huong_2011_tieng_viet.pdf tài liệu hướng dẫn trích dẫn tài liệu

hướng dẫn trích dẫn tài liệu trong viết luận án và nghiên cứu khoa học. Biaos trình có ý nghĩa trong phương pháp nghiên cứu khoa học và hoàn thiện luân án.

1. B GIÁO DC VÀ ÀO TO
I HC THÁI NGUYÊN





NGUYN TH THÚY HNG





PHÂN LP, TO T BIN IM GEN P5CS
LIÊN QUAN N TÍNH CHU HN VÀ TH NGHIưM
CHUYN VÀO CÂY U TƠNG VIưT NAM

Chuyên ngành: Di truyn hơc
Mã s: 62.42.70.01





TÓM TT LUN ÁN TIN S SINH HC








THÁI NGUYÊN - 2011

2. CÁC CÔNG TRÌNH CA TÁC GI Ã CÔNG B
LIÊN QUAN N LUN ÁN
1. Nguyn Th Thuý Hưng, Chu Hoàng Mu, Hà Tn Th, inh Th Kim
Phương, Trn Th Trưng (2006), “Sưu tp, phân loi và ánh giá cht lưng
ht ca mt s ging u tương a phương ti tnh Sơn La”, Tp chí Nông
nghip và phát trin Nông thôn, s 11 k I tháng 6/2006. 28-32
2. Chu Hoàng Mu, Nguyn Th Thuý Hưng (2006), “Thành phn axit amin và
kh nng chu hn ca mt s ging u tương a phương ca tnh Sơn La”,
Tp chí Nông nghip và phát trin Nông thôn, s 20 kì II tháng 10/2006. 22-
26.
3. Nguyn Th Thúy Hưng, Chu Hoàng Mu, Lê Vn Sơn, Nguyn H u Cưng, Lê
Trn Bình, Chu Hoàng Hà (2008), "ánh giá kh nng chu hn và phân lp
gen P5CS ca mt s ging u tương (Glycine max L.Merrili)", Tp chí công
ngh sinh hc, 6(4): 459-466.
4. Nguyn Th Thúy Hưng, Trn Th Ng c Dip, Nguyn Thu Hin, Chu Hoàng
Mu, Lê Vn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), "Phát tri!n h thng tái sinh invitro
" cây u tương (Glycine max L.Merrili) phc v chuy!n gen", Tp chí khoa
hc và công ngh. i h c Thái Nguyên 52 (4): 82-88.
5. Nguyn Th Thúy Hưng, Chu Hoàng Mu, Lê Vn Sơn, Nguyn H u Cưng, Lê
Trn Bình, Chu Hoàng Hà (2009), "To gen mã hóa Enzym P5CS (Pyroline
- 5 - carboxylate synthase) mang t bin loi b# hiu $ng $c ch phn hi
b%ng k& thut PCR". Hi ngh công ngh sinh hc toàn quc nm 2009: 191
- 193.
6. Nguyn Th Thuý Hưng, Chu Hoàng Mu, Lê Vn Sơn, Nguyn H u Cưng, Chu
Hoàng Hà (2010), "'(ch )*ng +,-(nh ./(-01t ng 2a promoter 2m $ng
khô 0n rd29A t3-Arabidopsis thaliana", p ư Công nghsinh c 8(4):
1805-1810
7. Nguyn Th Thuý Hưng, Chu Hoàng Mu, Lê Vn Sơn, Nguyn H u Cưng, Chu
Hoàng Hà (2010), "To cây thuc lá chuy!n gen P5CS t bin loi b# hiu
$ng phn hi ngưc, làm tng hàm lưng protein và kh nng chng chu khô
hn. Hi ngh toàn quc v khoa h c s sng Bio-Hà Ni 2010", Tp chí công
ngh sinh hc, 8 (3A): 539-544.
8. Chu Hoang Mau, Nguyen thi Thuy Huong, Nguyen Tuan Anh, Chu
Hoang Lan, Le van Son, Chu Hoang Ha ( 2010) Characteristic of the gene
encoding pyrroline - 5 - carboxylate synthase (P5CS) in Vietnamese sobean
cultivar (Glycine max L.Merrill) 2010 International Conference on Biology,
Environment and Chemistry (ICBEC 2010) IEEE: 319-323

3. 1
M U
1. t v!n
Cây u tương (Glycine max (L.) Merrill) là mt trong nh ng cây trng
quan tr ng không ch " Vit Nam mà còn i vi nhiu quc gia trên th
gii. Tình trng hn hán nh hư"ng ti tình hình sn xut u tương không
ch " Vit Nam mà ngay c nh ng nưc sn xut u tương hàng u th
gii. u tương là cây trng thuc nhóm cây có kh nng chu hn kém. 4
Vit Nam, nhiu ging u tương có kh nng chng chu hn ã ưc
ch n to thành công và ang ưc tri!n khai canh tác " mt s a phương.
Tuy nhiên các phương pháp ch n ging truyn thng tn nhiu thƠi gian,
ph$c tp và cn phi có qun th! ln và không 5n nh. Nh ng nhưc
i!m ca phương pháp truyn thng có th! kh6c phc b%ng vic áp dng
các k& thut mi ca công ngh sinh h c. K& thut chuy!n gen " thc vt
thông qua vi khu7n Agrobacterium tumefaciens ã ưc các nhà khoa h c
trên th gii $ng dng và t ưc nh ng kt qu rt có tri!n v ng trên cây
u tương. 4 Vit Nam, nhóm nghiên c$u ca Trn Th Cúc Hòa ti Vin
Nghiên c$u lúa ng b%ng Sông C8u Long ã thành công trong vic to ra
các ging u tương mi mang tính kháng sâu bnh, tuy nhiên cho n nay
công trình nghiên c$u v chuy!n gen chu hn vào cây u tương v9n chưa
ưc quan tâm úng m$c. Xut phát t3 nh ng lý do trên chúng tôi tin
hành tài lun án tin s: là: “Phân lp, t o t bin im gen P5CS
liên quan n tính chưu h n và thƠ nghim chuyn vào cây u tơng
Vit Nam”.
2. M"c tiêu nghiên c#u
2.1. So sánh trình t gen mã hóa P5CS ca các ging a phương thuc
nhóm chu hn tt và chu hn kém. To ưc t bin loi b# hiu $ng $c
ch phn hi b"i prolin.
2.2. To ưc vector chuy!n gen mang cu trúc liên quan n tính chu hn
" cây u tương.
2.3. To cây u tương mang cu trúc gen liên quan n ;c tính chu hn.

