
Yö valkeni päiväksi. Matkanteko oli juuri alkamassa, kun yhtäkkiä
joku huomasi suden noin sadan askeleen päässä karavaanista. Se
näytti olevan peloissaan ikään kuin se juoksisi vihollista pakoon.
Egyptissä ei ole sellaisia petoja, joita susi pelkäisi, ja siksi tulivat
arabit levottomiksi säikähtyneen suden näkemisestä. Mitä tämä
saattoi merkitä? Olivatko takaa-ajajat jo lähellä? Toinen beduiineista
kiipesi vikkelästi kalliolle, mutta kerran ympärilleen vilkaistuaan hän
syöksyi sieltä alas vielä nopeammin.
— Pyhä profeetta! hän huusi peloissaan. — Leijona juoksee
suoraan meitä kohti. Se on aivan lähellä!
Samassa kuului kallion takaa matala "vou"! ja Stas ja Nel
huudahtivat yhteen ääneen:
— Saba!
Ylistetty olkoon Herra, maailman valtias, armollinen ja laupias
tuomari! Sinua me kunnioitamme, Sinuun uskomme. Sinulta apua
rukoilemme. Johdata meitä sitä tietä pitkin, joka tuottaa Sinun
armosi ja hyvyytesi, mutta ei tielle syntisten, jotka ovat vihasi
ansainneet ja kulkevat eksyksissä. Amen."
Kuullessaan rukouksen Stas kohotti katseensa taivasta kohti ja
tässä kaukaisessa seudussa, keskellä autioita hietikoita, lausui:
— "Sinuun turvaten me iloitsemme, pyhä Jumalan Äiti…"
8
Yö valkeni päiväksi. Matkanteko oli juuri alkamassa, kun yhtäkkiä
joku huomasi suden noin sadan askeleen päässä karavaanista. Se
näytti olevan peloissaan ikään kuin se juoksisi vihollista pakoon.
Egyptissä ei ole sellaisia petoja, joita susi pelkäisi, ja siksi tulivat
arabit levottomiksi säikähtyneen suden näkemisestä. Mitä tämä
saattoi merkitä? Olivatko takaa-ajajat jo lähellä? Toinen beduiineista
kiipesi vikkelästi kalliolle, mutta kerran ympärilleen vilkaistuaan hän
syöksyi sieltä alas vielä nopeammin.
— Pyhä profeetta! hän huusi peloissaan. — Leijona juoksee
suoraan meitä kohti. Se on aivan lähellä!
Samassa kuului kallion takaa matala "vou"! ja Stas ja Nel
huudahtivat yhteen ääneen:
— Saba!
Koska sana "saba" merkitse leijonaa arabian kielessä, kauhistuivat
arabit kovasti, mutta Chamis purskahti nauruun ja sanoi:
— Tuon leijonan tunnen kyllä!
Chamis vihelsi ja iso koira laukkasi kamelien luo. Kun koira
huomasi lapset, se juoksi heidän luokseen, kaatoi iloissaan Nelin,
joka oli ojentanut kätensä koiraa kohti, hyppäsi Stasin luo,
juoksenteli haukkuen lasten ympärillä, kaatoi Nelin uudestaan,
loikkasi Stasin viereen ja heittäytyi vihdoin pitkälleen heidän
jalkojensa juureen ruveten haukottelemaan.
Koira oli laihtunut ja sen suu oli vaahdossa, mutta siitä huolimatta
se heilutti häntäänsä ja katsoi lempeästi Neliin, ikään kuin olisi
tahtonut sanoa: "Isäsi on käskenyt minun vartioida sinua; tässä minä
nyt olen!"
Lapset istuutuivat Saban viereen ja alkoivat hyväillä sitä. Beduiinit,
jotka eivät ikinä olleet nähneet niin suurta koiraa, katselivat sitä
ihmeissään toistaen: "Allah! o kelb kebir!" (Hyvä Jumala, kuinka
suuri koira!) Vähän aikaa paikallaan maattuaan Saba nosti suuren
kuononsa ylös, vainusi jotakin ja meni sammuneen nuotion paikalle,
jossa oli ruoan jätteitä. Kohta rutisivat lampaan- ja vuohenluut sen
suurissa hampaissa katketen kuin oljenkorret.
Sudanilaiset olivat rauhattomia koiran tulosta. He kutsuivat
Chamiksen syrjään ja keskustelivat levottomina.
— Paholainen tuon koiran on tänne lennättänyt! huudahti Gebr. —
Kuinka se on voinut löytääkin tänne, jos lapset kerran ajoivat
rautateitse Garakiin?
arabit kovasti, mutta Chamis purskahti nauruun ja sanoi:
— Tuon leijonan tunnen kyllä!
Chamis vihelsi ja iso koira laukkasi kamelien luo. Kun koira
huomasi lapset, se juoksi heidän luokseen, kaatoi iloissaan Nelin,
joka oli ojentanut kätensä koiraa kohti, hyppäsi Stasin luo,
juoksenteli haukkuen lasten ympärillä, kaatoi Nelin uudestaan,
loikkasi Stasin viereen ja heittäytyi vihdoin pitkälleen heidän
jalkojensa juureen ruveten haukottelemaan.
Koira oli laihtunut ja sen suu oli vaahdossa, mutta siitä huolimatta
se heilutti häntäänsä ja katsoi lempeästi Neliin, ikään kuin olisi
tahtonut sanoa: "Isäsi on käskenyt minun vartioida sinua; tässä minä
nyt olen!"
Lapset istuutuivat Saban viereen ja alkoivat hyväillä sitä. Beduiinit,
jotka eivät ikinä olleet nähneet niin suurta koiraa, katselivat sitä
ihmeissään toistaen: "Allah! o kelb kebir!" (Hyvä Jumala, kuinka
suuri koira!) Vähän aikaa paikallaan maattuaan Saba nosti suuren
kuononsa ylös, vainusi jotakin ja meni sammuneen nuotion paikalle,
jossa oli ruoan jätteitä. Kohta rutisivat lampaan- ja vuohenluut sen
suurissa hampaissa katketen kuin oljenkorret.
Sudanilaiset olivat rauhattomia koiran tulosta. He kutsuivat
Chamiksen syrjään ja keskustelivat levottomina.
— Paholainen tuon koiran on tänne lennättänyt! huudahti Gebr. —
Kuinka se on voinut löytääkin tänne, jos lapset kerran ajoivat
rautateitse Garakiin?
— Varmaankin kamelin jälkiä pitkin, vastasi Chamis.
— Ikävä juttu. Jokainen, joka näkee sen, muistaa meidän
karavaanimme ja näyttää, minne olemme ajaneet. Meidän täytyy
ehdottomasti päästä siitä.
— Mutta miten? kysyi Chamis.
— Onhan meillä pyssy. Ammu koira.
— Pyssy on, mutta minä en osaa ampua. Ehkä te osaatte?
Chamis olisi ehkä jotenkuten osannutkin, sillä olihan Stas
muutaman kerran ladannut ja ampunut hänen nähtensä, mutta hän
sääli koiraa, josta hän piti kovasti ja jota hän oli hoitanut jo ennen
lasten tuloa Medinetiin. Hän tiesi hyvin, että sudanilaiset eivät
osanneet käyttää uudenmallista pyssyä ja että koira tässä suhteessa
olisi turvassa.
— Jollette osaa ampua, sanoi Chamis viekkaasti hymyillen, — niin
ainoastaan tuo pieni "nusrani" (kristitty) voi tappaa koiran, mutta
tällä pyssyllä voi ampua yhtä mittaa useamman kerran ja minä en
ainakaan kehoita antamaan pyssyä hänen käsiinsä.
— Jumala varjelkoon! vastasi Idrys. — Hän ampuisi meidät kuin
parven lintuja.
— Meillä on veitset, huomautti Gebr.
— Koetahan, mutta muista, että sinulla on kurkku, jonka koira
puree poikki ennenkuin olet surmannut sen.
— Mitä on siis tehtävä?
— Ikävä juttu. Jokainen, joka näkee sen, muistaa meidän
karavaanimme ja näyttää, minne olemme ajaneet. Meidän täytyy
ehdottomasti päästä siitä.
— Mutta miten? kysyi Chamis.
— Onhan meillä pyssy. Ammu koira.
— Pyssy on, mutta minä en osaa ampua. Ehkä te osaatte?
Chamis olisi ehkä jotenkuten osannutkin, sillä olihan Stas
muutaman kerran ladannut ja ampunut hänen nähtensä, mutta hän
sääli koiraa, josta hän piti kovasti ja jota hän oli hoitanut jo ennen
lasten tuloa Medinetiin. Hän tiesi hyvin, että sudanilaiset eivät
osanneet käyttää uudenmallista pyssyä ja että koira tässä suhteessa
olisi turvassa.
— Jollette osaa ampua, sanoi Chamis viekkaasti hymyillen, — niin
ainoastaan tuo pieni "nusrani" (kristitty) voi tappaa koiran, mutta
tällä pyssyllä voi ampua yhtä mittaa useamman kerran ja minä en
ainakaan kehoita antamaan pyssyä hänen käsiinsä.
— Jumala varjelkoon! vastasi Idrys. — Hän ampuisi meidät kuin
parven lintuja.
— Meillä on veitset, huomautti Gebr.
— Koetahan, mutta muista, että sinulla on kurkku, jonka koira
puree poikki ennenkuin olet surmannut sen.
— Mitä on siis tehtävä?
Chamis kohautti olkapäitään.
— Miksi te oikeastaan tahdotte tappaa sen? Vaikka peittäisitte sen
raadon hiekkaan, löytää hyeena sen kuitenkin, takaa-ajajat löytävät
luut ja näkevät, ettemme ole soutaneet Niilin yli, vaan pakenemme
tätä tietä. Juoskoon se perässämme. Aina kun beduiinit ajavat vettä
noutamaan, me piilotamme sen lasten kanssa johonkin kuoppaan.
Heitä se ei jätä, olkaa huoletta. Allah! Oli hyvä, että se tuli nyt,
muuten se olisi johtanut ahdistajat meidät jäljillemme. Sitä pitää
tosin ruokkia, mutta jolleivät ruoanjätteet riitä, niin kyllä se löytää
sakaalin tai hyeenan. Jättäkää se rauhaan, älkääkä tuhlatko aikaa
keskusteluun.
— Ehkä olet oikeassa, arveli Idrys.
— Jos olen, annan sille vettäkin, jottei se menisi itse juomaan
Niilistä ja näyttäytymään kylissä.
Näin päätettiin Saban kohtalosta.
He ajoivat laajalle tasangolle, jonka hiekkaan tuuli oli uurtanut
vakoja. Erämaa oli ääretön. Taivas oli kuin simpukankuori. Idässä
liitivät pilvet opalinvärisinä, pian kullankeltaisiksi muuttuen. Näkyi
yksi säde, sitten toinen ja aurinko nousi, kuten aina etelässä,
yhtäkkiä pilvistä puhjeten ja kirkastaen taivaanrannan. Taivas ja maa
iloitsivat ja rannattomat hietikot avautuivat silmälle.
— Meidän täytyy rientää, Idrys sanoi, — muuten joku vielä
huomaa meidät kaukaa.
Levänneet ja juotetut kamelit kiitivät nopeasti kuin gasellit. Saba
jäi kauaksi jälkeen, mutta turhaa oli pelätä sen eksyvän, sillä
— Miksi te oikeastaan tahdotte tappaa sen? Vaikka peittäisitte sen
raadon hiekkaan, löytää hyeena sen kuitenkin, takaa-ajajat löytävät
luut ja näkevät, ettemme ole soutaneet Niilin yli, vaan pakenemme
tätä tietä. Juoskoon se perässämme. Aina kun beduiinit ajavat vettä
noutamaan, me piilotamme sen lasten kanssa johonkin kuoppaan.
Heitä se ei jätä, olkaa huoletta. Allah! Oli hyvä, että se tuli nyt,
muuten se olisi johtanut ahdistajat meidät jäljillemme. Sitä pitää
tosin ruokkia, mutta jolleivät ruoanjätteet riitä, niin kyllä se löytää
sakaalin tai hyeenan. Jättäkää se rauhaan, älkääkä tuhlatko aikaa
keskusteluun.
— Ehkä olet oikeassa, arveli Idrys.
— Jos olen, annan sille vettäkin, jottei se menisi itse juomaan
Niilistä ja näyttäytymään kylissä.
Näin päätettiin Saban kohtalosta.
He ajoivat laajalle tasangolle, jonka hiekkaan tuuli oli uurtanut
vakoja. Erämaa oli ääretön. Taivas oli kuin simpukankuori. Idässä
liitivät pilvet opalinvärisinä, pian kullankeltaisiksi muuttuen. Näkyi
yksi säde, sitten toinen ja aurinko nousi, kuten aina etelässä,
yhtäkkiä pilvistä puhjeten ja kirkastaen taivaanrannan. Taivas ja maa
iloitsivat ja rannattomat hietikot avautuivat silmälle.
— Meidän täytyy rientää, Idrys sanoi, — muuten joku vielä
huomaa meidät kaukaa.
Levänneet ja juotetut kamelit kiitivät nopeasti kuin gasellit. Saba
jäi kauaksi jälkeen, mutta turhaa oli pelätä sen eksyvän, sillä
seuraavassa levähdyspaikassa se saavuttaisi joukon varmasti.
