ICSA17 Imunologia (Prática) - Imunoprecipitação

Aula prática de Imunoprecipitação

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE –ICS
DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃO
DISCIPLINA: IMUNOLOGIA I –ICS 045
Trabalho realizado pelo Mestrando em Ciências Animais nos Trópicos Dan Loureiro
Nascimento sob orientação do Prof. Dr. Ricardo Wagner Dias Portela do Laboratório
de Imunologiae Biologia Molecular (LABIMUNO). Atualizado em Fevereiro de 2010.
TEIXEIRA, A.C.O.; Ferreira, M.A.S.V. e Marques, A.S.A.. Detecção de Erwinia psidiivia enriquecimento
em extrato de folhas de goiabeira e imunodifusão radial dupla.Tropical Plant Patology, vol. 33, nº 3.
Brasilia, Junho de 2008.

2. http://www.analiselaboratorios.com.br/imagem/prodts/014.jpg

3. •Teste utilizado para detectar a presença de anticorpo (ac) específicos
em fluidos corporais
•Possui boa especificidade, porém apresenta falhas de sensibilidade
•A formação do complexo ag/ace sua precipitação permite a
visualização do teste
•Facilidade de confecção do teste
•Antígeno e anticorpo são colocados em meio sólido ou líquido,
interagem e precipitam formando uma linha de precipitação, que
indica a presença do anticorpo no soro.

4. •Utiliza-se, em geral, uma placa de Petri, lâmina de microscopia ou
placa de poliestireno onde se adiciona o gel contendo ou não
antígeno,
•O gel geralmente é composto de agaroseou ágarnobre (a depender
do teste e o tipo de malha e afinidade eletrônica que o mesmo exige).
Depois de preparado e colocado na placa o gel é perfurado e nestes
poços anticorpo e/ou antígeno são colocados, de onde se difundirão.
•Na região onde o antígeno e o anticorpo se encontrarem (zona de
precipitação) formar-se-á uma linha de precipitação que indica a
positividade da amostra e/ou controle,
•É um método qualitativo (na medida em que indica um resultado
através da presença ou não das zonas de precipitação).

5. oElementos necessários para a realização:
•Gel de Agaroseou Ágar(o gel pode ser impregnado com Acou não a
depender do tipo de imunodifusão),
•Antígeno purificado (imunodifusãodupla),
•Anticorpo purificado (controle positivo),
•Amostras a serem testadas,
•Placa de poliestireno, Petri, ou lâmina de microscopia,
•Cuba de eletroforese horizontal.

6. http://www.analiselaboratorios.com.br/imagem/prodts/014.jpg
oElementos necessários para a realização:
Placas Imunodifusão
Cuba de eletroforese horizontal
Placa de Petri
Acervo pessoal.
http://www.biomol.com.br/Imagens/Fotos/%7B1isqt6495xo2bv02u0i43
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2014.JPG
http://eximlab.com.br/images/fotos/fotop_DGH12_3.jpg

7. oVantagens
•É um método de fácil execução,
•Não necessita de aparato sofisticado,
•Teste com boa especificidade (característica que indica que o
teste em questão identificará somente o ag ou ac desejado) –
menor risco de falsos-positivos,
•Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo,
•Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo em
comparação com outras técnicas.

8. oDesvantagens
•Falhas em sensibilidade, o que indica um alto risco de falsos
negativos,
•É um teste que apresenta alguns problemas com a
reprodutibilidade,
•Apesar de ser um texte de rápida execução, o tempo de
incubação é muito grande, de 24 até 72 horas em alguns casos.
•Difícil peservação do gel
•Não aplicável a alguns isotipos de imunoglobulinas.

10. EM MEIO SEMI-SÓLIDO
•IMUNODIFUSÃO RADIAL: dosagem de acou ag
•IMUNODIFUSÃO DUPLA: detecção de ac
•IMUNOELETROFORESE: avaliação de imunoglobulinas

11. Zona de excesso
de anticorpo
Zona de
equivalência
Zona de excesso
de antígeno
+ - -
+- -
Anticorpo livre
Antígeno livre
Precipitaçã
o de
anticorpo
Quantidade de antígeno adicionado

12. 1) A placa se encontra cheia de
gel impregnado com um
anticorpo específico,
2) Coloca-se os controles
positivos e as amostras a
serem testadas nos poços
perfurados no gel,
3) Incuba-se a placa por 48
horas,
4) Os halos (zona de
equivalência) formados em
tono dos poços são medidos,
Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio
Didático –UCG –Go.
Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio
Didático –UCG –Go.