4. 2
3. N$i dung nghiên c#u
3.1. Phân tích ;c i!m sinh lý, hóa sinh ca mt s ging u tương trng
ti khu vc min B6c.
3.2. Phân lp và xác nh trình t gen mã hóa enzyme 1-pyrroline-5
carboxylate synthetase (P5CS).
3.3. To t bin loi b# hiu $ng $c ch phn hi (feedback inhibition)
b"i prolin b%ng phương pháp to t bin i!m.
3.4. Phân lp promoter cm $ng dưi iu kin khô hn rd29A t3 cây
Arabidopsis thaliana. Phân tích hot ng ca promoter da vào hot ng
ca gen GUS " các dòng cây thuc lá chuy!n gen.
3.5. Thit k cu trúc mang gen P5CS t bin ưc iu khi!n b"i
promoter rd29A và chuy!n cu trúc này vào cây thuc lá.
3.6. Phân tích các ch tiêu hóa sinh và kh nng chng chu ca các dòng
thuc lá trong iu kin gây hn nhân to.
3.7. Bin np cu trúc mang gen P5CS vào cây u tương thông qua vi
khu7n Agrobacterium tumefaciens. Phân tích s có m;t ca gen bin np.
4. Nh%ng óng góp m&i c'a lun án
4.1. Gen P5CS ưc phân lp và c trình t t3 hai ging u tương Vit
Nam (DT84 và SL5), có kích thưc 2148 nucleotit, mã hóa 715 axit amin.
4.2. <-to t bin i!m nh hưng " b ba có v trí th$ 125 2a gen
P5CS-2a ging SL5, thay th-Asp b%ng Ala trong =>?nh t-protein, loi b#
hiu $ng $c ch phn hi (feedback inhibition).
4.3. Promoter rd29A <-ưc phân lp thành công t3-cây A.thaliana, 2@-
kích thưc 1298bp mang các trình t ;c trưng gm các nhân t cis thuc
nhóm MYB, DRE, AMYBOX nhân t ;c trưng 2a promoter +,-nhân t-
2m $ng iu kin khô 0n.
4.4. Thit k thành công cu trúc ca promtor rd29A :: GUS và cu trúc
rd29A::P5CSM. Các cu trúc này <-ưc (nh ./(-trong cây thuc lá "
iu kin hn.
4.5. Ti ưu ưc quy trình tái sinh và chuy!n gen thông qua mô nách lá
mm " u tương. Bưc u chuy!n thành công cu trúc gen

5. 3
rd29A::P5CSM vào ging u tương DT84 và thu ưc mt s dòng
dương tính PCR i vi gen chuy!n.
5. Ý ngh(a khoa hc và th)c ti*n
5.1. V khoa h c, lun án là công trình " Vit Nam ã ánh giá ưc kh
nng chng chu hn ca các ging u tương trong iu kin gây hn nhân
to, phân lp và thay 5i cu trúc gen P5CS da vào phương pháp gây t
bin có nh hưng b%ng phn $ng PCR. Các kt qu phân tích gen P5CS
khAng nh r%ng s khác nhau v kh nng chu hn ca các ging u
tương khác nhau là do nhiu yu t quy nh, tuy nhiên hot ng ca gen
P5CS gi vai trò quan tr ng i vi tính chu hn " cây trng.
5.2. V thc tin, nh ng kt qu ánh giá hot ng ca cu trúc chuy!n
gen mang promoter rd29A iu khi!n hot ng ca gen P5CS ã b gây
t bin loi b# hiu $ng phn hi b"i prolin " cây thuc lá ã khAng nh
ý ngh:a thc tin ca lun vn.
Kh nng chng chu ưc ci thin rõ rt " các dòng thuc lá chuy!n gen
mang cu trúc này m bo tính kh thi ca vic $ng dng cy trúc chuy!n
gen này trên các i tưng cây trng khác nh%m ci thin mt trong nh ng
tính trng rt quan tr ng là chng chu hn. Kt qu ban u trong vic
thit lp quy trình chuy!n gen " cây u tương s là tin quan tr ng
trong tin trình to ra các ging u tương mi có tính chu hn cao.
6. C!u trúc c'a lun án
Lun án gm 113 trang, ưc chia thành các phn: Phn M" u gm có 3
trang; Chương 1: T5ng quan tài liu, 34 trang; Chương 2: Vt liu và
Phương pháp, 15 trang; Chương 3: Kt qu và Tho lun, 46 trang; Phân
Kt lun và ngh: 2 trang; Các công trình ã công b ca tác gi: 1
trang. Tài liu tham kho: 11 trang; Lun án có 29 bng s liu, 43 hình và
108 tài liu tham kho b%ng ting Vit và ting Anh.
Chơng 1. T,NG QUAN TÀI LIưU
Lun án ã tham kho và t5ng kt 64 tài liu, trong ó có 10 tài liu
ting vit, 51 tài liu ting Anh và 3 a ch trang web v 5 vn cơ bn
liên quan, như : (1) Gii thiu v cây u tương (Glycine max (L.) Merill),