Dromedaari, jolla Idrys ja Stas ajoivat, juoksi Nelin kamelin vieressä,
että lapset voisivat keskustella. Sudanilaisten tekemä sija osoittautui
erinomaiseksi, ja tyttö oli siinä todellakin kuin lintu pesässään. Hän
ei päässyt nukkuessaankaan putoamaan, ja matka rasitti häntä nyt
entistä vähemmän. Päivän valo rohkaisi lapsia. Stasin sydämen täytti
toivo, että jos kerran Saba voi saavuttaa heidät, täytyi takaa-
ajajainkin voida. Hän kertoi tästä Nelille, joka hymyili ensi kertaa sen
jälkeen kun sai tietää, että heidät oli ryöstetty.
— Koskahan he saavuttavat meidät? kysyi tyttö ranskaksi, jottei
Idrys ymmärtäisi.
— En tiedä. Ehkä tänään, ehkä huomenna, ehkä parin kolmen
päivän päästä.
— Mutta emmehän me aja takaisin kameleilla?
— Emme. Niilin rantaan vain kameleilla, mutta sitten Niiliä pitkin
El-Wastaan.
— Se on hyvä.
Nel parka, joka ennen niin mielellään ajoi kamelilla, oli nyt saanut
siitä kylläkseen.
Sillä välin beduiinit hoputtivat kameleja minkä jaksoivat, ja Stas
huomasi heidän suuntaavan kulkunsa syvemmälle erämaahan.
Horjuttaakseen Idryksen varmuutta paon onnistumisesta ja
näyttääkseen samalla olevansa varma siitä, että takaa-ajajat
saavuttavat heidät, Stas sanoi:
Dromedaari, jolla Idrys ja Stas ajoivat, juoksi Nelin kamelin vieressä,
että lapset voisivat keskustella. Sudanilaisten tekemä sija osoittautui
erinomaiseksi, ja tyttö oli siinä todellakin kuin lintu pesässään. Hän
ei päässyt nukkuessaankaan putoamaan, ja matka rasitti häntä nyt
entistä vähemmän. Päivän valo rohkaisi lapsia. Stasin sydämen täytti
toivo, että jos kerran Saba voi saavuttaa heidät, täytyi takaa-
ajajainkin voida. Hän kertoi tästä Nelille, joka hymyili ensi kertaa sen
jälkeen kun sai tietää, että heidät oli ryöstetty.
— Koskahan he saavuttavat meidät? kysyi tyttö ranskaksi, jottei
Idrys ymmärtäisi.
— En tiedä. Ehkä tänään, ehkä huomenna, ehkä parin kolmen
päivän päästä.
— Mutta emmehän me aja takaisin kameleilla?
— Emme. Niilin rantaan vain kameleilla, mutta sitten Niiliä pitkin
El-Wastaan.
— Se on hyvä.
Nel parka, joka ennen niin mielellään ajoi kamelilla, oli nyt saanut
siitä kylläkseen.
Sillä välin beduiinit hoputtivat kameleja minkä jaksoivat, ja Stas
huomasi heidän suuntaavan kulkunsa syvemmälle erämaahan.
Horjuttaakseen Idryksen varmuutta paon onnistumisesta ja
näyttääkseen samalla olevansa varma siitä, että takaa-ajajat
saavuttavat heidät, Stas sanoi:
— Eihän se auta teitä, että ajatte kauemmaksi Niilistä ja Bahr-
Jussefista, sillä teitä ei tulla etsimään Niilin rannoilta, vaan
erämaasta.
— Mistä sinä tiedät että me ajamme kauemmaksi Niilistä, kun et
voi nähdä virran rantoja? Idrys kysyi.
— Siitä, että aurinko, joka on idässä, paistaa nyt suoraan
selkäämme; se merkitsee, että olemme kääntyneet länteen.
— Sinä olet viisas poika, myönsi Idrys. Hetken kuluttua hän lisäsi:
— Mutta takaa-ajajat eivät saavuta meitä, etkä sinä pääse
pakenemaan.
Puoleen päivään asti he ajoivat pysähtymättä, mutta kun aurinko
alkoi paahtaa keskipäivän korkeudesta, peittyivät helteeseen
tottuneet kamelitkin hikeen ja hiljensivät vauhtiaan. Taaskin
ympäröivät kalliot ja kumpareet karavaania. Syvänteet, jotka
sateiden aikana muuttuivat joiksi eli "khoreiksi", harvenivat. Beduiinit
pysähtyivät vihdoin tällaiseen syvänteeseen, joka oli kallioiden
keskellä aivan näkymättömissä. He olivat laskeutumassa kamelien
selästä, kun he yhtäkkiä alkoivat parkua ja heitellä kiviä. Suuri
käärme oli luikerrellut esiin pensaista, joita kasvoi syvänteen
pohjalla. Salamannopeasti se syöksyi kallion koloon. Gebr juoksi
beduiinien avuksi veitsi kädessä. Mutta maa oli niin epätasaista, että
käärmeeseen oli vaikea osua kivellä tai iskeä sitä veitsellä, ja kaikki
kolme palasivat tyhjin toimin käärmejahdista. Tavanomaiset
huudahdukset kaikuivat:
— Allah! Bismillah! Mashallah! Sudanilaiset alkoivat katsella Stasia
omituisen uteliaina. Stas ei tiennyt, mitä nämä läpitunkevat
Jussefista, sillä teitä ei tulla etsimään Niilin rannoilta, vaan
erämaasta.
— Mistä sinä tiedät että me ajamme kauemmaksi Niilistä, kun et
voi nähdä virran rantoja? Idrys kysyi.
— Siitä, että aurinko, joka on idässä, paistaa nyt suoraan
selkäämme; se merkitsee, että olemme kääntyneet länteen.
— Sinä olet viisas poika, myönsi Idrys. Hetken kuluttua hän lisäsi:
— Mutta takaa-ajajat eivät saavuta meitä, etkä sinä pääse
pakenemaan.
Puoleen päivään asti he ajoivat pysähtymättä, mutta kun aurinko
alkoi paahtaa keskipäivän korkeudesta, peittyivät helteeseen
tottuneet kamelitkin hikeen ja hiljensivät vauhtiaan. Taaskin
ympäröivät kalliot ja kumpareet karavaania. Syvänteet, jotka
sateiden aikana muuttuivat joiksi eli "khoreiksi", harvenivat. Beduiinit
pysähtyivät vihdoin tällaiseen syvänteeseen, joka oli kallioiden
keskellä aivan näkymättömissä. He olivat laskeutumassa kamelien
selästä, kun he yhtäkkiä alkoivat parkua ja heitellä kiviä. Suuri
käärme oli luikerrellut esiin pensaista, joita kasvoi syvänteen
pohjalla. Salamannopeasti se syöksyi kallion koloon. Gebr juoksi
beduiinien avuksi veitsi kädessä. Mutta maa oli niin epätasaista, että
käärmeeseen oli vaikea osua kivellä tai iskeä sitä veitsellä, ja kaikki
kolme palasivat tyhjin toimin käärmejahdista. Tavanomaiset
huudahdukset kaikuivat:
— Allah! Bismillah! Mashallah! Sudanilaiset alkoivat katsella Stasia
omituisen uteliaina. Stas ei tiennyt, mitä nämä läpitunkevat
silmäykset tarkoittivat.
Nel kiipesi alas kamelin selästä, ja vaikkei hän ollutkaan nyt niin
rasittunut kuin yöllä, Stas levitti hänelle huovan varjoisaan, tasaiseen
paikkaan ja käski tytön lepuuttaa jalkojaan. Arabit kokoontuivat
aterialle; siihen kuului kuivaa leipää, taateleita ja kulaus vettä.
Heidän kasvoillaan oli huolestunut ilme. Ateria kului täydellisen
hiljaisuuden vallitessa. Kun se oli päättynyt, Idrys vei Stasin syrjään
ja kysyi salaperäisesti:
— Näitkö tuon käärmeen?
— Näin.
— Oletko sinä loihtinut sen luoksemme?
— En.
— Meitä kohtaa jokin onnettomuus, kun nuo hölmöt eivät saaneet
käärmettä tapetuksi.
— Teitä kohtaa hirsipuu.
— Vaiti! Onko sinun isäsi noita, tietäjä?
— On, vastasi Stas, joka nyt ymmärsi, että nämä taikauskoiset
ihmiset pitivät käärmettä pahana enteenä ja pelkäsivät joutuvansa
kiinni.
— Sinun isäsi on siis lähettänyt sen, Idrys vastasi, — mutta
muistakoon, että me kostamme sinulle hänen noitumisensa.
— Te ette voi tehdä minulle mitään, sillä Fatman pojat kostavat
teille jos loukkaatte minua.
Nel kiipesi alas kamelin selästä, ja vaikkei hän ollutkaan nyt niin
rasittunut kuin yöllä, Stas levitti hänelle huovan varjoisaan, tasaiseen
paikkaan ja käski tytön lepuuttaa jalkojaan. Arabit kokoontuivat
aterialle; siihen kuului kuivaa leipää, taateleita ja kulaus vettä.
Heidän kasvoillaan oli huolestunut ilme. Ateria kului täydellisen
hiljaisuuden vallitessa. Kun se oli päättynyt, Idrys vei Stasin syrjään
ja kysyi salaperäisesti:
— Näitkö tuon käärmeen?
— Näin.
— Oletko sinä loihtinut sen luoksemme?
— En.
— Meitä kohtaa jokin onnettomuus, kun nuo hölmöt eivät saaneet
käärmettä tapetuksi.
— Teitä kohtaa hirsipuu.
— Vaiti! Onko sinun isäsi noita, tietäjä?
— On, vastasi Stas, joka nyt ymmärsi, että nämä taikauskoiset
ihmiset pitivät käärmettä pahana enteenä ja pelkäsivät joutuvansa
kiinni.
— Sinun isäsi on siis lähettänyt sen, Idrys vastasi, — mutta
muistakoon, että me kostamme sinulle hänen noitumisensa.
— Te ette voi tehdä minulle mitään, sillä Fatman pojat kostavat
teille jos loukkaatte minua.
— Joko sinä senkin olet ymmärtänyt? Mutta muista, jollei minua
olisi ollut, niin sinä olisit vuodattanut veresi Gebrin ruoskan iskuista,
sinä ja pikku "bint".
— Sinua minä puolustan, mutta Gebr joutuu hirsipuuhun!
Vastaukseksi Idrys katsoi ihmeissään poikaan ja sanoi:
— Meidän henkemme ei vielä ole sinun käsissäsi, vaikka sinä
puhutkin kuin olisit herramme…
Mutta vähän ajan kuluttua hän lisäsi:
— Sinä olet ihmeellinen "uled" (poika); en ole sinunlaistasi vielä
nähnyt. Olen tähän saakka ollut teille hyvä, älä sinä siis uhkaat
meitä.
— Jumala rankaisee petoksesta, vastasi Stas. Saattoi huomata,
että pojan varma puhe yhdessä huonon enteen kanssa teki Idryksen
levottomaksi. Istuuduttuaan satulaan hän toisti vielä muutaman
kerran: "Olenhan minä ollut teille hyvä", ikään kuin painaakseen sen
pojan mieleen vastaisen varalle. Sitten hän rupesi rukoilemaan
siirrellen pähkinöistä tehtyjä rukousnauhan pallosia.
Kello kahden tienoissa iltapäivällä oli vielä paahtavan kuumaa,
vaikka olikin talvi. Taivaalla ei näkynyt ainoatakaan pilvenhattaraa,
mutta taivaanrannat rupesivat tummenemaan. Karavaanin
yläpuolella lenteli muutamia haukkoja, joiden levitetyt siivet heittivät
hietikolle mustia, vaappuvia varjoja. Kuumassa ilmassa tuntui
palaneen käryä. Yhä täyttä vauhtia juoksevat kamelit alkoivat korista
kummallisesti. Toinen beduiineista lähestyi Idrystä:
— Jotakin pahaa on tulossa, beduiini sanoi.
olisi ollut, niin sinä olisit vuodattanut veresi Gebrin ruoskan iskuista,
sinä ja pikku "bint".
— Sinua minä puolustan, mutta Gebr joutuu hirsipuuhun!
Vastaukseksi Idrys katsoi ihmeissään poikaan ja sanoi:
— Meidän henkemme ei vielä ole sinun käsissäsi, vaikka sinä
puhutkin kuin olisit herramme…
Mutta vähän ajan kuluttua hän lisäsi:
— Sinä olet ihmeellinen "uled" (poika); en ole sinunlaistasi vielä
nähnyt. Olen tähän saakka ollut teille hyvä, älä sinä siis uhkaat
meitä.
— Jumala rankaisee petoksesta, vastasi Stas. Saattoi huomata,
että pojan varma puhe yhdessä huonon enteen kanssa teki Idryksen
levottomaksi. Istuuduttuaan satulaan hän toisti vielä muutaman
kerran: "Olenhan minä ollut teille hyvä", ikään kuin painaakseen sen
pojan mieleen vastaisen varalle. Sitten hän rupesi rukoilemaan
siirrellen pähkinöistä tehtyjä rukousnauhan pallosia.
Kello kahden tienoissa iltapäivällä oli vielä paahtavan kuumaa,
vaikka olikin talvi. Taivaalla ei näkynyt ainoatakaan pilvenhattaraa,
mutta taivaanrannat rupesivat tummenemaan. Karavaanin
yläpuolella lenteli muutamia haukkoja, joiden levitetyt siivet heittivät
hietikolle mustia, vaappuvia varjoja. Kuumassa ilmassa tuntui
palaneen käryä. Yhä täyttä vauhtia juoksevat kamelit alkoivat korista
kummallisesti. Toinen beduiineista lähestyi Idrystä:
— Jotakin pahaa on tulossa, beduiini sanoi.
— Mitä?
— Pahat henget ovat herättäneet hietikoista läntisen tuulen, joka
nyt rientää meitä vastaan.
