I M U N O F L U O R E S C E N C I A

Aula prática de Imunologia ICS - UFBA: Imunofluorescencia

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃO DISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045 IMUNOFLUORESCÊNCIA Trabalho realizado pela Acadêmica de Medicina Veterinária da UFBA Aretha Alves Borges da Silva sob orientação dos Professores Robert Schaer , Roberto Meyer, Claudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.

2. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

3. A imunofluorescência permite a detecção e localização de antígenos em células e tecidos utilizando anticorpos específicos , marcados com fluorocromos , de modo que a localização dos antígenos se torna visível ao microscópio de fluorescência . De acordo com o mesmo princípio , podemos detectar e localizar anticorpos em fluidos biológicos usando seu antígeno correspondente . CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

4. Baseia -se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno . Teste qualitativo /semi- quantitativo . Método de alta sensibilidade e alta especificidade . CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

5. FLUOROCROMOS: Nos testes de imunofluorescência são empregados conjugados constituídos de anticorpos ligados covalentemente a moléculas reveladoras denominadas fluorocromos . 1941: primeira vez que anticorpos foram conjugados com fluorocromos . Fluorocromos são substâncias que absorvem luz ultravioleta e emitem luz visível, ou seja, ficam fluorescentes. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

6. FLUOROCROMOS: São utilizados vários fluorocromos diferentes nos laboratórios clínicos para imunofluorescência . Isotionato de fluoresceína e compostos da rodamina são os fluorocromos mais usados para conjugação com anticorpos para torná-los fluorescentes sob condições adequadas de iluminação. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

7. MICROSCÓPIO DE EPIFLUORESCÊNCIA : A reação imunofluorescente que é desencadeada no microscópio de epifluorescência ocorre através da emissão de luz de cor quando o fóton é excitado por luz de curto comprimento de onda (UV). Para deixar passar somente a emissão secundária desejada, devem-se utilizar filtros apropriados dependendo da cor do fluorocromo . CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

8. DIRETA INDIRETA Detecção de Ag Detecção de Ac Detecção de Ag CARACTERÍSTICAS BÁSICAS TIPOS DE REAÇÃO:

9. IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)

10. O anticorpo específico marcado com Fluorocromo (conjugado) é adicionado e se fixa ao antígeno, formando um imunocomplexo estável. IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD) O anticorpo não ligado é removido por lavagens. O preparado é observado em microscópio de fluorescência. Y Y Y Y Y Y Y Antígeno pesquisado Conjugado

11. VANTAGENS Alta especificidade e sensibilidade Possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização. DESVANTAGENS Alto custo do microscópio de fluorescência Necessidade de um conjugado para cada antígeno que se deseja identificar ou localizar Subjetividade da leitura IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)

12. APLICAÇÕES Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais. Em bacteriologia , um dos poucos métodos de IFD ainda usados em laboratória clínico é a identificação do Streptococcus do grupo A. IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)

13. IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)

14. PARA A PESQUISA DE ANTÍGENOS IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) Incuba-se a célula ou tecido em que se quer pesquisar o antígeno com o anticorpo específico obtido em animal ou um monoclonal, levando à formação de um imunocomplexo . Realiza-se lavagem para retirada do anticorpo não ligante excedente. O preparado é observado em microscópio de fluorescência. Y Y Y Y Y Y A preparação é incubada com um conjugado antiimunoglobulina , marcado com fluorocromo, produzido em outra espécie de animal. Y Y Y Y Antígeno pesquisado Conjugado Anticorpo Monoclonal Y Y

15. Antígenos padronizados são fixados a lâminas de vidro. IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) PARA A PESQUISA DE ANTICORPOS Realizam-se lavagens para a retirada dos anticorpos não ligados. O soro do paciente é diluído, colocado sobre o antígeno e incubado para permitir a formação do complexo antígeno-anticorpo. A preparação é incubada com o conjugado fluorescente e, se houver anticorpo no soro, o conjugado reage com o anticorpo específico para o antígeno. Observa-se o preparado em microscópio de fluorescência. Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Antígeno padronizado Conjugado Anticorpo pesquisado Y Y

16. VANTAGENS Sensibilidade Especificidade Reprodutibilidade De simples padronização e execução O mesmo conjugado pode ser usado em sistemas diferentes Para determinar as classes e subclasses de anticorpos são utilizados conjugados específicos DESVANTAGENS Necessidade de microscópio de fluorescência Subjetividade na leitura Não-automação IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)

17. APLICAÇÕES Medicina humana Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes. Medicina Veterinária Toxoplasmose, Neosporose , Raiva, Campilobacteriose Genital Bovina. IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)

18. As técnicas de imunofluorescência ainda são empregadas na rotina laboratorial, mas estão sendo gradativamente substituídas por testes imunoenzimáticos , principalmente devido à necessidade de microscopia, subjetividade de leitura e impossibilidade de automação. CONSIDERAÇÕES FINAIS