6. 4
giá tr kinh t và giá tr s8 dng ca cây u tương; (2) Cơ s" sinh lý, hóa
sinh ca ;c tính chng chu hn ca cây u tương; (3) Prolin và vai trò
ca enzym P5CS trong con ưng sinh t5ng hp prolin; (4) Promoter và
vai trò iu khi!n hot ng ca gen trong iu kin hn; (5) Nh ng nghiên
c$u nâng cao kh nng chu hn ca cây u tương.
Prolin ưc bit n là mt trong nh ng cht óng vai trò quan tr ng
trong quá trình i!u chnh áp sut th7m thu khi cơ th! thc vt sng trong
các iu kin bt li như hn, m;n (Delauney and Verma, 1993). Tác dng
bo v các cu trúc ni bào và các i phân t8 khi t bào g;p các iu kin
bt li v áp sut th7m thu; bo v các cu trúc protein và nâng cao hot
tính ca nhiu loi enzyme khác nhau; chng oxy hóa vi ch$c nng phân
c6t các gc oxy phn $ng (reactive oxygen residues) và bt hot các gc
oxy t do (singlet oxygen quencher) (Szavados và tg, 2009). 4 thc vt,
quá trình sinh t5ng hp prolin ưc ki!m soát b"i hot tính ca hai gen mã
hóa cho enzym P5CS. Hai gen này có tương ng rt cao v trình t mã
hóa nhưng bi!u hin li rt khác nhau trong nh ng iu kin khác nhau. C
hai gen P5CS u hot ng " các mô phân sinh ca hoa, ch yu ! cung
cp prolin cho quá trình phát tri!n ca hoa (Mattioli và tg, 2009). Nghiên
c$u trên cây Arabidopsis các nhà khoa h c ã ch$ng minh ưc mi quan
h ch;t ch gi a hot ng ca enzme P5CS và s tích lBy prolin trong
iu kin cây b x8 lý m;n; và hiu $ng $c ch ngưc ca prolin ti hot
tính ca P5CS cBng b nh hư"ng trong các iu kin bt li này. Khi
chuy!n gen P5CS ã b gây t bin loi b# hiu $ng $c ch ngưc b"i
prolin vào cây thuc lá các nhà khoa h c ã nhn ra r%ng các dòng thuc lá
chuy!n gen này tng cưng tích lBy prolin nhiu hơn gp 2 ln so vi các
dòng thuc lá ưc chuy!n gen P5CS ki!u di. Gn ây, gen P5CS phân
lp thành công t3 cây lúa và khi ưc chuy!n tr" li lúa nh%m tng cưng
hot ng ca gen này các nhà khoa h c ã nhn thy r%ng tính chu m;n
và chu lnh ưc ci thin rõ rt.
Promoter rd29A là mt trình t b cm $ng bi!u hin dưi các iu
kin bt li như khô hn, m;n, và lnh ã ưc nhiu nhà khoa h c quan
tâm. Mt s nghiên c$u ã phát hin ưc trình t promoter rd29A ch$a 2
vùng có hot tính cis là vùng cm $ng ABA (ABRE) và vùng cm $ng mt

7. 5
nưc (DRE)/C repeat (CRT). C 2 vùng u liên quan n s bi!u hin các
gen bi!u hin dưi iu kin bt li ca môi trưng (Yamaguchi-Shinozaki
và Shinozaki, 1993). Nhiu phòng thí nghim trên th gii ã phân lp và
ki!m tra hot ng ca promoter rd29A trên nhiu loài cây như A. thaliana,
thuc lá và lúa mì (Sun và Chen, 2002). Cu trúc promoter RD29A iu
khi!n gen ch th GUS ưc chuy!n vào cây khoai tây, mía. Hot tính ca
GUS u ưc phát hin trong cây chuy!n gen dưi iu kin bt li ca
môi trưng nuôi cy (Zhang et al., 2005) .
Có nhiu bin pháp ci thin kh nng chu hn ca cây trng, nh ng
hin nay áp dng k& thut chuy!n gen nh%m tng cưng kh nng chu hn
ca thc vt ang ưc quan tâm nghiên c$u. Có th! nhn nh r%ng tính
kh thi và tim nng $ng dng phương pháp chuy!n gen thc vt như là
bin pháp nâng cao kh nng chu hn ca cây u tương ti Vit Nam là
rt cao.

Chơng 2. VT LIưU -./PHƠNG 012P NGHIÊN C3U
2.1. Vt liu, hóa ch!t, thi4t b5
Vt liu th)c vt: 16 ging a phương và DT84; ging thuc lá 326
(Nicotiana tabacum), và cây Arabidopsis thaliana.
Hóa ch!t nghiên c#u: Vector tách dòng pBT, vector pBI101 dùng mc
ích thit k vector chuy!n gen, vector pTN 289 dùng ! chuy!n gen. Các
c;p mi dùng ! nhân bn gen P5CS và promoter RD29A ưc thit k
da trên trình t gen P5CS và promoter RD29A ng kí trên GeneBank vi
mã s: AY492005, AB428730. Các loi hóa cht dùng cho các thí nghim
nuôi cy mô và sinh h c phân t8 ưc mua t3 các hãng hóa cht: Merk,
Bioneer, Fermentas do Phòng Công ngh t bào thc vt, Vin Công ngh
sinh h c cung cp.
2.2. Phơng pháp nghiên c#u
2.2.1. Phơng pháp sinh lý, hoá sinh
- ánh giá nhanh kh nng chu hn theo phương pháp ca Lê Trn
Bình và ng tác gi nm 1998.