Idrys ojentautui satulassaan, loi katseensa etäisyyteen ja sanoi:
— Se on totta. Tuuli nousee lounaasta, mutta se ei ole yhtä paha
kuin kmasin, kevätmyrsky.
— Kolme vuotta sitten se hautasi Abu-Hamedin läheisyydessä
kokonaisen karavaanin ja puhalsi vasta viime talvena hiekan pois sen
päältä. Jalla! Myrsky voi olla niin voimakas, että se tukkii kamelien
sieraimet ja kuivattaa veden nahkaisista säkeistä.
— Meidän on kiiruhdettava, ettemme joutuisi suoraan myrskyn
keskelle.
— Olemme menossa suoraan sitä kohti, emmekä voi enää välttää
sitä.
— Mitä pikemmin se tulee, sitä pikemmin myös menee.
Idrys sivalsi kameliaan ruoskalla, ja toiset tekivät samoin. Jonkun
aikaa kuului vain jalla-huutoja ja ruoskan sivalluksia, jotka
paukkuivat kuin laukaukset. Lounainen taivaanranta tummui.
Kuumuus ei hellittänyt, vaan aurinko paahtoi jatkuvasti. Haukat
nousivat korkeuksiin, niiden siipien varjot muuttuivat heikoiksi ja
katosivat lopulta kokonaan.
Ilma oli tukahduttava.
— Pahat henget ovat herättäneet hietikoista läntisen tuulen, joka
nyt rientää meitä vastaan.
Idrys ojentautui satulassaan, loi katseensa etäisyyteen ja sanoi:
— Se on totta. Tuuli nousee lounaasta, mutta se ei ole yhtä paha
kuin kmasin, kevätmyrsky.
— Kolme vuotta sitten se hautasi Abu-Hamedin läheisyydessä
kokonaisen karavaanin ja puhalsi vasta viime talvena hiekan pois sen
päältä. Jalla! Myrsky voi olla niin voimakas, että se tukkii kamelien
sieraimet ja kuivattaa veden nahkaisista säkeistä.
— Meidän on kiiruhdettava, ettemme joutuisi suoraan myrskyn
keskelle.
— Olemme menossa suoraan sitä kohti, emmekä voi enää välttää
sitä.
— Mitä pikemmin se tulee, sitä pikemmin myös menee.
Idrys sivalsi kameliaan ruoskalla, ja toiset tekivät samoin. Jonkun
aikaa kuului vain jalla-huutoja ja ruoskan sivalluksia, jotka
paukkuivat kuin laukaukset. Lounainen taivaanranta tummui.
Kuumuus ei hellittänyt, vaan aurinko paahtoi jatkuvasti. Haukat
nousivat korkeuksiin, niiden siipien varjot muuttuivat heikoiksi ja
katosivat lopulta kokonaan.
Ilma oli tukahduttava.
Arabit olivat huutaneet kurkkunsa kuiviksi juhdilleen, sitten he
vaikenivat, eikä hiljaisuutta enää rikkonut muu kuin kamelien korina.
Kaksi pienikokoista kettua juoksi karavaanin ohi päinvastaiseen
suuntaan.
Sama beduiini, joka oli äsken puhellut Idryksen kanssa, sanoi
jälleen oudolla äänellä:
— Se ei ole mikään tavallinen tuuli. Pahat henget vainoavat meitä.
Se käärme on syypää kaikkeen…
— Tiedän, vastasi Idrys.
— Katso, ilma väreilee. Sellaista ei tapahdu talvella.
Hehkuvan kuuma ilma todella väreili, ja optisen näköharhan
johdosta myös hiekka näytti väreilevän. Beduiini riisui hiestä kostean
päähineensä ja sanoi:
— Erämaan sydän värisee tuskasta.
Yhtäkkiä kääntyi karavaanin kärjessä ajava beduiini ympäri ja alkoi
huutaa:
— Se lähestyy jo, se lähestyy!
Myrsky oli todellakin nousemassa. Kaukana näkyi kuin tumma
pilvi, joka kohosi ylemmäs ja läheni karavaania. Tuulenpuuskat
alkoivat tanssia joukon ympärillä, ja samassa tuulenpyörteet
rupesivat lennättämään hiekkaa; ne muodostivat suppiloita ikään
kuin joku olisi pyöritellyt valtavalla kepillä erämaan hiekkapintaa.
Paikoin kohosi pyöriviä patsaita, jotka olivat alhaalta kapeita ja
avautuivat ylöspäin. Tätä kesti vain hetken. Pilvi, jonka karavaanin
vaikenivat, eikä hiljaisuutta enää rikkonut muu kuin kamelien korina.
Kaksi pienikokoista kettua juoksi karavaanin ohi päinvastaiseen
suuntaan.
Sama beduiini, joka oli äsken puhellut Idryksen kanssa, sanoi
jälleen oudolla äänellä:
— Se ei ole mikään tavallinen tuuli. Pahat henget vainoavat meitä.
Se käärme on syypää kaikkeen…
— Tiedän, vastasi Idrys.
— Katso, ilma väreilee. Sellaista ei tapahdu talvella.
Hehkuvan kuuma ilma todella väreili, ja optisen näköharhan
johdosta myös hiekka näytti väreilevän. Beduiini riisui hiestä kostean
päähineensä ja sanoi:
— Erämaan sydän värisee tuskasta.
Yhtäkkiä kääntyi karavaanin kärjessä ajava beduiini ympäri ja alkoi
huutaa:
— Se lähestyy jo, se lähestyy!
Myrsky oli todellakin nousemassa. Kaukana näkyi kuin tumma
pilvi, joka kohosi ylemmäs ja läheni karavaania. Tuulenpuuskat
alkoivat tanssia joukon ympärillä, ja samassa tuulenpyörteet
rupesivat lennättämään hiekkaa; ne muodostivat suppiloita ikään
kuin joku olisi pyöritellyt valtavalla kepillä erämaan hiekkapintaa.
Paikoin kohosi pyöriviä patsaita, jotka olivat alhaalta kapeita ja
avautuivat ylöspäin. Tätä kesti vain hetken. Pilvi, jonka karavaanin
kärkimies oli ensimmäisenä havainnut, lähestyi huimaa vauhtia.
Tuntui kuin suuren linnun siipi olisi pyyhkäissyt ihmisten ja kamelien
yli. Tuossa tuokiossa olivat ajajien suut ja silmät täynnä pölyä.
Pölypilvet peittivät taivaan, ja tuli pimeä. Ihmiset katosivat näkyvistä,
ja lähimmät kamelit häämöttivät kuin sumun seasta. Ei suhina —
sillä erämaassa ei ole puita — vaan tuulen pauhina tukahdutti
matkamiesten huudot ja kamelien mylvinnän. Ilmassa tuntui
palaneen katkua. Kamelit pysähtyivät, kääntyivät selin tuuleen ja
ojensivat pitkät kaulansa niin alas, että sieraimet miltei koskettivat
maata.
Sudanilaiset, eivät kuitenkaan tahtoneet pysähtyä, sillä karavaanit,
jotka olivat sen tehneet, ovat usein hautautuneet hiekkaan. Yleensä
on paras ajaa tuulen mukana, mutta näin menetellen karavaani olisi
joutunut Fajumiin, josta he odottivat takaa-ajajia. Kun ensimmäiset
tuulenpuuskat olivat ohi, he lähtivät taas eteenpäin.
Seurasi lyhyt tyven, mutta punertava pimeys hälveni hitaasti, sillä
auringon säteet eivät pystyneet tunkeutumaan ilmassa leijuvan
hiekkapölyn läpi. Suuremmat ja raskaammat hiekkajyväset alkoivat
kuitenkin pudota alas. Ne täyttivät satuloiden kolot ja vaatteiden
poimut. Ihmiset ja eläimet vetivät joka henkäyksellä sisäänsä pölyä,
joka ärsytti keuhkoja ja narskui hampaissa. Mutta tuuli saattaisi
nousta uudelleen ja peittää heidät kokonaan. Stasin mieleen juolahti,
että jos hän pimeydessä voisi siirtyä Nelin kamelille, niin hän voisi
ajaa sillä myötätuuleen ja paeta pohjoista kohti. Ehkäpä miehet eivät
huomaisi sitä pimeyden keskellä, ja jos he kerran pääsisivät johonkin
Bahr-Jussefin lähistöllä olevaan kylään Niilin varrelle, niin he olisivat
pelastuneet. Idrys ja Gebr eivät varmasti uskaltaisi ajaa sinne saakka
peläten joutuvansa viranomaisten käsiin.
Tuntui kuin suuren linnun siipi olisi pyyhkäissyt ihmisten ja kamelien
yli. Tuossa tuokiossa olivat ajajien suut ja silmät täynnä pölyä.
Pölypilvet peittivät taivaan, ja tuli pimeä. Ihmiset katosivat näkyvistä,
ja lähimmät kamelit häämöttivät kuin sumun seasta. Ei suhina —
sillä erämaassa ei ole puita — vaan tuulen pauhina tukahdutti
matkamiesten huudot ja kamelien mylvinnän. Ilmassa tuntui
palaneen katkua. Kamelit pysähtyivät, kääntyivät selin tuuleen ja
ojensivat pitkät kaulansa niin alas, että sieraimet miltei koskettivat
maata.
Sudanilaiset, eivät kuitenkaan tahtoneet pysähtyä, sillä karavaanit,
jotka olivat sen tehneet, ovat usein hautautuneet hiekkaan. Yleensä
on paras ajaa tuulen mukana, mutta näin menetellen karavaani olisi
joutunut Fajumiin, josta he odottivat takaa-ajajia. Kun ensimmäiset
tuulenpuuskat olivat ohi, he lähtivät taas eteenpäin.
Seurasi lyhyt tyven, mutta punertava pimeys hälveni hitaasti, sillä
auringon säteet eivät pystyneet tunkeutumaan ilmassa leijuvan
hiekkapölyn läpi. Suuremmat ja raskaammat hiekkajyväset alkoivat
kuitenkin pudota alas. Ne täyttivät satuloiden kolot ja vaatteiden
poimut. Ihmiset ja eläimet vetivät joka henkäyksellä sisäänsä pölyä,
joka ärsytti keuhkoja ja narskui hampaissa. Mutta tuuli saattaisi
nousta uudelleen ja peittää heidät kokonaan. Stasin mieleen juolahti,
että jos hän pimeydessä voisi siirtyä Nelin kamelille, niin hän voisi
ajaa sillä myötätuuleen ja paeta pohjoista kohti. Ehkäpä miehet eivät
huomaisi sitä pimeyden keskellä, ja jos he kerran pääsisivät johonkin
Bahr-Jussefin lähistöllä olevaan kylään Niilin varrelle, niin he olisivat
pelastuneet. Idrys ja Gebr eivät varmasti uskaltaisi ajaa sinne saakka
peläten joutuvansa viranomaisten käsiin.
Stas tönäisi Idrystä olkapäähän sanoen:
— Anna minulle vettä.
Idrys antoi auliisti, koska vettä oli vielä runsaasti jäljellä ja kamelit
oli sitä paitsi juotettu edellisenä yönä. Sitä paitsi hän tiesi kokeneena
erämaan kulkijana, että myrskyä tavallisesti seurasi sade, joka
täyttää syvänteet vedellä.
Stasin oli todellakin jano, hän joi paljon ja antamatta vesileiliä
takaisin hän tönäisi Idrystä uudelleen ja sanoi:
— Pysäytä karavaani.
— Miksi? sudanilainen kysyi.
— Tahdon nousta pikku "bintin" kamelille ja antaa hänelle vettä.
— Dinahilla on enemmän vettä kuin minulla.
— Mutta hän on ahne ja on kai juonut sen loppuun. Sitä paitsi
teidän tekemässänne satulassa on varmaankin paljon hiekkaa. Dinah
ei tiedä, miten sen kanssa on meneteltävä.
Idrys sivalsi kamelia ruoskalla, ja he ajoivat hetken ääneti.
— Mikset vastaa? kysyi Stas.
— Ajattelen, että olisikohan parempi sitoa sinut satulaan vai sitoa
kätesi selän taa?
— Hulluttelet!
— En. Kyllä minä arvasin suunnitelmasi.
— Anna minulle vettä.
Idrys antoi auliisti, koska vettä oli vielä runsaasti jäljellä ja kamelit
oli sitä paitsi juotettu edellisenä yönä. Sitä paitsi hän tiesi kokeneena
erämaan kulkijana, että myrskyä tavallisesti seurasi sade, joka
täyttää syvänteet vedellä.
Stasin oli todellakin jano, hän joi paljon ja antamatta vesileiliä
takaisin hän tönäisi Idrystä uudelleen ja sanoi:
— Pysäytä karavaani.
— Miksi? sudanilainen kysyi.
— Tahdon nousta pikku "bintin" kamelille ja antaa hänelle vettä.
— Dinahilla on enemmän vettä kuin minulla.
— Mutta hän on ahne ja on kai juonut sen loppuun. Sitä paitsi
teidän tekemässänne satulassa on varmaankin paljon hiekkaa. Dinah
ei tiedä, miten sen kanssa on meneteltävä.
Idrys sivalsi kamelia ruoskalla, ja he ajoivat hetken ääneti.
— Mikset vastaa? kysyi Stas.
— Ajattelen, että olisikohan parempi sitoa sinut satulaan vai sitoa
kätesi selän taa?
— Hulluttelet!
— En. Kyllä minä arvasin suunnitelmasi.
— Mitäpä minä tekisin, kun takaa-ajajat näinkin saavat meidät
kiinni.
— Erämaa on Jumalan käsissä.