13. oInterpretação dos resultados:
•Durante a incubação ocorre a difusão do antígeno na agarose e a formação
de complexos ag-ac.,
•Os complexos precipitam e formam um
halo ao redor do orifício,
•Existe uma relação linear entre o
quadrado do diâmetro do halo (d
2
) e a
concentração do antígeno,
•Utilizando antígeno de concentrações
conhecidas pode-se fazer uma curva
padrão, permitindo determinar a
concentração em amostras
desconhecidas.
http://www.anflalab.com.br/images/Hoja%20Diffuplate%20051.jpg
Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de
Apoio Didático –UCG –Go.
Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático –UCG –
Go.

14. oAplicações na medicina humana e veterinária:
•Diagnóstico de doenças infecto-contagiosas, onde a detecção de
imunoglobulinas e proteinas séricas seja significativa
•Exemplos: dosagem de imunoglobulinas e proteina séricas (tanto em
humanos como em animais).

15. Acervo Pessoal.
1) O gel de agaroseou agaré
preparado e colocado na
placa,
2) Após a solidificação do gel,
poços são perfurados com um
molde (perfurador ou roseta),
3) adiciona-se antígeno ,
controle positivo e a amostra
a ser testada nos poços
perfurados,
4) Incuba-se a placa por 48
horas.
5) Os complexos ac-ag se
formam e precipitam
formando linhas de
precipitação que indicam o
resultado.
Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático –UCG –Go.
Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático –UCG –Go

16. oInterpretação dos resultados:
•A formação e localização da banda de
precipitação indicam a presença de ac
bem como sua concentração em relação
ao ag,
•Quanto mais perto do ag maior a
concentração de ac na amostra .
Acervo pessoal.

17. oAplicações na medicina humana e veterinária:
•Muito usado no diagnóstico de doenças infecto-contagiosas,
•Exemplos na Medicina Humana: Candidísase, Histoplasmose e
Aspergilose
•Exemplos na Medicina Veterinária: Doença de Maedi-visna, Brucella
ovis.

18. 1) O gel é preparado e
perfurado após sua
solidificaçação,
3) É colocado o ac e/ou ag (a
depender do tipo de
imunoeletroforese) nos poços
ou canaleta perfurados,
4) O gel numa cuba de
eletroforese horizontal,
5) É aplicada carga no gel, esta
carga é a responsável pela
migração de ag,
7) Ac e ag formam arcos de
precipitação no gel
2) O pH do gel éescolhido de
forma que partículas
negativas migrem para o
eletrodo positivo,
6) É cortada uma canaleta
entre os poços, a qual será
preenchida com ac,
BURMESTER, G.R.; Pezzutto, A.. Color Atlas of Immunology. Thieme, Germany, 2003.

19. oInterpretação dos resultados:
•Proteínas podem ser identificadas baseado na intensidade, forma e posição
das linhas de precipitação,
•Cada arco de precipitação representa um antígeno.
Imunoeletroforese
Rocket Eletroforese

20. oAplicações na Medicina Humana e Veterinária:
•Utilizada em pacientes com suspeitas de gamopatias monoclonais e
policlonais. Imunoglobulinas policlonais são distribuídas uniformemente
através da fração de gama-globulina depois da separação eletroforética.
•Diagnóstico sorológico de algumas doenças
•Exemplo na Medicina Humana: detecção de ac e ag bacterianos
(Meningite e Septicemia), Cisticercose.
•Exemplo na Medicina Veterinária: cisticercose, alérgenos.

21. •BURMESTER,G.R.;Pezzutto,A..ColorAtlasofImmunology.Thieme,Germany,2003.
•ROITT,I.M.;Rabson,A.;Delves,P.J..ReallyEssentialMedicalImmunology.Ed–2.
BlackwellPublishing.Massachusetts–USA,2005.
•TEIXEIRA,A.C.O.;Ferreira,M.A.S.V.eMarques,A.S.A..DetecçãodeErwiniapsidiivia
enriquecimentoemextratodefolhasdegoiabeiraeimunodifusãoradialdupla.Tropical
PlantPatology,vol.33,nº3.Brasilia,Junhode2008.
•http://www.analiselaboratorios.com.br/imagem/prodts/014.jpg
•http://pathmicro.med.sc.edu/Portuguese/13.GIF
•http://eximlab.com.br/images/fotos/fotop_DGH12_3.jpg
•http://www.biomol.com.br/Imagens/Fotos/%7B1isqt6495xo2bv02u0i43dlgfdrxh4%7D
_Cubas%20de%20Eletroforese%20Horizontal%2014%20x%2014.JPG
•http://www.anflalab.com.br/images/Hoja%20Diffuplate%20051.jpg
•http://www.fcf.usp.br/Ensino/Graduacao/Disciplinas/LinkAula/imunoprecipitacao.pdf
•http://www.unirio.br/DMP/Graduacao/Medicina/Imunologia/Ag-
Ab%20Reactions.pdf
•http://www.scielosp.org/img/revistas/rsp/v12n1/11f1.gif