8. 6
- nh lưng protein tan ưc thc hin theo phương pháp Lowry. nh
lưng lipit ưc mô t trong tài liu ca Phm Th Trân Châu. Hàm lưng và
thành phn axit amin trong ht theo Phm Vn Chi và tg (1997).
- Hàm lưng prolin ưc xác nh b%ng phương pháp Bates và tg (1973).
- Phương pháp tính toán và x8 lý s liu theo Nguyn Hi Tut và
Ngô Kim Khôi (1996).
2.2.2. Các phơng pháp s6 d"ng nuôi c!y in vitro
Các phương pháp s8 dng nuôi cy in vitro " cây Arabidopsis, cây thuc lá
theo Topping ,1988. i vi cây u tương tái sinh cây qua a chi t3 nách
lá mm ht chín và quy trình chuy!n gen vào nách lá mm ht chín ưc tin
hành da trên phương pháp ca Olhoft và tg (2001) có ci tin.
2.2.3. Phơng pháp sinh hơc phân t6
Thit k mi da vào trình t ã công b trên GenBank. Quy trình tách
chit DNA t5ng s (i vi Arabidopsic và thuc lá). Phương pháp tách
chit RNA t5ng s: S8 dng b kit Trizol Regents (ca hãng Invitrogen) !
tách chit RNA t5ng s t3 các m9u lá u tương theo ch d9n ca nhà sn
xut. Phương pháp tách chit, tinh sch DNA và RNA.
- Phơng pháp tng hp cDNA. RNA t5ng s ưc s8 dng ! nhân gen
b%ng phương pháp t5ng hơp cDNA, cDNA ưc t5ng hơp theo quy trình
RevertAid
TM
H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas).
- Phn ng PCR. Chu trình nhit ca phn ng PCR: Gen P5CS ưc
khuch i b%ng k& thut PCR vi c;p mi ;c hiu theo chu trình nhit như
sau: 94ºC/5 phút;: 94ºC/30 giây, Tm /45 giây, 72ºC/1 phút 30 giây; 72ºC/10
phút, 35 chu kì. Tin hành phn $ng PCR vi các nhit khác nhau (t3 50 -
62
0
C) ! tìm nhit g6n mi ;c hiu.
- Phơng pháp OE - PCR ( Overlap Extention)
Chu trình nhit ca phn ng PCR: 94ºC/5 phút; 94ºC/30 giây, Tm /45 giây,
72ºC/1 phút 30 giây; 72ºC/10 phút, 4 chu kì. Sau 4 chu k ly sn ph7m ra

9. 7
;t ngay vào á và b5 sung 1µl BamHI và 1µl SaclI thc hin tip phn $ng
theo chu trình nhit sau: 94ºC/5 phút; 94ºC/30 giây, Tm /45 giây, 72ºC/1 phút
30 giây; 72ºC/10 phút, 30 chu kì.
- Phương pháp tách dòng: Tách chit plasmid tái t hp ưc thc hin
theo Sambrook và tg (2001) và tinh sch b%ng Plasmid Miniprep Kit
(Qiagen). Phương pháp s8 dng enzym c6t hn ch thc hin theo
Sambrook và tg (2001)
- Phương pháp PCR trc tip t3 khu7n lc (colony-PCR)
- Thit k cu trúc rd29A :: GUS và rd29A :: P5CSM
--C(c phương pháp phân =Dch cây bin Ep. Kim tra s có mơt ca gen
chuyn bng phơng pháp hóa sinh. Cây thuc F(-chuy!n gen sau khi sng
trong E0,-GDnh ưc x8-FH-0n nhân =o b%ng PEG (Jun và tg 20001). I,m
lưng enzym Gus tip =c ưc J(c nh b%ng phương K0(p 2a Tefferson
và tg (1987)
Chơng 3. KT QU VÀ THO LUN
3.1. K4t qu7 su tp và ánh giá các ging u tơng 5a phơng c'a
t8nh Sơn La.
3.1.1. c i9m hình thái, hóa sinh c'a ht u tơng. Phát hin 16 ging
u tương a phương " 7 huyn " 11 huyn th khác nhau ca tnh Sơn La.
Hàm lưng protein ca các ging dao ng trong khong 29,72%-52,75%
protein/khi lưng khô. Hàm lưng lipit dao ng t3 9,9% - 18,65%. Ging
DT84 cho hàm lưng lipit cao nht là 18,65%, n SL3 (17,34%)
3.1.2. K4t qu7 ánh giá kh7 n:ng ch5u hn c'a các ging u tơng
nghiên c#u. i vi ging SL5 hàm lưng prolin tng cao nht sau khi gây
hn ưc 9 ngày (tng 377,44%). Ging DT84 có tL l tng hàm lưng
prolin " c ba thƠi i!m u thp nht (101,06; 129,26 và 146,81%). Kt
qu nghiên c$u phù hơp vi các nghiên c$u ca các tác gi trên các loài
cây trng khác nhau như lúa (Nguyn H u Cưng và tg), (Do và tg ),

10. 8
(Choudhary và tg 2005), cây h u (Curtis và tg 2004), (Chen và tg
2009).
3.2. Phân lp gen P5CS và $t bi4n i9m loi b; #c ch4 ngc
3.2.1. K4t qu7 phân lp gen P5CS
3.2.2. K4t qu7 khu4ch i, tách dòng và xác 5nh trình t) gen P5CS
RNA t5ng s ã ưc tách chit và t5ng hp cDNA t3 SL5 và DT84. Bn
on gen P5CS ưc nhân lên b%ng PCR và ưc ki!m tra b%ng in di
trên gel agarose 0,8%. Kt qu hình 3.3 cho thy, các on thu ưc có
kích thưc tương $ng vi kích thưc tính toán theo lý thuyt. ! thu ưc
gen P5CS hoàn chnh, hai sn ph7m PCR ưc trn l9n và ưc s8 dng
làm khuôn cho phn $ng PCR vi c;p mi P5CSfor/P5CSrev theo phương
pháp OE-PCR. Sn ph7m PCR thu ưc có kích thưc khong 2100 bp (
Hình 3.4).