He vaikenivat. Karkeampi hiekka oli pudonnut maahan, mutta
ilmassa oli vielä hienoa, punertavaa hiekkaa, jonka läpi aurinko hohti
kuin kiiltävä kuparilevy. Saattoi kuitenkin nähdä jo kauemmaksi.
Karavaanin edessä levisi tasainen hietikko, jonka rannalla
teräväsilmäiset arabit huomasivat uuden pilven. Se oli edellistä
korkeampi ja siitä kohosi patsaita, jotka olivat yläpäästä hyvin
leveitä. Sieltä lähestyi hurja pyörremyrsky, joka pani arabien ja
beduiinien sydämet takomaan hurjasti. Idrys peitti korvansa käsillä ja
rupesi kumartelemaan lähestyvälle myrskylle. Hänen uskonsa yhteen
ainoaan Jumalaan ei näyttänyt estävän häntä kunnioittamasta ja
pelkäämästä muitakin jumalia, sillä Stas kuuli selvästi hänen
sanovan:
— Herra! Me olemme sinun lapsiasi, älä surmaa meitä!
Mutta herra syöksyi heidän ylitseen ja iski kameleihin niin
hirmuisella voimalla, että ne olivat tuupertua nurin. Eläimet
kokoontuivat lähelle toisiaan ja painoivat päänsä yhteen. Hiekka
nousi sakeana pilvenä ylös. Entistä synkempi pimeys peitti
karavaanin, ja tässä pimeydessä heidän ohitseen lensi
käsittämättömiä mustia esineitä, ikään kuin suuria kameleita. Pelko
valtasi arabit, jotka luulivat niitä hiekan alle hautautuneiden vainajien
sieluiksi. Huminan keskellä kuului kauheita huutoja, jotka olivat kuin
itkua tai naurua, joskus kuin avunhuutoja. Mutta ne olivat
ääniharhoja. Karavaania uhkasi paljon suurempi vaara. Sudanilaiset
tiesivät hyvin, että suuri pyörre voisi heittää heidät kaikki ilmaan ja
kiinni.
— Erämaa on Jumalan käsissä.
He vaikenivat. Karkeampi hiekka oli pudonnut maahan, mutta
ilmassa oli vielä hienoa, punertavaa hiekkaa, jonka läpi aurinko hohti
kuin kiiltävä kuparilevy. Saattoi kuitenkin nähdä jo kauemmaksi.
Karavaanin edessä levisi tasainen hietikko, jonka rannalla
teräväsilmäiset arabit huomasivat uuden pilven. Se oli edellistä
korkeampi ja siitä kohosi patsaita, jotka olivat yläpäästä hyvin
leveitä. Sieltä lähestyi hurja pyörremyrsky, joka pani arabien ja
beduiinien sydämet takomaan hurjasti. Idrys peitti korvansa käsillä ja
rupesi kumartelemaan lähestyvälle myrskylle. Hänen uskonsa yhteen
ainoaan Jumalaan ei näyttänyt estävän häntä kunnioittamasta ja
pelkäämästä muitakin jumalia, sillä Stas kuuli selvästi hänen
sanovan:
— Herra! Me olemme sinun lapsiasi, älä surmaa meitä!
Mutta herra syöksyi heidän ylitseen ja iski kameleihin niin
hirmuisella voimalla, että ne olivat tuupertua nurin. Eläimet
kokoontuivat lähelle toisiaan ja painoivat päänsä yhteen. Hiekka
nousi sakeana pilvenä ylös. Entistä synkempi pimeys peitti
karavaanin, ja tässä pimeydessä heidän ohitseen lensi
käsittämättömiä mustia esineitä, ikään kuin suuria kameleita. Pelko
valtasi arabit, jotka luulivat niitä hiekan alle hautautuneiden vainajien
sieluiksi. Huminan keskellä kuului kauheita huutoja, jotka olivat kuin
itkua tai naurua, joskus kuin avunhuutoja. Mutta ne olivat
ääniharhoja. Karavaania uhkasi paljon suurempi vaara. Sudanilaiset
tiesivät hyvin, että suuri pyörre voisi heittää heidät kaikki ilmaan ja
viskellä hietikolle. Sinne he hautautuisivat, kunnes seuraava
pyörremyrsky joskus puhaltaisi hiekan heidän jäännöstensä yltä.
Stasia pyörrytti, hengitystä ahdisti ja silmät sokaistuivat hiekasta.
Hän oli joskus kuulevinaan Nelin itkua ja ajatteli sen tähden vain
tyttöä. Käyttäen hyväkseen sitä, että kamelit seisoivat pienessä
rykelmässä ja että Idrys ei voinut nähdä häntä, hän päätti kiivetä
hiljaa Nelin kamelille, mutta ei paetakseen vaan auttaakseen ja
rohkaistakseen tyttöä. Tuskin hän oli kohottanut jalkojaan ja
ojentanut kätensä Nelin satulaa kohti, kun suuri käsi sieppasi
hänestä kiinni. Sudanilainen nosti hänet ilmaan kuin höyhenen,
asetti eteensä ja sitoi palmuköydellä hänen kätensä ja sitten koko
pojan satulaan kiinni. Stas puri hammasta ja koetti vastustaa, mutta
turhaan. Kurkku kuivana ja suu hiekkaa täynnä hän ei voinut eikä
halunnut vakuuttaa Idrykselle, että oli aikonut auttaa tyttöä, eikä
paeta. Mutta kun hän hetken kuluttua luuli tukehtuvansa, hän alkoi
huutaa:
— Pelastakaa pikku "bint"!… Pelastakaa pikku "bint"!…
Mutta arabit pitivät omaa henkeään tärkeämpänä. Tuuli oli niin
tuima, että he eivät pysyneet satuloissaan, eivätkä kamelit voineet
seistä samalla paikalla. Beduiinit, Chamis ja Gebr hyppäsivät maahan
pitääkseen kameleja suitsista kiinni. Idrys päästi Stasin takapaikalle
ja teki samoin. Eläimet levittivät jalkansa seistäkseen lujemmin
tuulta vastaan, mutta niitten voimat eivät riittäneet, ja karavaani
alkoi hienon kivisateen piiskaamana ja tuulen työntämänä kiertyä
ympäri. Näin kului tunti, toinen… Asema kävi yhä vaarallisemmaksi.
Idrys käsitti, että ainoa pelastuskeino oli nousta kamelien selkään ja
ajaa myötätuuleen. Mutta niin he joutuisivat Fajumiin, jossa heitä
odottaisi egyptiläinen tuomioistuin ja hirsipuu.
pyörremyrsky joskus puhaltaisi hiekan heidän jäännöstensä yltä.
Stasia pyörrytti, hengitystä ahdisti ja silmät sokaistuivat hiekasta.
Hän oli joskus kuulevinaan Nelin itkua ja ajatteli sen tähden vain
tyttöä. Käyttäen hyväkseen sitä, että kamelit seisoivat pienessä
rykelmässä ja että Idrys ei voinut nähdä häntä, hän päätti kiivetä
hiljaa Nelin kamelille, mutta ei paetakseen vaan auttaakseen ja
rohkaistakseen tyttöä. Tuskin hän oli kohottanut jalkojaan ja
ojentanut kätensä Nelin satulaa kohti, kun suuri käsi sieppasi
hänestä kiinni. Sudanilainen nosti hänet ilmaan kuin höyhenen,
asetti eteensä ja sitoi palmuköydellä hänen kätensä ja sitten koko
pojan satulaan kiinni. Stas puri hammasta ja koetti vastustaa, mutta
turhaan. Kurkku kuivana ja suu hiekkaa täynnä hän ei voinut eikä
halunnut vakuuttaa Idrykselle, että oli aikonut auttaa tyttöä, eikä
paeta. Mutta kun hän hetken kuluttua luuli tukehtuvansa, hän alkoi
huutaa:
— Pelastakaa pikku "bint"!… Pelastakaa pikku "bint"!…
Mutta arabit pitivät omaa henkeään tärkeämpänä. Tuuli oli niin
tuima, että he eivät pysyneet satuloissaan, eivätkä kamelit voineet
seistä samalla paikalla. Beduiinit, Chamis ja Gebr hyppäsivät maahan
pitääkseen kameleja suitsista kiinni. Idrys päästi Stasin takapaikalle
ja teki samoin. Eläimet levittivät jalkansa seistäkseen lujemmin
tuulta vastaan, mutta niitten voimat eivät riittäneet, ja karavaani
alkoi hienon kivisateen piiskaamana ja tuulen työntämänä kiertyä
ympäri. Näin kului tunti, toinen… Asema kävi yhä vaarallisemmaksi.
Idrys käsitti, että ainoa pelastuskeino oli nousta kamelien selkään ja
ajaa myötätuuleen. Mutta niin he joutuisivat Fajumiin, jossa heitä
odottaisi egyptiläinen tuomioistuin ja hirsipuu.
— Surkeata! Idrys ajatteli. — Mutta myrsky pidättää myös takaa-
ajajia, ja kun tyyntyy, ajamme taas etelää kohti.
Hän huusi, että kaikki istuisivat kameleille.
Samassa tapahtui jotakin, mikä muutti tilanteen täysin.
Tummat, melkein mustat hiekkapilvet alkoivat sinertää. Pimeys
kasvoi, ja samassa jyrähti korkeudessa nukkunut, tuulen herättämä
ukkonen. Se alkoi mahtavana, uhkaavana, vihaisena kulkea Arabian
ja Libyan erämaiden väliä. Kuului ryske kuin vuoria ja kallioita olisi
sortunut taivaasta alas. Ukkosen jyrinä kasvoi kasvamistaan,
vapisutti maailmaa, juoksi pitkin taivaanrantoja, salama iski joskus
sellaisella voimalla, että taivaankansi tuntui romahtavan maahan;
sitten se taas vyöryi kolkosti jyristen, kohosi, häikäisi salamalla,
ärsytti jyrinällä, heikkeni, kasvoi…
Tuuli tyyntyi kuin omaa voimaansa ihmetellen, ja jossakin
äärettömän kaukana taivaan portit menivät ryskyen kiinni. Seurasi
kuolonhiljaisuus.
Sitten kuului tässä syvässä hiljaisuudessa johtajan ääni:
— Jumala on vihurin ja myrskyn herra! Olemme pelastuneet!
He lähtivät liikkeelle. Mutta ympäröivä yö oli niin pimeä, ettei
kameleja voinut erottaa, vaikka he ajoivat lähellä toisiaan. Sen
tähden miesten täytyi koko ajan puhua äänekkäästi, jotteivät eksyisi
toisistaan. Aika ajoin kirkkaat, siniset ja punaiset salamat sinkoilivat
erämaan avaruudessa, mutta sitten tuli taas niin mustaa, että
pimeys tuntui aivan käsin kosketeltavalta. Vaikka etummaisena
ajavan beduiinin ääni koko ajan rohkaisi toisia, he olivat edelleen
ajajia, ja kun tyyntyy, ajamme taas etelää kohti.
Hän huusi, että kaikki istuisivat kameleille.
Samassa tapahtui jotakin, mikä muutti tilanteen täysin.
Tummat, melkein mustat hiekkapilvet alkoivat sinertää. Pimeys
kasvoi, ja samassa jyrähti korkeudessa nukkunut, tuulen herättämä
ukkonen. Se alkoi mahtavana, uhkaavana, vihaisena kulkea Arabian
ja Libyan erämaiden väliä. Kuului ryske kuin vuoria ja kallioita olisi
sortunut taivaasta alas. Ukkosen jyrinä kasvoi kasvamistaan,
vapisutti maailmaa, juoksi pitkin taivaanrantoja, salama iski joskus
sellaisella voimalla, että taivaankansi tuntui romahtavan maahan;
sitten se taas vyöryi kolkosti jyristen, kohosi, häikäisi salamalla,
ärsytti jyrinällä, heikkeni, kasvoi…
Tuuli tyyntyi kuin omaa voimaansa ihmetellen, ja jossakin
äärettömän kaukana taivaan portit menivät ryskyen kiinni. Seurasi
kuolonhiljaisuus.
Sitten kuului tässä syvässä hiljaisuudessa johtajan ääni:
— Jumala on vihurin ja myrskyn herra! Olemme pelastuneet!
He lähtivät liikkeelle. Mutta ympäröivä yö oli niin pimeä, ettei
kameleja voinut erottaa, vaikka he ajoivat lähellä toisiaan. Sen
tähden miesten täytyi koko ajan puhua äänekkäästi, jotteivät eksyisi
toisistaan. Aika ajoin kirkkaat, siniset ja punaiset salamat sinkoilivat
erämaan avaruudessa, mutta sitten tuli taas niin mustaa, että
pimeys tuntui aivan käsin kosketeltavalta. Vaikka etummaisena
ajavan beduiinin ääni koko ajan rohkaisi toisia, he olivat edelleen
levottomia, sillä he ajoivat umpimähkään tietämättä minne päin
kulkivat. Kamelit kompastelivat vähän väliä eivätkä pystyneet
juoksemaan nopeammin. Ne hengittivät niin omituisen äänekkäästi,
että koko erämaa tuntui huohottavan levottomasti. Vihdoin alkoivat
suuret sadepisarat putoilla, ja samassa kajahti etumaisena ajavan
ääni pimeydessä:
— Kohr!…
He olivat syvänteen reunalla. Kamelit pysähtyivät ja alkoivat sitten
varovasti laskeutua.
9
Syvänne oli leveä. Sen pohjalla oli paljon kiviä, joitten välissä
kasvoi matalia, okaisia pensaita. Syvänteen eteläisen seinän
muodostivat korkeat kalliot, jotka olivat täynnä halkeamia ja koloja.
Arabit tarkastelivat kalliota hiljaisen, mutta yhä tihenevän
salamoinnin valossa. Pian he sattuivatkin löytämään
matalanpuoleisen, mutta leveän, luolamaisen syvennyksen, johon he
voisivat helposti sijoittua rankkasateen tullessa. Kamelit vietiin
pienelle kunnaalle luolan edustalle. Beduiinit ja molemmat
vanhemmat sudanilaiset riisuivat kameleilta valjaat ja taakat, jotta
ne voisivat paremmin levätä, mutta Chamis valmisteli sillä aikaa
nuotiota okaisista pensaista. Koko ajan putoili harvakseltaan suuria
sadepisaroita, mutta vasta sitten, kun he jo olivat levolla, alkoi sataa
niin rankasti, että vesi valui virtoina maahan. Sellaiset sateet, joita
sattuu vain kerran muutamaan vuoteen, nostavat veden talvellakin
kanavissa ja Niilissä, ja Adenissa ne täyttävät suuret vesisäiliöt, joita
kulkivat. Kamelit kompastelivat vähän väliä eivätkä pystyneet
juoksemaan nopeammin. Ne hengittivät niin omituisen äänekkäästi,
että koko erämaa tuntui huohottavan levottomasti. Vihdoin alkoivat
suuret sadepisarat putoilla, ja samassa kajahti etumaisena ajavan
ääni pimeydessä:
— Kohr!…
He olivat syvänteen reunalla. Kamelit pysähtyivät ja alkoivat sitten
varovasti laskeutua.
9
Syvänne oli leveä. Sen pohjalla oli paljon kiviä, joitten välissä
kasvoi matalia, okaisia pensaita. Syvänteen eteläisen seinän
muodostivat korkeat kalliot, jotka olivat täynnä halkeamia ja koloja.
Arabit tarkastelivat kalliota hiljaisen, mutta yhä tihenevän
salamoinnin valossa. Pian he sattuivatkin löytämään
matalanpuoleisen, mutta leveän, luolamaisen syvennyksen, johon he
voisivat helposti sijoittua rankkasateen tullessa. Kamelit vietiin
pienelle kunnaalle luolan edustalle. Beduiinit ja molemmat
vanhemmat sudanilaiset riisuivat kameleilta valjaat ja taakat, jotta
ne voisivat paremmin levätä, mutta Chamis valmisteli sillä aikaa
nuotiota okaisista pensaista. Koko ajan putoili harvakseltaan suuria
sadepisaroita, mutta vasta sitten, kun he jo olivat levolla, alkoi sataa
niin rankasti, että vesi valui virtoina maahan. Sellaiset sateet, joita
sattuu vain kerran muutamaan vuoteen, nostavat veden talvellakin
kanavissa ja Niilissä, ja Adenissa ne täyttävät suuret vesisäiliöt, joita
ilman kaupunki ei voisi tulla toimeen. Stas ei ollut ikinä nähnyt
sellaista. Vesi alkoi virrata solisten pitkin syvänteen pohjaa. Arabit
vilkaisivat tuon tuostakin ulos nähdäkseen, uhkasiko mikään vaara
eläimiä. Ihmisten oli mukava istua luolassa suojassa sateelta kuivien,
kirkkaasti palavain risujen valossa. Kaikki näyttivät iloisilta. Idrys oli
heti heidän tultuaan irrottanut Stasin kädet, jotta tämä voisi syödä.
Hän kääntyi hymyillen pojan puoleen ja virkkoi:
— Mahdi on suurempi kaikkia valkoisia noitia. Hän asetti
hirmumyrskyn ja lähetti sateen.
Stas ei vastannut mitään, sillä hän hoiteli Neliä, joka oli
menehtymäisillään. Hän ravisti hiekan tytön hiuksista, kastoi
pyyhinliinan veteen ja pyyhki hänen kasvonsa ja silmänsä. Dinah ei
olisi voinut tehdä sitä, sillä myrskyn aikana oli hänen ainoa silmänsä
tullut melkein sokeaksi. Nel antoi Stasin tehdä, mitä tämä tahtoi,
katsoi kuin väsynyt lintu häneen ja vasta sitten, kun Stas oli riisunut
hänen kenkänsä, pudistanut niistä hiekan ja levittänyt hänelle
huopapeitteen makuusijaksi, Nel kiersi pienet kätensä pojan kaulaan.
Stasin sydämen täytti sääli. Hän tunsi olevansa tytön holhooja,
vanhempi veli, ainoa puolustaja tällä hetkellä. Hän tunsi
rakastavansa tätä pientä sisarta, rakastavansa paljon enemmän kuin
koskaan ennen. Olihan hän rakastanut Neliä jo Port Saidissa, mutta
pitänyt myöskin "pienokaisena", ja sentähden Stasin mieleen ei ollut
koskaan juolahtanut suudella tyttöä edes kädelle sanoessaan hänelle
hyvää yötä. Mutta nyt oli yhteinen onnettomuus herättänyt hänessä
uinuvan tunteen, ja hän suuteli tytön pieniä kätösiä.
Mentyään levolle Stas ajatteli Neliä ja päätti tehdä kaikkensa
vapauttaakseen hänet vankeudesta. Poika oli valmis kaikkeen,
vieläpä haavoihin ja kuolemaan, mutta sillä pienellä, salaisella
sellaista. Vesi alkoi virrata solisten pitkin syvänteen pohjaa. Arabit
vilkaisivat tuon tuostakin ulos nähdäkseen, uhkasiko mikään vaara
eläimiä. Ihmisten oli mukava istua luolassa suojassa sateelta kuivien,
kirkkaasti palavain risujen valossa. Kaikki näyttivät iloisilta. Idrys oli
heti heidän tultuaan irrottanut Stasin kädet, jotta tämä voisi syödä.
Hän kääntyi hymyillen pojan puoleen ja virkkoi:
— Mahdi on suurempi kaikkia valkoisia noitia. Hän asetti
hirmumyrskyn ja lähetti sateen.
Stas ei vastannut mitään, sillä hän hoiteli Neliä, joka oli
menehtymäisillään. Hän ravisti hiekan tytön hiuksista, kastoi
pyyhinliinan veteen ja pyyhki hänen kasvonsa ja silmänsä. Dinah ei
olisi voinut tehdä sitä, sillä myrskyn aikana oli hänen ainoa silmänsä
tullut melkein sokeaksi. Nel antoi Stasin tehdä, mitä tämä tahtoi,
katsoi kuin väsynyt lintu häneen ja vasta sitten, kun Stas oli riisunut
hänen kenkänsä, pudistanut niistä hiekan ja levittänyt hänelle
huopapeitteen makuusijaksi, Nel kiersi pienet kätensä pojan kaulaan.
Stasin sydämen täytti sääli. Hän tunsi olevansa tytön holhooja,
vanhempi veli, ainoa puolustaja tällä hetkellä. Hän tunsi
rakastavansa tätä pientä sisarta, rakastavansa paljon enemmän kuin
koskaan ennen. Olihan hän rakastanut Neliä jo Port Saidissa, mutta
pitänyt myöskin "pienokaisena", ja sentähden Stasin mieleen ei ollut
koskaan juolahtanut suudella tyttöä edes kädelle sanoessaan hänelle
hyvää yötä. Mutta nyt oli yhteinen onnettomuus herättänyt hänessä
uinuvan tunteen, ja hän suuteli tytön pieniä kätösiä.
Mentyään levolle Stas ajatteli Neliä ja päätti tehdä kaikkensa
vapauttaakseen hänet vankeudesta. Poika oli valmis kaikkeen,
vieläpä haavoihin ja kuolemaan, mutta sillä pienellä, salaisella
ehdolla, etteivät haavat kirvelisi kovasti ja ettei kuolemakaan olisi
aivan todellinen, sillä muussa tapauksessa hän ei saisi nähdä
vapautetun Nelin iloa. Sitten hän alkoi miettiä sankarillisia
pelastuskeinoja, mutta ajatukset alkoivat hämmentyä, eikä kestänyt
kauan ennen kuin hän näki suurten hiekkapilvien putoavan
päälleen… näki kamelien ryömivän päänsä sisään — ja nukahti.
Varustettuaan kamelit yökuntoon arabit vaipuivat pian sikeään
uneen, sillä he olivat väsyneet kamppailussa myrskyä vastaan.
Nuotio sammui, luola pimeni. Kuului nukkuvain kuorsauksia ja veden
kohinaa ulkoa. Näin kului yö.
Aamun lähetessä Stas heräsi viluun. Hänestä tuntui, että
kalliokuoppiin kokoontunut vesi tippui halkeamista hänen päälleen.
Poika nousi istumaan, taisteli unta vastaan eikä voinut käsittää,
missä hän oli ja mitä hänelle oli tapahtunut.
Vähitellen hän tuli tajuihinsa.
— Ahaa! hän ajatteli. — Eilen oli rajumyrsky ja me olemme nyt
luolassa sadetta paossa.
Hän katseli ympärilleen. Ensiksi hän huomasi ihmeekseen, että
sade oli ohi ja ettei luola ollutkaan pimeä, sillä sitä valaisi
laskeutumassa oleva kuu. Sen kalpeiden säteitten valossa saattoi
nähdä matalan, mutta leveän luolan koko sisustan. Stas näki selvästi
vieressään nukkuvat arabit ja luolan vastakkaisella puolella Dinahin
vieressä nukkuvan Nelin valkoiset vaatteet. Hän tunsi taaskin syvää
myötätuntoa tyttöä kohtaan.
— Nel nukkuu… Nel nukkuu, hän kuiskasi itsekseen, — mutta
minä en nuku ja… minun täytyy pelastaa hänet.
aivan todellinen, sillä muussa tapauksessa hän ei saisi nähdä
vapautetun Nelin iloa. Sitten hän alkoi miettiä sankarillisia
pelastuskeinoja, mutta ajatukset alkoivat hämmentyä, eikä kestänyt
kauan ennen kuin hän näki suurten hiekkapilvien putoavan
päälleen… näki kamelien ryömivän päänsä sisään — ja nukahti.
Varustettuaan kamelit yökuntoon arabit vaipuivat pian sikeään
uneen, sillä he olivat väsyneet kamppailussa myrskyä vastaan.
Nuotio sammui, luola pimeni. Kuului nukkuvain kuorsauksia ja veden
kohinaa ulkoa. Näin kului yö.
Aamun lähetessä Stas heräsi viluun. Hänestä tuntui, että
kalliokuoppiin kokoontunut vesi tippui halkeamista hänen päälleen.
Poika nousi istumaan, taisteli unta vastaan eikä voinut käsittää,
missä hän oli ja mitä hänelle oli tapahtunut.
Vähitellen hän tuli tajuihinsa.
— Ahaa! hän ajatteli. — Eilen oli rajumyrsky ja me olemme nyt
luolassa sadetta paossa.
Hän katseli ympärilleen. Ensiksi hän huomasi ihmeekseen, että
sade oli ohi ja ettei luola ollutkaan pimeä, sillä sitä valaisi
laskeutumassa oleva kuu. Sen kalpeiden säteitten valossa saattoi
nähdä matalan, mutta leveän luolan koko sisustan. Stas näki selvästi
vieressään nukkuvat arabit ja luolan vastakkaisella puolella Dinahin
vieressä nukkuvan Nelin valkoiset vaatteet. Hän tunsi taaskin syvää
myötätuntoa tyttöä kohtaan.
— Nel nukkuu… Nel nukkuu, hän kuiskasi itsekseen, — mutta
minä en nuku ja… minun täytyy pelastaa hänet.
Katseltuaan arabeja tarkemmin hän ajatteli:
— Oh, tahtoisinpa kaikki nuo roistot…
Hän hätkähti. Hänen katseensa osui nahkakoteloon, jossa hänen
joululahjaksi saamansa pyssy oli, ja patruunalaukkuun, joka oli
hänen ja Chamiksen välissä käden ulottuvilla.
Hänen sydämensä alkoi tykyttää kiivaasti. Jospa hän saisi käsiinsä
pyssyn ja patruunat, niin hän olisi tilanteen herra. Hänen tarvitsisi
vain hiipiä hiljaa luolasta ulos, piiloutua kallionkielekkeitten väliin ja
odottaa, kunnes he tulisivat ulos.
— Kun sudanilaiset ja beduiinit heräävät, hän ajatteli, — ja
huomaavat minun olevan poissa, niin he rientävät kaikki luolasta
ulos, mutta silloin minä kahdella laukauksella kaadan kaksi
ensimmäistä, ja ennen kuin toiset ovat ehtineet juosta luokseni, on
pyssy taas ladattu. Jäljelle jää vain Chamis, mutta hänen kanssaan
tulen kyllä toimeen…
Hän näki mielikuvituksessaan neljä veristä ruumista. Hänen
rintansa täyttyi pelosta ja kauhusta. Murhata neljä ihmistä! Hän
muisti nähneensä kerran Port Saidissa työmiehen, jonka
höyryruoppaajan rautalapio oli surmannut. Kuinka hirveältä verinen
ruumis oli näyttänyt. Hän värisi pelkästä muistosta. Ja nyt niitä olisi
neljä!… Synti ja kauhistus!… Ei, ei, sitä en ikinä voisi tehdä.
Hän alkoi kamppailla omia ajatuksiaan vastaan. Itsensä tähden
hän ei sitä tekisi… Mutta tässä on kysymys Nelistä, tytön
puolustamisesta, pelastumisesta ja elämästä, sillä hän ei voi kestää
tätä, vaan kuolee jo matkalla tai villien dervishilaumain keskuudessa.
— Oh, tahtoisinpa kaikki nuo roistot…
Hän hätkähti. Hänen katseensa osui nahkakoteloon, jossa hänen
joululahjaksi saamansa pyssy oli, ja patruunalaukkuun, joka oli
hänen ja Chamiksen välissä käden ulottuvilla.