Hình 3.3. Kt qu nhân hai on
gen P5CS t3 2 ging u tương
DT84 và SL5
1, 3: ging DT84; 2, 4: ging SL5;
M: Thang DNA chu7n 1 kb.
Hình 3.4. Kt qu PCR ghép ni hai
on gen P5CS t3 2 ging u
tương DT84 và SL5
1, 3: ging DT84; 2, 4: ging SL5;
M: Thang DNA chu7n 1 kb

Kt qu c trình t gen cho thy, sn ph7m gen tách dòng t3 2 m9u nghiên
c$u có kích thưc 2148 nucleotide, mã hoá 715 axit amin. 4 2 v trí 125 và
128 ca P5CS " c ba ging u là axit amin Asp và Phe. ây là hai v trí gây
ra s $c ch hot ng ca enzym P5CS do tng hàm lưng ca prolin trong
t bào (Zhang và tg 1995), (Hong và tg 2000).
1000bp
1500bp

2100bp
M 1 2 3 4
M 1 2 3 4

11. 9
3.2.3. To $t bi4n i9m loi b; hiu #ng #c ch4 ngc < P5CS phân
lp t= cây u tơng
Kt qu hình 3.10 cho thy, các on thu ưc có kích thưc tương
$ng vi kích thưc tính toán theo lý thuyt. Sn ph7m OE-PCR thu ưc
có kích thưc khong 2100bp (hình 3.11). Kích thưc này tương $ng vi
kích thưc ca gen P5CS gc.
2






Hình 3.10. in di sn ph7m PCR
Vi c;p m i P5CS
M125for2/SacI-P5C; Vi c;p mi
P5CS for / P5CS rev ; M : Thang
DNA chu7n 1 kb.
Hình 3.11. Phn $ng ni hai on
gen theo phương pháp OE-PCR vi
c;p mi BamHI-P5CS và Sacl -
P5CS. A, B : 1+2, M:thang DNA
chu7n 1 kb

Nhưng ! bit chính xác gen có to ưc t bin i!m hay không cn phi
ưc c trình t gen. Kt qu ưc th! hin " hình 3.13.
310 320 330 340 350 360 370 380
....|....|....|....|....|....|....|....|....| ....|....|....|....|....|....|....|
MSL5 AACAGCCTTATGGCTCTTTATGATGTTTTGTTTAGTCAGCTGGATG TGACATCTGCTCAGCTTCTTGTGACGGCCAATGA
N S L M A L Y D V L F S Q L D V T S A Q L L V T A N D
SL5 ................................................... ......................A......
N S L M A L Y D V L F S Q L D V T S A Q L L V T D N D
Hình 3.13. Phân tích, so sánh trình t nucleotit và phát hin t bin ti v
trí nucleotit 374 ca gen P5CS
'>?nh t gen này mã hoá cho protein P5CS ca u tương, qua kt qu c
trình t chúng tôi nhn thy nucleotit A " v trí 374 ca mã b ba GAC
2100bp
M
2
1
1800bp
400bp

M A B

12. 10
ưc thay th b%ng nucleotit C ca mã b ba GCC tương $ng trên trình t
protein axit amin " v trí 125 Asp ưc thay b%ng Ala
3.3. Phân lp và ki9m tra hot $ng c'a promotor rd29A c7m #ng khô
hn
3.3.1. Phân lp promoter rd29A
Trên cơ s"-=>?nh t-gen rd29A <-công b-trên ngân 0,ng gen th-gii, c;p
mi rd29A -HindIII / rd29A -BamHI <-ưc thit k-2@-=>?nh t như Mng
3.7. C;p mi này s tách ưc promoter có kích thưc 1290 bp, n%m trưc
codon m" u ca gen ch$c nng rd29A. B%ng k& thut PCR, promoter
rd29A <-ưc phân lp t3-A. thaliana s8 dng c;p mi ;c hiu. Nn ph7m
ưc ki!m tra trên gel agarose cho thy 2@-mt bng duy nht vi GDch
thưc G01ng 1300 bp, tương ương GDch thưc =Dnh =1(n theo FH-thuyt.

1>nh 3.15. in di On ph7m PCR +,-c6t 0n ch-vector pBT/ rd29A
M) Marker; 1) On ph7m PCR; 2) On ph7m c6t b%ng BamHI/HindIII

Nn ph7m PCR ưc g6n +,o vector =(ch )*ng pBT +,-ưc bin
Ep +,o E. coli DH5α. Kt PQ-ch n )*ng b%ng colony-PCR +,-c6t plasmid
b%ng enzym- 0n ch-BamHI/HindIII cho thy On ph7m 2@- GDch thưc
tương ương GDch thưc <-=Dnh =1(n theo FH-thuyt (0?nh 3.15). Như vy
On ph7m PCR <-ưc .0Rp ni =0,nh công +,o vector =(ch )*ng pBT.

13. 11
3.3.2. Phân tích trình t) promoter rd29A
!-bit 20Dnh J(c On ph7m PCR 20Sng tôi <-tin 0,nh c =>?nh t-
nucleotide. Kt PQ-thu ưc so O(nh vi 2(c =>?nh t-gen trên Ngân 0,ng
gen 20Dnh cho thy sn ph7m F,-promoter rd29A-2a A.thaliana.
Khi phân =Dch =>?nh t-thu ưc cho thy promoter phân lp 2@-chiu
dài 1290 bp, ch$a 2(c box =>?nh t-cn thit cho promoter iu 0*a bi!u
hin gen như TATA; CCAAT box--+Tng ./,u GC (GGGCCAATAG), Cap
signal và các vùng liên quan qu trình phiên mã (-10 và -35). U.1,i ra 2*n
ch$a 2(c +Tng liên quan n 2m $ng iu kin khô 0n DRE, ABRE (0?nh
3.16). Kt PQ- E,y phù hơp vi công b- 2a Wu và tg. (2008) +,-
Shinozaki và tg (2007).
Sau khi ã tách dòng và xác nh trình t promoter rd29A s8 dng
phn mm chuyên dng ! phân tích trình t on promoter ã tách dòng
ưc. Kt qu nhn thy r%ng trên on trình t promoter rd29A phân lp
trong nghiên c$u này có ch$a các nhân t cis thuc nhóm MYB, DRE,
AMYBOX. Các nhân t cis này ã ưc khAng nh là ;c hiu cho các
promoter iu khi!n bi!u hin ca gen dưi các iu kin bt lơi như hn,
mt nưc và m;n.ã phân lp thành công promoter rd29A, on gen dài
1290bp ch$a các nhân t cis ;c hiu, s8 dng on gen ! thit k vector
phân tích quá trình bi!u hin ca promoter dưi iu kin hn.
gaatgagaaggatgtgccgtttgt tataat
aaac
-10
agccacacgacgtaaacgtaaaatgaccacatgat gggccaatagacatggaccga
CCAAT box và vùng già u GC
ctactaataatagtaagttacattttaggatggaataaatatca TACCGACATcag
DRE- 1
ttttgaaagaaaagggaaaaaaagaaaaaataaataaaagatatac TACCGACATg
-35 DRE -2
agttccaaaaagcaaaaaaaaagatcaagccgacacagacacgcgtagaga gcaaaatgactttgacgtcacaccacgaaaacagacg
cttcatACGTGTCcctttatctct
ABRE
ctcagtctctctataaacttagtgagaccctcctctgttttactcacaaatatgca
Cap signal TATA box
aactagaaaacaatcatcaggaataaagggtttgattacttctattgga
1>nh 3.16. Phân =Dch =>?nh t-promoter rd29A

14. 12
3.3.3. Thi4t k4 vector chuy9n gen mang c!u trúc rd29A
!-ki!m tra G0-nng iu khi!n 2a promoter thu ưc, promoter
rd29A ưc thit k-+,o vector pBI101 iu khi!n s bi!u hin gen 20-=0-
GUS. Kt PQ-ki!m tra b%ng PCR +,-c6t b%ng enzym-0n ch-BamHI/SacI
cho thy vector =(i t5-hp thu ưc ch$a 1n promoter rd29A (0?nh 3.18)
có GDch thưc như mong mun.

1>nh 3.18. in di On ph7m PCR +,-c6t 0n ch-vector pBI101/ rd29A
M) Marker; 1-2) On ph7m PCR; 3-4) On ph7m c6t b%ng BamHI/SacI
Vector =(i t5-hp thu ưc bin Ep +,o 20ng vi khu7n
Agrobacterium C58, ây O-F,-nguyên liu cho chuy!n gen +,o thc vt, !
(nh ./(-G0-nng iu khi!n 2a promoter b%ng m$c -bi!u hin GUS
dưi iu kin x8-FH-0n.
3.3.4. To cây thuc lá chuy9n gen mang c!u trúc rd29A :: GUS

1. Mnh lá thuc lá trên môi
trưng cm $ng GM sau 2
ngày
2. Mnh lá ngâm
trong dch huyn
phù vi khu7n
3. Mnh lá trên môi
trưng cng sinh
sau
2 ngày

15. 13


4. Mnh lá trên môi trưng
GM + 50 mg/l Kanamycine +
400 mg/l Cefotaxime sau 1
tháng
5. Cm chi trên
môi trưng GM +
50 mg/l
Kanamycine + 400
mg/l Cefotaxime sau
1 tháng
6. Cây con trên môi
trưng RM + 50
mg/l Kanamycine +
400 mg/l
Cefotaxime
sau 1 tháng

7. Ra cây trong bu tru: cát 8. Trong bu t 9. Ra nhà lưi
Hình 3.19. Hình nh chuy!n cu trúc promotor rd29A vào thuc lá
ánh giá ho t ng ca promtor RD29A trong cây thuc lá chuyn gen
Kt qu thu ưc 51 dòng cây thuc lá tái sinh trên môi trưng ch$a
kanamycin. Ki!m tra 22 dòng cây b%ng phn $ng PCR vi c;p mi ;c hiu
rd29A -HindIII/ rd29A -BamHI cho thy có 21 dòng mang gen chuy!n
rd29A. ! ánh giá hot ng iu khi!n s bi!u hin gen GUS ca promoter
rd29A, chúng tôi ch n ng9u nhiên 3 dòng cây dương tính vi PCR và tin
hành x8 lý hn nhân to b%ng 10% PEG (polyethylene glycol). Kt PQ-cho
thy dưi iu kin thiu nưc bi!u hin GUS " các dòng thuc lá chuy!n gen
G0(-Vnh +,->W->,ng so vi các dòng cây chuy!n gen không x8-FH-và cây i
ch$ng (0?nh 3.20).

16. 14


0
100
200
300
400
500
600
700
800
DCT DCS 3T 3S 4T 4S 5T 5S
Mu
Lư n g M U (p m o l / m i n . m g )

1>nh 3.20. Bi!u hin gen GUS trên
cây chuy!n gen
A: Cây i ch$ng không chuy!n
gen có x8 lý hn; B: Cây chuy!n
gen không x8- FH- 0n; C: Cây
chuy!n gen sau x8-FH-0n 24 giƠ.

1>nh 3.21. Hot tính ca enzym
GUS " các dòng cây thuc lá
chuy!n gen mang promoter rd29A
trong iu kin hn nhân to
C: m9u cây i ch$ng không
chuy!n gen; 3, 4, 5: các dòng cây
chuy!n gen, T: trưc x8 lý hn, S:
sau x8 lý hn.