Hänen sydämensä alkoi tykyttää kiivaasti. Jospa hän saisi käsiinsä
pyssyn ja patruunat, niin hän olisi tilanteen herra. Hänen tarvitsisi
vain hiipiä hiljaa luolasta ulos, piiloutua kallionkielekkeitten väliin ja
odottaa, kunnes he tulisivat ulos.
— Kun sudanilaiset ja beduiinit heräävät, hän ajatteli, — ja
huomaavat minun olevan poissa, niin he rientävät kaikki luolasta
ulos, mutta silloin minä kahdella laukauksella kaadan kaksi
ensimmäistä, ja ennen kuin toiset ovat ehtineet juosta luokseni, on
pyssy taas ladattu. Jäljelle jää vain Chamis, mutta hänen kanssaan
tulen kyllä toimeen…
Hän näki mielikuvituksessaan neljä veristä ruumista. Hänen
rintansa täyttyi pelosta ja kauhusta. Murhata neljä ihmistä! Hän
muisti nähneensä kerran Port Saidissa työmiehen, jonka
höyryruoppaajan rautalapio oli surmannut. Kuinka hirveältä verinen
ruumis oli näyttänyt. Hän värisi pelkästä muistosta. Ja nyt niitä olisi
neljä!… Synti ja kauhistus!… Ei, ei, sitä en ikinä voisi tehdä.
Hän alkoi kamppailla omia ajatuksiaan vastaan. Itsensä tähden
hän ei sitä tekisi… Mutta tässä on kysymys Nelistä, tytön
puolustamisesta, pelastumisesta ja elämästä, sillä hän ei voi kestää
tätä, vaan kuolee jo matkalla tai villien dervishilaumain keskuudessa.
Mitä merkitsee tuollaisten roistojen veri Nelin elämän rinnalla?
Saattaako tällaisissa tapauksissa epäillä?
— Nelin tähden! Nelin tähden!…
Mutta yhtäkkiä Stasin mieleen juolahti kauhistuttava ajatus. Miten
käy, jos joku noista roistoista kohottaa veitsensä Nelin rintaa kohti ja
sanoo tappavansa tytön, jos hän, Stas, ei antaudu eikä anna pyssyä
pois? Miten silloin käy?
— Silloin, vastasi poika omaan kysymykseensä, — me heti
antaudumme.
Tuntien heikkoutensa hän heittäytyi takaisin makuusijalleen.
Kuu katsoi nyt vain silloin tällöin luolaan, jossa tuli pimeämpi.
Arabit kuorsasivat taukoamatta. Stas makasi vähän aikaa hiljaa,
kunnes uusi ajatus heräsi hänen mielessään.
Entä jos hän ei ampuisikaan ihmisiä, vaan kamelit? Onhan sääli
viattomia eläimiä, mutta mikä auttoi? Jos hänen onnistuisi tappaa
neljä tai viisi kamelia, olisi mahdotonta jatkaa matkaa. Kukaan
miehistä ei uskaltaisi ajaa rantakyliin ostamaan kameleja. Silloin Stas
isien puolesta lupaisi, että heitä ei rangaistaisi, vaan että he saisivat
rahaa… eikä auttaisi muu kuin palata.
Niin. Entä jos he eivät anna aikaa tehdä lupauksia, vaan
raivoissaan tappavat hänet heti.
Mutta heidän täytyisi kuunnella, sillä ladattu pyssy kädessä hän
voisi pitää heidät loitolla, kunnes oli sanonut kaikki. Kun hän niin
tekee, he käsittävät, että ainoa pelastuskeino on antautuminen.
Sitten hän asettuu karavaanin etupäähän ja johtaa sen suoraa päätä
Saattaako tällaisissa tapauksissa epäillä?
— Nelin tähden! Nelin tähden!…
Mutta yhtäkkiä Stasin mieleen juolahti kauhistuttava ajatus. Miten
käy, jos joku noista roistoista kohottaa veitsensä Nelin rintaa kohti ja
sanoo tappavansa tytön, jos hän, Stas, ei antaudu eikä anna pyssyä
pois? Miten silloin käy?
— Silloin, vastasi poika omaan kysymykseensä, — me heti
antaudumme.
Tuntien heikkoutensa hän heittäytyi takaisin makuusijalleen.
Kuu katsoi nyt vain silloin tällöin luolaan, jossa tuli pimeämpi.
Arabit kuorsasivat taukoamatta. Stas makasi vähän aikaa hiljaa,
kunnes uusi ajatus heräsi hänen mielessään.
Entä jos hän ei ampuisikaan ihmisiä, vaan kamelit? Onhan sääli
viattomia eläimiä, mutta mikä auttoi? Jos hänen onnistuisi tappaa
neljä tai viisi kamelia, olisi mahdotonta jatkaa matkaa. Kukaan
miehistä ei uskaltaisi ajaa rantakyliin ostamaan kameleja. Silloin Stas
isien puolesta lupaisi, että heitä ei rangaistaisi, vaan että he saisivat
rahaa… eikä auttaisi muu kuin palata.
Niin. Entä jos he eivät anna aikaa tehdä lupauksia, vaan
raivoissaan tappavat hänet heti.
Mutta heidän täytyisi kuunnella, sillä ladattu pyssy kädessä hän
voisi pitää heidät loitolla, kunnes oli sanonut kaikki. Kun hän niin
tekee, he käsittävät, että ainoa pelastuskeino on antautuminen.
Sitten hän asettuu karavaanin etupäähän ja johtaa sen suoraa päätä
Bahr-Jussefiin ja Niilin rannalle. On totta, että he paraikaa ovat
näistä paikoista parin päivän matkan päässä, koska arabit
varovaisuuden vuoksi olivat ajaneet syvälle sisämaahan. Mutta se ei
haittaisi, sillä jäisihän muutamia kameleja jäljelle, ja yhdellä niistä
saisi Nel ajaa. Stas alkoi tarkastella arabeja. He näyttivät nukkuvan
sikeästi. Mutta koska yö oli loppumaisillaan, he voisivat kohdakkoin
herätä. Täytyi siis toimia vitkastelematta. Patruunalaukun saattoi
ottaa helposti, sillä se oli melkein vieressä. Toisin oli pyssyn laita;
Chamis oli näet pannut sen viereensä. Stas toivoi voivansa anastaa
sen, mutta päätti ottaa sen ulos kotelostaan ja liittää piipun tukkiin
vasta ulkona muutaman askelen päässä luolasta, sillä metallin
kilahdus voisi herättää nukkuvat.
Hetki lähestyi. Stas kumartui Chamiksen yli, otti kotelon
kädensijasta kiinni, nosti ja rupesi hivuttamaan koteloa omalle
puolelleen. Sydän jyskytti, silmissä musteni, hengitystä ahdisti,
mutta hän puri hammasta ja koetti säilyttää mielenmalttinsa. Kun
kotelon hihnat hiukan narahtivat, pusertui kylmä hiki pojan otsalle.
Tämä hetki oli hänestä pitkä kuin iankaikkisuus. Chamis ei
hievahtanutkaan. Kotelo vilahti kaaressa hänen ylitseen ja oli
patruunalaukun vieressä.
Stas hengähti helpotuksesta. Puolet oli tehty. Nyt oli hiivittävä
äänettömästi ulos luolasta, juostava muutaman askelen päähän,
piilouduttava kallioiden suojaan, laitettava pyssy kuntoon ja
varustettava muutamia patruunoita taskuun varalle. Silloin olisi koko
karavaani hänen vallassaan.
Stasin musta varjo ilmaantui luolan suuhun. Vielä sekunti, ja hän
on luolan ulkopuolella. Vielä hetki, ja hän on piilossa kalliolla. Silloin,
vaikka joku rosvoista heräisikin… olisi jo myöhäistä. Poika siirsi toisen
näistä paikoista parin päivän matkan päässä, koska arabit
varovaisuuden vuoksi olivat ajaneet syvälle sisämaahan. Mutta se ei
haittaisi, sillä jäisihän muutamia kameleja jäljelle, ja yhdellä niistä
saisi Nel ajaa. Stas alkoi tarkastella arabeja. He näyttivät nukkuvan
sikeästi. Mutta koska yö oli loppumaisillaan, he voisivat kohdakkoin
herätä. Täytyi siis toimia vitkastelematta. Patruunalaukun saattoi
ottaa helposti, sillä se oli melkein vieressä. Toisin oli pyssyn laita;
Chamis oli näet pannut sen viereensä. Stas toivoi voivansa anastaa
sen, mutta päätti ottaa sen ulos kotelostaan ja liittää piipun tukkiin
vasta ulkona muutaman askelen päässä luolasta, sillä metallin
kilahdus voisi herättää nukkuvat.
Hetki lähestyi. Stas kumartui Chamiksen yli, otti kotelon
kädensijasta kiinni, nosti ja rupesi hivuttamaan koteloa omalle
puolelleen. Sydän jyskytti, silmissä musteni, hengitystä ahdisti,
mutta hän puri hammasta ja koetti säilyttää mielenmalttinsa. Kun
kotelon hihnat hiukan narahtivat, pusertui kylmä hiki pojan otsalle.
Tämä hetki oli hänestä pitkä kuin iankaikkisuus. Chamis ei
hievahtanutkaan. Kotelo vilahti kaaressa hänen ylitseen ja oli
patruunalaukun vieressä.
Stas hengähti helpotuksesta. Puolet oli tehty. Nyt oli hiivittävä
äänettömästi ulos luolasta, juostava muutaman askelen päähän,
piilouduttava kallioiden suojaan, laitettava pyssy kuntoon ja
varustettava muutamia patruunoita taskuun varalle. Silloin olisi koko
karavaani hänen vallassaan.
Stasin musta varjo ilmaantui luolan suuhun. Vielä sekunti, ja hän
on luolan ulkopuolella. Vielä hetki, ja hän on piilossa kalliolla. Silloin,
vaikka joku rosvoista heräisikin… olisi jo myöhäistä. Poika siirsi toisen
jalkansa ja tunnusteli maata peläten kolauttavansa kiviä, joita oli
luolan pohjalla. Nyt hän kurkotti jo päänsä luolan aukosta ulos
valmiina ryömimään kokonaan ulos, kun yhtäkkiä tapahtui jotakin,
mikä sai veren hyytymään pojan suonissa.
Keskellä syvää hiljaisuutta kajahti ukkosena Saban haukunta
täyttäen koko syvänteen. Arabit heräsivät hetkessä ja ensimmäisenä
osui heidän silmiinsä — Stas pyssy toisessa ja patruunalaukku
toisessa kädessä.
Voi Saba, mitä sinä teit!
10
Silmänräpäyksessä kaikki hyökkäsivät huutaen Stasin kimppuun,
riistivät häneltä pyssyn ja patruunalaukun, heittivät hänet maahan,
sitoivat kädet ja jalat köysillä ja löivät ja potkivat häntä, kunnes Idrys
ajoi heidät pois peläten heidän rääkkäävän pojan kuoliaaksi. Sitten
he alkoivat keskustella katkonaisin lausein ja sanoin, kuten ihmiset,
jotka ovat pelastuneet kauheasta vaarasta.
— Tuo on itse saatana! ärähti Idrys pelästyksestä ja
mielenliikutuksesta kalpeana.
— Hän olisi ampunut meidät kaikki kuin parven villisorsia, lisäsi
Gebr.
— Oh, ellei tuo koira olisi…
— Jumala sen lähetti.
luolan pohjalla. Nyt hän kurkotti jo päänsä luolan aukosta ulos
valmiina ryömimään kokonaan ulos, kun yhtäkkiä tapahtui jotakin,
mikä sai veren hyytymään pojan suonissa.
Keskellä syvää hiljaisuutta kajahti ukkosena Saban haukunta
täyttäen koko syvänteen. Arabit heräsivät hetkessä ja ensimmäisenä
osui heidän silmiinsä — Stas pyssy toisessa ja patruunalaukku
toisessa kädessä.
Voi Saba, mitä sinä teit!
10
Silmänräpäyksessä kaikki hyökkäsivät huutaen Stasin kimppuun,
riistivät häneltä pyssyn ja patruunalaukun, heittivät hänet maahan,
sitoivat kädet ja jalat köysillä ja löivät ja potkivat häntä, kunnes Idrys
ajoi heidät pois peläten heidän rääkkäävän pojan kuoliaaksi. Sitten
he alkoivat keskustella katkonaisin lausein ja sanoin, kuten ihmiset,
jotka ovat pelastuneet kauheasta vaarasta.
— Tuo on itse saatana! ärähti Idrys pelästyksestä ja
mielenliikutuksesta kalpeana.
— Hän olisi ampunut meidät kaikki kuin parven villisorsia, lisäsi
Gebr.
— Oh, ellei tuo koira olisi…
— Jumala sen lähetti.
— Ja te aioitte tappaa sen, virkkoi Chamis.
— Tästä lähtien kukaan ei saa koskea siihen.
— Siltä ei tule koskaan puuttumaan luita eikä vettä,
— Allah! Allah! toisti Idrys yhä levottomana. — Kuolema liikkui
meidän päällemme.
He katsoivat vihoissaan maassa makaavaa Stasia ja ihmettelivät,
miten tuollainen pieni poika oli ollut vähällä syöstä heidät
onnettomuuteen ja perikatoon.
— Profeetan nimessä! huudahti toinen beduiineista. —
Varokaamme, ettei tuo paholaisen poika väännä niskojamme nurin!
Käärmettä me Mahdille kuljetamme! Mitä te aiotte tehdä hänelle!
— Lyödään häneltä oikea käsi pois! huusi Gebr.
Beduiinit eivät vastanneet siihen mitään, mutta Idrys ei tahtonut
suostua sellaiseen. Hän tuli ajatelleeksi, että jos takaa-ajajat saavat
heidät kiinni, niin heitä odottaisi pojan silpomisen tähden kauhein
mahdollinen rangaistus. Ja kuka vastaisi siitä, ettei Stas kuolisi
moisesta leikkauksesta? Siinä tapauksessa jäisi vain Nel, jolla Fatma
ja hänen lapsensa lunastettaisiin.
Kun Gebr otti veitsensä pannakseen täytäntöön uhkauksensa,
Idrys tarttui hänen käteensä sanoen:
— Ei! Mikä häpeä viidelle Mahdin sotilaalle pelätä yhtä kristittyä
penikkaa niin kovasti, että käsi lyödään poikki! Sidotaan hänet öiksi
kiinni ja rangaistaan häntä kymmenellä ruoskaniskulla.
— Tästä lähtien kukaan ei saa koskea siihen.
— Siltä ei tule koskaan puuttumaan luita eikä vettä,
— Allah! Allah! toisti Idrys yhä levottomana. — Kuolema liikkui
meidän päällemme.
He katsoivat vihoissaan maassa makaavaa Stasia ja ihmettelivät,
miten tuollainen pieni poika oli ollut vähällä syöstä heidät
onnettomuuteen ja perikatoon.
— Profeetan nimessä! huudahti toinen beduiineista. —
Varokaamme, ettei tuo paholaisen poika väännä niskojamme nurin!
Käärmettä me Mahdille kuljetamme! Mitä te aiotte tehdä hänelle!
— Lyödään häneltä oikea käsi pois! huusi Gebr.
Beduiinit eivät vastanneet siihen mitään, mutta Idrys ei tahtonut
suostua sellaiseen. Hän tuli ajatelleeksi, että jos takaa-ajajat saavat
heidät kiinni, niin heitä odottaisi pojan silpomisen tähden kauhein
mahdollinen rangaistus. Ja kuka vastaisi siitä, ettei Stas kuolisi
moisesta leikkauksesta? Siinä tapauksessa jäisi vain Nel, jolla Fatma
ja hänen lapsensa lunastettaisiin.
Kun Gebr otti veitsensä pannakseen täytäntöön uhkauksensa,
Idrys tarttui hänen käteensä sanoen:
— Ei! Mikä häpeä viidelle Mahdin sotilaalle pelätä yhtä kristittyä
penikkaa niin kovasti, että käsi lyödään poikki! Sidotaan hänet öiksi
kiinni ja rangaistaan häntä kymmenellä ruoskaniskulla.
Gebr oli valmis täyttämään tuomion, mutta Idrys esti häntä jälleen
ja käski erään beduiineista lyödä kuiskaten samalla tämän korvaan,
ettei tämä löisi liian lujaa. Kun Chamis ei tahtonut sekaantua asiaan
joko siksi, että oli ennen ollut insinöörin palveluksessa tai jostakin
muusta syystä, käänsi toinen beduiineista Stasin vatsalleen. Mutta
juuri kuin rangaistus aiottiin panna täytäntöön, ilmaantui
odottamaton este.
Nel ja Saba tulivat luolasta.
Nel oli leikkinyt koiran kanssa, joka luolaan tultuaan oli heti
heittäytynyt tytön jalkojen juureen. Hän oli kyllä kuullut arabien
huudot, mutta ei ollut välittänyt siitä sen enempää, sillä Egyptissä
sekä arabit että beduiinit huutavat milloin vain mieli tekee, niin että
aluksi saattaa luulla heidän aina haastavan tappelua. Mutta kun tyttö
oli huutanut Stasia luokseen saamatta vastausta, hän meni
katsomaan, missä poika oli, ja näki kauhukseen aamun himmeässä
valossa Stasin makaavan maassa ja beduiinin hänen päällään ruoska
kädessä. Nel alkoi huutaa ja tömistää jalkojaan, mutta kun beduiini
ei siitä välittänyt, vaan löi, hän juoksi Stasin luo ja peitti pojan
itsellään. Beduiini ei uskaltanut luvatta lyödä tyttöä, joka samassa
huusi epätoivoisesti:
— Saba! Saba!
Saba ymmärsi heti, mistä oli kysymys. Yksi loikkaus — ja se oli
Nelin vieressä. Koiran selkäkarvat nousivat pystyyn, silmät veristyivät
ja sen rinnasta nousi vihainen haukunta, joka oli kova kuin ukkosen
jyrinä.
Rypistyneet huulet kohosivat ja niitten alta näkyivät suuret
valkoiset hampaat ja punaiset ikenet. Koira alkoi kääntää päätään
ja käski erään beduiineista lyödä kuiskaten samalla tämän korvaan,
ettei tämä löisi liian lujaa. Kun Chamis ei tahtonut sekaantua asiaan
joko siksi, että oli ennen ollut insinöörin palveluksessa tai jostakin
muusta syystä, käänsi toinen beduiineista Stasin vatsalleen. Mutta
juuri kuin rangaistus aiottiin panna täytäntöön, ilmaantui
odottamaton este.
Nel ja Saba tulivat luolasta.
Nel oli leikkinyt koiran kanssa, joka luolaan tultuaan oli heti
heittäytynyt tytön jalkojen juureen. Hän oli kyllä kuullut arabien
huudot, mutta ei ollut välittänyt siitä sen enempää, sillä Egyptissä
sekä arabit että beduiinit huutavat milloin vain mieli tekee, niin että
aluksi saattaa luulla heidän aina haastavan tappelua. Mutta kun tyttö
oli huutanut Stasia luokseen saamatta vastausta, hän meni
katsomaan, missä poika oli, ja näki kauhukseen aamun himmeässä
valossa Stasin makaavan maassa ja beduiinin hänen päällään ruoska
kädessä. Nel alkoi huutaa ja tömistää jalkojaan, mutta kun beduiini
ei siitä välittänyt, vaan löi, hän juoksi Stasin luo ja peitti pojan
itsellään. Beduiini ei uskaltanut luvatta lyödä tyttöä, joka samassa
huusi epätoivoisesti:
— Saba! Saba!
Saba ymmärsi heti, mistä oli kysymys. Yksi loikkaus — ja se oli
Nelin vieressä. Koiran selkäkarvat nousivat pystyyn, silmät veristyivät
ja sen rinnasta nousi vihainen haukunta, joka oli kova kuin ukkosen
jyrinä.
Rypistyneet huulet kohosivat ja niitten alta näkyivät suuret
valkoiset hampaat ja punaiset ikenet. Koira alkoi kääntää päätään
oikealle ja vasemmalle, ikäänkuin se olisi tahtonut näyttää
sudanilaisille ja beduiineille pelottavat aseensa ja sanoa:
— Katsokaa millä minä puolustan lapsia! Kaikki peräytyivät
nopeasti, koska ensinnäkin tiesivät, että Saba oli pelastanut heidän
henkensä, ja toiseksi koska he näkivät, että suuttunut koira upottaisi
empimättä hampaansa sen kurkkuun, joka tällä hetkellä uskaltaisi
lähestyä Neliä. He seisoivat siinä avuttomina katsoen arastellen
toisiinsa ja ikäänkuin kysyen, mitä nyt, oli tehtävä. He epäröivät niin
kauan, että Nel ehti kutsua vanhan Dinahin vapauttamaan Stasin
siteistä. Poika nousi ja laskien kätensä Saban pään päälle sanoi
hammasta purren miehille:
— Minä en aikonut tappaa teitä, vaan kamelit. Mutta nämäkin
sanat vaikuttivat arabeihin niin järkyttävästi, että he olisivat varmasti
hyökänneet uudestaan Stasin niskaan, jolleivät Saban säkenöivät
silmät ja hurja olemus olisi pidättäneet heitä siitä.
Seurasi hetken hiljaisuus, sitten kajahti Idryksen kantava ääni:
— Eteenpäin! Eteenpäin!
11
Kului päivä, yö ja vielä päivä, mutta he ajoivat yhä etelää kohti
pysähtyen silloin tällöin hetkeksi syvänteisiin lepuuttamaan,
juottamaan ja ruokkimaan kameleja ja tyydyttämään omaa janoa ja
nälkää. Takaa-ajajia peläten he kääntyivät vielä enemmän länteen,
sillä vettä heillä oli joksikin aikaa riittävästi eikä sitä varten tarvinnut
sudanilaisille ja beduiineille pelottavat aseensa ja sanoa:
— Katsokaa millä minä puolustan lapsia! Kaikki peräytyivät
nopeasti, koska ensinnäkin tiesivät, että Saba oli pelastanut heidän
henkensä, ja toiseksi koska he näkivät, että suuttunut koira upottaisi
empimättä hampaansa sen kurkkuun, joka tällä hetkellä uskaltaisi
lähestyä Neliä. He seisoivat siinä avuttomina katsoen arastellen
toisiinsa ja ikäänkuin kysyen, mitä nyt, oli tehtävä. He epäröivät niin
kauan, että Nel ehti kutsua vanhan Dinahin vapauttamaan Stasin
siteistä. Poika nousi ja laskien kätensä Saban pään päälle sanoi
hammasta purren miehille:
— Minä en aikonut tappaa teitä, vaan kamelit. Mutta nämäkin
sanat vaikuttivat arabeihin niin järkyttävästi, että he olisivat varmasti
hyökänneet uudestaan Stasin niskaan, jolleivät Saban säkenöivät
silmät ja hurja olemus olisi pidättäneet heitä siitä.
Seurasi hetken hiljaisuus, sitten kajahti Idryksen kantava ääni:
— Eteenpäin! Eteenpäin!
11
Kului päivä, yö ja vielä päivä, mutta he ajoivat yhä etelää kohti
pysähtyen silloin tällöin hetkeksi syvänteisiin lepuuttamaan,
juottamaan ja ruokkimaan kameleja ja tyydyttämään omaa janoa ja
nälkää. Takaa-ajajia peläten he kääntyivät vielä enemmän länteen,
sillä vettä heillä oli joksikin aikaa riittävästi eikä sitä varten tarvinnut
siis ajaa Niilin rantaan. Sadetta oli kestänyt vain seitsemän tuntia,
mutta sen ajan olikin vettä tullut kuin pilvet olisivat revenneet. He
tiesivät, että syvänteitten pohjilla ja kalliosyvennyksissä olisi vettä
ainakin muutaman päivän ajan, niin että riittäisi heille ja kameleille,
ehkäpä varastoonkin. Rankkasadetta seurasi ihmeen ihana sää.
Taivaalla ei näkynyt ainoatakaan pilveä ja ilma oli kirkas. Öisin säteili
tähtien peittämä taivas tuhansin timantein. Erämaan hietikot
huokuivat viileyttä.
Kamelien kyttyrät olivat pienentyneet, mutta kun niitä ruokittiin
hyvin, eivät ne uupuneet matkasta, vaan juoksivat nopeammin kuin
ensimmäisenä päivänä Garak-el-Sultanista lähdettyä. Stas huomasi
ihmeekseen, että beduiinit löysivät muutamista syvänteistä ja
kallionkoloista durraa ja taateleja, mistä saattoi päätellä, että he
olivat edeltäpäin varustautuneet ryöstöön ja sopineet siitä
keskenään. Olihan luonnollista, että beduiinit olivat Mahdin
hengenheimolaisia, ja juuri siksi sudanilaiset saivat heidät niin
helposti salaliittoonsa. Fajumin ja Garak-el-Sultanin ympäristöissä oli
paljon beduiineja, jotka osaksi lapsineen ja kameleineen kuljeskelivat
pitkin erämaata, osaksi tulivat Medinetiin tai muille rautatieasemille
ansiotöihin. Näitä kahta beduiinia Stas ei ollut milloinkaan nähnyt, ja
he lienevät tuskin olleetkaan koskaan Medinetissä, koska eivät
tunteneet Sabaa.
Toisinaan juolahti Stasin mieleen lahjoa beduiinit, mutta
muistettuaan heidän innokkaat huudahduksensa joka kerta, kun
Mahdin nimi oli mainittu, hän ymmärsi sen mahdottomaksi. Stas ei
kuitenkaan antautunut toivottomuuden valtaan, sillä hänen
sielussaan piili ihmeteltävä voima, joka vain kasvoi
vastoinkäymisistä. "Kaikki, mitä olen yrittänyt", hän ajatteli, "on
päättynyt tappioon. Mutta vaikka minua joka päivä ruoskittaisiin,
mutta sen ajan olikin vettä tullut kuin pilvet olisivat revenneet. He
tiesivät, että syvänteitten pohjilla ja kalliosyvennyksissä olisi vettä
ainakin muutaman päivän ajan, niin että riittäisi heille ja kameleille,
ehkäpä varastoonkin. Rankkasadetta seurasi ihmeen ihana sää.
Taivaalla ei näkynyt ainoatakaan pilveä ja ilma oli kirkas. Öisin säteili
tähtien peittämä taivas tuhansin timantein. Erämaan hietikot
huokuivat viileyttä.
Kamelien kyttyrät olivat pienentyneet, mutta kun niitä ruokittiin
hyvin, eivät ne uupuneet matkasta, vaan juoksivat nopeammin kuin
ensimmäisenä päivänä Garak-el-Sultanista lähdettyä. Stas huomasi
ihmeekseen, että beduiinit löysivät muutamista syvänteistä ja
kallionkoloista durraa ja taateleja, mistä saattoi päätellä, että he
olivat edeltäpäin varustautuneet ryöstöön ja sopineet siitä
keskenään. Olihan luonnollista, että beduiinit olivat Mahdin
hengenheimolaisia, ja juuri siksi sudanilaiset saivat heidät niin
helposti salaliittoonsa. Fajumin ja Garak-el-Sultanin ympäristöissä oli
paljon beduiineja, jotka osaksi lapsineen ja kameleineen kuljeskelivat
pitkin erämaata, osaksi tulivat Medinetiin tai muille rautatieasemille
ansiotöihin. Näitä kahta beduiinia Stas ei ollut milloinkaan nähnyt, ja
he lienevät tuskin olleetkaan koskaan Medinetissä, koska eivät
tunteneet Sabaa.