Hot tính ca enzym GUS còn ưc xác nh thông qua phn $ng chuy!n hóa
cơ cht (MUG). Enzym GUS xúc tác cho phn $ng chuy!n hóa MUG thành
MU, hot tính ca gen enzym GUS càng mnh thì MU ưc to ra càng
nhiu. MU ưc phát hin b%ng phép o hp th " bưc sóng 378 nm (
Fior và tg 2009). Lưng MU o ưc sau x8 lý hn cao hơn so vi trưc x8
lý hn t3 6 - 13 ln ( hình 3.21). Nh ng s liu này hoàn toàn thng nht vi
công b ca (Zhang và tg 2005)
3.4. ánh giá kh7 n:ng t:ng cng kh7 n:ng ch5u hn c'a cây thuc lá
chuy9n gen mang c!u trúc rd29A:: P5CSM
3.4.1. Thi4t k4 vector chuy9n gen mang c!u trúc rd29A:: P5CSM
Kt qu c6t P5CSM và rd29A :: GUS b%ng BamHI và SacI. Và thc hin
phn $ng ghép ni . b%ng enzym T4 ligaza +,-bin np sn ph7m ghép ni
vào t bào kh bin E.coli chng DH5α,

17. 15

A B

Hình 3.23. in di On ph7m clony- PCR +,-c6t 0n ch-vector pBT
rd29A:: P5CSM
Kt qu ca phn $ng c6t b%ng enzym gii hn và colony-PCR (Hình
3.23) ã khAng nh ch6c ch6n c 3 dòng khu7n lc u có ch$a vector
chuy!n gen, ngh:a là chúng tôi ã thit k thành công cu trúc gen chuy!n
mang gen chu hn rd29A:: P5CSM ưc .0Rp ni =0,nh công +,o vector
=(ch )*ng pBT.
K4t qu7 bi4n np vector chuy9n gen rd29A:: P5CSM vào A.
tumefaciens
Kt qu PCR ưc in di ki!m tra trên gel agarose 0,8% cho thy:
có 4 trong 9 dòng khu7n lc ưc la ch n cho kt qu dương tính vi
phn $ng PCR vi 1 bng duy nht có kích thưc khon 1300 bp.
iu này ch$ng t# ã bin np thành công vector rd29A:: P5CSM vào
t bào A. tumefaciens.. Như vy chúng tôi ã to ưc chng A.
tumefaciens pGV2260 mang plasmid tái t5 hp rd29A:: P5CSM. ây
chính là ngun nguyên liu phc v cho mc ích chuy!n gen to cây
trng chng chu hn.
3.4.2. To cây thuc lá chuy9n gen mang c!u trúc rd29A:: P5CSM
Cu trúc chuy!n gen pBI101 mang promoter rd9A iu khi!n hot
ng ca gen P5CS ưc chuy!n vào mnh lá cây thuc lá ging K326
1 2 3 M
M 1 2 3 - +
1.3kb
12kb
3,4kb

18. 16

Hình 3.25. Kt qu PCR các dòng chuy!n gen b%ng c;p mi rd29A for
/rd29Arev
M: Marker DNA 1kb; 1-9: Các dòng chuyn gen; (-) i chng âm; (+)
i chng dơng
Hình 3.25 cho thy, trong s 33 dòng ki!m tra thu ưc 30 dòng cho
phn $ng dương tính, các ging xut hin mt vch AND có kích thưc
khong 1,4kb. ây là kích thưc tương $ng ca promoter rd29A. iu này
ch$ng t# các dòng cây này có mang cu trúc rd29A:: P5CSM mong mun.
3.4.3. ?nh @A?/BC7/n:ng DC5u Cn D'a D?c EFng thuc G?/chuy9n gen.
Các m9u F(-2a 2(c )*ng thuc F(-chuy!n gen +,-i ch$ng <-ưc
thu trưc gây 0n +,-sau khi gây 0n 3, 5, 7 +,-9 E.,y. C(c m9u ưc =(ch
chit +,-ki!m tra 0,m lưng prolin. Kt PQ-=>?nh M,y "-Mng 3.7-+,-0?nh
3.25. Sau khi gây 0n nhân =o, 0,m lưng prolin tng rt Vnh so vi
trưc gây 0n " tt 2-2(c )*ng cây nghiên c$u, ;c bit 2(c )*ng cây
chuy!n gen. Sau 9 E.,y gây 0n, prolin "-cây i ch$ng không chuy!n gen
tng 206.8%, trong khi @-vi cây chuy!n gen tng t3-259,5-451,8% (cao
nht "-)*ng H33 +,-thp nht )*ng H11).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 - +

19. 17

Hình 3.27. Các dòng cây thuc lá sau 20 ngày hn nhân to (A) +,-sau K0c
hi (B)
WT: cây i chng không chuyn gen, H11, H15, H26, H33: c ng cây
chuyn gen
3.5. K4t qu7 to cây u tơng chuy9n gen
3.5.1. K4t qu7 tái sinh to a chHi < ging u tơng DT84
3.5.1.1. Ti u thi gian khƠ trùng h t
So sánh hai phương pháp kh8 trùng (b%ng khí clo và b%ng Javen), chúng tôi
nhn thy phương pháp kh8 trùng b%ng khí clo ã t# ra ưu th hơn, vì vy
chúng tôi la ch n phương pháp kh8 trùng này trong thƠi gian kh8 trùng là
16 giƠ ! kh8 trùng ht thu nguyên liu cho các thí nghim tip theo.
3.5.1.2. nh hng ca BAP n kh nng t o a chi t lá mơm h t
chín
Các m9u này sau khi gây t5n thương và c6t b# nh sinh trư"ng, chúng
ưc to a chi trên 8 loi môi trưng (SIM0-SIM7) ch$a nng BAP
t3 0mg/l n 2,5 mg/l. Như vy chúng tôi la ch n nng BAP là 2 mg/l
(SIM4) ! b5 sung vào môi trưng to a chi và s8 dng kt qu này cho
các thí nghim tip theo.
3.5.1.3. nh hng ca hocmon sinh trng GA3,ti kh nng kéo dài
chi. Các cm chi to trên môi trưng SIM4 ưc chuy!n sang 4 môi
trưng (SEM0-SEM3) có b5 sung GA3 vi các nng tương $ng là 0,5

20. 18
mg/l, 1 mg/l và 1,5 mg/l Nh ng kt qu thu ưc nhn thy s phi hơp gi a
GA3 (0,5 mg/l) là thích hơp cho quá trình kéo dài chi. Kt qu này cBng phù
hơp vi mt s kt qu nghiên c$u ca các tác gi khác ã công b (Olhoft và
tg 2007), Olhoft và tg 2001)
3.5.1.4. nh hng ca IBA n hiu qu t o r. Nng IBA chúng tôi
ã nghiên c$u nhn thy 0,1 mg/l là nng thích hơp nht cho vic ra r
ca cây u tương in vitro ging DT84.
3.5.1.5. Xác ưnh giá th thích hp cho ra cây in vitro
Th8 nghim 3 loi giá th! khác nhau là: tru hun, 1 tru hun:1 cát vàng và
hXn hơp trng cây có bán sYn. Hai yu t ưc ánh giá trong thí nghim
này là t l sng ca cây con và cht lưng cây con. Cn c$ vào cht lưng
cây con kt qu nhn thy vi tL l giá th! là 1 tru hun: 1 cát vàng là phù
hơp..Sau hai tun chúng tôi chuy!n ra t.
3.5.2. K4t qu7 b&c Iu chuy9n gen GUS vào cây u tơng DT84. TL
l bi!u hin tm thƠi gen gus thu ưc là 67,5%. TL l m9u sng sót sau 2
tun trên môi trưng ch n l c là 15,21%.
3.5.3. K4t qu7 chuy9n c!u trúc gen ch5u hn vào u tơng
Thí nghim ưc tin hành trên 3 lô thí nghim vi t5ng s 1262 m9u ưc
s8 dng cho chuy!n gen, có 564 s m9u to chi, 101 s m9u kéo dài chi,
trong quá trình ch n l c kháng sinh có 28 cây sng sót ra r và trng " nhà
lưi. ! ki!m tra s có m;t ca gen chuy!n, sau khi ra cây khong 1 tháng,
m9u lá ca các dòng cây T0 ưc tin hành thu ! tách chit DNA t5ng s.
Kt qu in di sn ph7m PCR cho thy ã thu nhn ưc 3 cây dương tính
vi phn $ng PCR.

21. 19

Hình 3.36. Ki!m tra cây u tương T0 chuy!n gen b%ng PCR
M: Thang DNA chu n 1kb; (-): i chng âm; WT: Cây không chuyn
gen; 1 -4: Các dòng T0 c phân tích; (+): i chng dơng (plasmid)



Dòng 11 Dòng 23 Dòng 17


Hình 3.37. Cây u tương T0 chuy!n gen

KT LUN VÀ J NGH
1. K4t lun
1.1. Ging u tương a phương sưu tp ưc có s a dng và phong phú
v hình thái, kích thưc và khi lưng ht. Phân tích v ch tiêu hóa sinh
cho thy các ging u tương a phương có cht lưng và kh nng chu
hn cao hơn so vi ging i ch$ng. ã xác nh ưc mi liên quan gi a
tL l tng hàm lưng prolin và kh nng chu hn ca các ging u tương
trong phm vi nghiên c$u.
1.2. Trình t gen P5CS ca hai ging u tương DT84 và SL5 <-ưc
phân lp gm có 2148 nucleotit, mã hóa 715 axit amin.
M 1 2 3 4 5 WT - +

22. 20
1.3. <-to t bin " b ba có v trí th$ 125 2a gen P5CS 2a ging u
tương SL5, thay th-Asp b%ng Ala trong =>?nh t-protein.
1.4. Promoter rd29A <- ưc phân lp thành công t3-cây A.thaliana.
Promotor rd29A-2@-chiu dài 1298bp mang các trình t ;c trưng gm các
nhân t cis thuc nhóm MYB, DRE, AMYBOX nhân t ;c trưng 2a
promoter +,-nhân t-2m $ng iu kin khô 0n.
1.5. Z0-nng hot ng ca promtor rd29A <-ưc (nh ./(-trong cây
thuc lá chuy!n gen. Trong iu kin thiu nưc, promoter rd29A <-iu
khi!n gen ch th GUS bi!u hin G0(-Vnh +,->W->,ng " các dòng thuc lá
chuy!n gen ưc x8-FH-b"i 0n nhân =o so vi các dòng cây chuy!n gen
không x8-FH-và cây i ch$ng.
1.6. i vi 2(c )*ng cây thuc lá chuy!n gen mang cu trúc rd29A::
P5CSM , 2@-hin tưng tng cao 0,m lưng prolin sau khi gây 0n nhân
=o, d9n n G0-nng sng O@t cao hơn 2(c cây i ch$ng (không chuy!n
gen). Z0-nng K0c hi ca 2(c )*ng cây chuy!n gen nhanh hơn 2(c cây
i ch$ng.
1.7. Ti ưu ưc quy trình tái sinh và chuy!n gen thông qua mô nách lá
mm " u tương. Bưc u chuy!n thành công cu trúc gen rd29A::
P5CSM vào ging u tương DT84, và thu ưc mt s dòng dương tính
PCR i vi gen chuy!n.
2. ngh5
2.1. Tip tc nghiên c$u, phân =Dch các dòng cây u tương chuy!n gen
chu hn phc v cho ch n to ging.
2.2. M" rng s8 dng cu trúc promoter rd29A:: GUS và rd29A:: P5CSM
vào các i tưng cây trng khác.