Toisinaan juolahti Stasin mieleen lahjoa beduiinit, mutta
muistettuaan heidän innokkaat huudahduksensa joka kerta, kun
Mahdin nimi oli mainittu, hän ymmärsi sen mahdottomaksi. Stas ei
kuitenkaan antautunut toivottomuuden valtaan, sillä hänen
sielussaan piili ihmeteltävä voima, joka vain kasvoi
vastoinkäymisistä. "Kaikki, mitä olen yrittänyt", hän ajatteli, "on
päättynyt tappioon. Mutta vaikka minua joka päivä ruoskittaisiin,
vaikka minut ruoskittaisiin kuoliaaksi niin en lakkaa ajattelemasta
sitä, miten voisin pelastaa Nelin ja itseni näiden roistojen käsistä. Jos
takaa-ajajat saavat heidät kiinni, on se sitä parempi, mutta minä
koetan joka tapauksessa myös toimia itsenäisesti."
Kun hän muisti, kuinka he olivat lyöneet ja potkineet häntä ja
ottaneet häneltä pyssyn, täytti viha hänen sydämensä. Hän tunsi
olevansa nöyryytetty. Mutta ennen kaikkea häntä kuohutti Neliä
kohdannut vääryys, ja tämä tunne yhdessä viimeisen
epäonnistuneen yrityksen herättämän katkeruuden kanssa muuttui
suunnattomaksi vihaksi molempia sudanilaisia kohtaan. Isältään hän
oli kuullut, että viha sokaisee ihmisen ja että sen valtaan joutuvat
vain sellaiset, jotka eivät voi aikaansaada mitään parempaa. Mutta
nyt ei Stas ainakaan voinut voittaa eikä salata tuota tunnetta.
Sen huomasi Idryskin, joka tuli siitä levottomaksi, sillä hän
ymmärsi, että jos he joutuvat kiinni, ei hän voisi toivoa apua Stasilta.
Idrys oli raaka, mutta hän oli myöskin viisas, ja käsitti, että pitää
ajatella tulevaisuutta ja jättää pelastuksen tie vapaaksi mahdollisen
onnettomuuden varalle. Sen tähden hän tahtoi nyt tehdä sovinnon
Stasin kanssa ja rupesi tässä tarkoituksessa juttelemaan hänelle
seuraavassa levähdyspaikassa.
— Kaikesta siitä, mitä sinä aioit meille tehdä, minun täytyi
rangaista sinua, muuten toiset olisivat tappaneet sinut. Mutta minä
kielsin beduiinia lyömästä liian kovaa.
Kun Stas ei vastannut, hän hetken kuluttua jatkoi:
— Kuulehan, sinä olet itse sanonut, että valkoihoiset pitävät
lupauksensa. Jos sinä Jumalasi nimessä ja pienen "bindin" pään
sitä, miten voisin pelastaa Nelin ja itseni näiden roistojen käsistä. Jos
takaa-ajajat saavat heidät kiinni, on se sitä parempi, mutta minä
koetan joka tapauksessa myös toimia itsenäisesti."
Kun hän muisti, kuinka he olivat lyöneet ja potkineet häntä ja
ottaneet häneltä pyssyn, täytti viha hänen sydämensä. Hän tunsi
olevansa nöyryytetty. Mutta ennen kaikkea häntä kuohutti Neliä
kohdannut vääryys, ja tämä tunne yhdessä viimeisen
epäonnistuneen yrityksen herättämän katkeruuden kanssa muuttui
suunnattomaksi vihaksi molempia sudanilaisia kohtaan. Isältään hän
oli kuullut, että viha sokaisee ihmisen ja että sen valtaan joutuvat
vain sellaiset, jotka eivät voi aikaansaada mitään parempaa. Mutta
nyt ei Stas ainakaan voinut voittaa eikä salata tuota tunnetta.
Sen huomasi Idryskin, joka tuli siitä levottomaksi, sillä hän
ymmärsi, että jos he joutuvat kiinni, ei hän voisi toivoa apua Stasilta.
Idrys oli raaka, mutta hän oli myöskin viisas, ja käsitti, että pitää
ajatella tulevaisuutta ja jättää pelastuksen tie vapaaksi mahdollisen
onnettomuuden varalle. Sen tähden hän tahtoi nyt tehdä sovinnon
Stasin kanssa ja rupesi tässä tarkoituksessa juttelemaan hänelle
seuraavassa levähdyspaikassa.
— Kaikesta siitä, mitä sinä aioit meille tehdä, minun täytyi
rangaista sinua, muuten toiset olisivat tappaneet sinut. Mutta minä
kielsin beduiinia lyömästä liian kovaa.
Kun Stas ei vastannut, hän hetken kuluttua jatkoi:
— Kuulehan, sinä olet itse sanonut, että valkoihoiset pitävät
lupauksensa. Jos sinä Jumalasi nimessä ja pienen "bindin" pään
kautta vannot, ettet juonittele enää meitä vastaan, niin minä en
käske sitoa sinua yöksi.
Stas ei nytkään vastannut, mutta pojan ilmeestä Idrys ymmärsi
puhuvansa turhaan.
Kaikesta huolimatta Idrys kielsi sitomasta poikaa yöksi, vaikka
Gebr ja beduiinit olivat kovasti sitä vastaan, ja kun Gebr itsepäisesti
piti puoliaan, toinen huudahti vihastuneena:
— Ensi yönä, kun kaikki nukkuvat, sinä vartioit. Tästä päivästä
lähtien yksi meistä vuoron perään varioi muitten nukkuessa.
Ja siitä päivästä saakka oli todellakin vuoron perään aina joku öisin
vartioimassa. Tämä häiritsi Stasia ja esti häntä panemasta
suunnitelmiaan täytäntöön.
Mutta nyt lapset saivat olla hyvin vapaasti, niin että voivat olla
paljon yhdessä ja jutella keskenään. Seuraavassa levähdyspaikassa
Stas istuutui Nelin viereen kiittääkseen tyttöä avusta. Hän puristi
tytön käsiä sanoen:
— Nel, sinä olet oikein hyvä ja minä olen kiitollinen sinulle, ja minä
sanon sinulle suoraan, että sinä menettelit kuin ainakin
kolmetoistavuotias.
Stasin suussa moiset sanat olivat suurta ylistystä, ja tytön sydän
täyttyi ilosta ja ylpeydestä. Tällä hetkellä Nelistä tuntui kuin hänelle
ei olisi mikään mahdotonta.
— Kun minä tulen ihan täysi-ikäiseksi, niin nuo saavat nähdä! tyttö
sanoi katsoen urhoollisesti sudanilaisiin päin.
käske sitoa sinua yöksi.
Stas ei nytkään vastannut, mutta pojan ilmeestä Idrys ymmärsi
puhuvansa turhaan.
Kaikesta huolimatta Idrys kielsi sitomasta poikaa yöksi, vaikka
Gebr ja beduiinit olivat kovasti sitä vastaan, ja kun Gebr itsepäisesti
piti puoliaan, toinen huudahti vihastuneena:
— Ensi yönä, kun kaikki nukkuvat, sinä vartioit. Tästä päivästä
lähtien yksi meistä vuoron perään varioi muitten nukkuessa.
Ja siitä päivästä saakka oli todellakin vuoron perään aina joku öisin
vartioimassa. Tämä häiritsi Stasia ja esti häntä panemasta
suunnitelmiaan täytäntöön.
Mutta nyt lapset saivat olla hyvin vapaasti, niin että voivat olla
paljon yhdessä ja jutella keskenään. Seuraavassa levähdyspaikassa
Stas istuutui Nelin viereen kiittääkseen tyttöä avusta. Hän puristi
tytön käsiä sanoen:
— Nel, sinä olet oikein hyvä ja minä olen kiitollinen sinulle, ja minä
sanon sinulle suoraan, että sinä menettelit kuin ainakin
kolmetoistavuotias.
Stasin suussa moiset sanat olivat suurta ylistystä, ja tytön sydän
täyttyi ilosta ja ylpeydestä. Tällä hetkellä Nelistä tuntui kuin hänelle
ei olisi mikään mahdotonta.
— Kun minä tulen ihan täysi-ikäiseksi, niin nuo saavat nähdä! tyttö
sanoi katsoen urhoollisesti sudanilaisiin päin.
Mutta koska hän ei ollut käsittänyt, miksi arabit oikeastaan olivat
hyökännet Stasin kimppuun, tämä alkoi kertoa, kuinka oli päättänyt
varastaa pyssyn, ampua kamelit ja pakottaa kaikki kääntymään Niilin
rantaan.
— Jos se olisi onnistunut, olisimme nyt vapaita, sanoi Stas.
— Mutta he heräsivät? tyttö kysyi.
— Heräsivät. Ja syy oli Saban, joka juoksi syvänteeseen ja alkoi
haukkua niin kovaa, että kuollutkin olisi herännyt.
Tytön mieli kuohahti.
— Paha Saba! Kun se saa meidät kiinni, en sano sille sanaakaan,
en muuta kuin että se on paha.
Stas hymähti:
— Mutta kuinka on mahdollista olla virkkamatta sille sanaakaan ja
kuitenkin sanoa, että se on paha?
Nelin kulmakarvat kohosivat ja hämillään hän vastasi:
— Se näkee sen minun kasvoistani.
— Ehkä. Mutta se ei ole syyllinen, koska se ei voinut tietää, mitä
oli tekeillä. Muista myös, että se oli myöhemmin meille avuksi.
Tämä vähensi jonkin verran Nelin vihaa, mutta hän ei kuitenkaan
tahtonut heti antaa syylliselle anteeksi.
Vähän ajan kuluttua suru alkoi sumentaa Stasin silmiä, hän
huokasi, nousi kiveltä ja sanoi:
hyökännet Stasin kimppuun, tämä alkoi kertoa, kuinka oli päättänyt
varastaa pyssyn, ampua kamelit ja pakottaa kaikki kääntymään Niilin
rantaan.
— Jos se olisi onnistunut, olisimme nyt vapaita, sanoi Stas.
— Mutta he heräsivät? tyttö kysyi.
— Heräsivät. Ja syy oli Saban, joka juoksi syvänteeseen ja alkoi
haukkua niin kovaa, että kuollutkin olisi herännyt.
Tytön mieli kuohahti.
— Paha Saba! Kun se saa meidät kiinni, en sano sille sanaakaan,
en muuta kuin että se on paha.
Stas hymähti:
— Mutta kuinka on mahdollista olla virkkamatta sille sanaakaan ja
kuitenkin sanoa, että se on paha?
Nelin kulmakarvat kohosivat ja hämillään hän vastasi:
— Se näkee sen minun kasvoistani.
— Ehkä. Mutta se ei ole syyllinen, koska se ei voinut tietää, mitä
oli tekeillä. Muista myös, että se oli myöhemmin meille avuksi.
Tämä vähensi jonkin verran Nelin vihaa, mutta hän ei kuitenkaan
tahtonut heti antaa syylliselle anteeksi.
Vähän ajan kuluttua suru alkoi sumentaa Stasin silmiä, hän
huokasi, nousi kiveltä ja sanoi:
Welcome to our website – the perfect destination for book lovers and
knowledge seekers. We believe that every book holds a new world,
offering opportunities for learning, discovery, and personal growth.
That’s why we are dedicated to bringing you a diverse collection of
books, ranging from classic literature and specialized publications to
self-development guides and children's books.
More than just a book-buying platform, we strive to be a bridge
connecting you with timeless cultural and intellectual values. With an
elegant, user-friendly interface and a smart search system, you can
quickly find the books that best suit your interests. Additionally,
our special promotions and home delivery services help you save time
and fully enjoy the joy of reading.
Join us on a journey of knowledge exploration, passion nurturing, and
personal growth every day!
ebookbell.com
knowledge seekers. We believe that every book holds a new world,
offering opportunities for learning, discovery, and personal growth.
That’s why we are dedicated to bringing you a diverse collection of
books, ranging from classic literature and specialized publications to
self-development guides and children's books.
More than just a book-buying platform, we strive to be a bridge
connecting you with timeless cultural and intellectual values. With an
elegant, user-friendly interface and a smart search system, you can
quickly find the books that best suit your interests. Additionally,
our special promotions and home delivery services help you save time
and fully enjoy the joy of reading.
Join us on a journey of knowledge exploration, passion nurturing, and
personal growth every day!
ebookbell.com
Download
Download Slideshow Get the original presentation fileQuick Actions
Statistics
- Views 8
- Slides 86
- Favorites 1
- Age 215 days
Related Slideshows
36
Clinical approach Dyspnoea A simple and practical approach.pptx
ShajahanPS
39 views
238
Cancer Awareness therapy for public by Dr Kanhu Charan Patro
kanhucpatro
38 views
41
Prof Satyadas Memorial oration Kozhikode.pptx
ShajahanPS
34 views
26
Viral Conjunctivitis and it;s managment.pptx
ZaidAzhar
46 views
30
Essential Thrombocythemia 15 Years of Experience at the Hematology Department, Algies, Algeria.pdf
sbelakehal
41 views
10
Hypertension sign symptoms cmdt style with regime
androiddabest
42 views