ICSA17 - Reações de Imunoprecipitação

Aula Imunoprecipitação

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS
DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃO

Trabalho realizado pelo Mestrando em Ciências Animais nos Trópicos Dan Loureiro
Nascimento sob orientação do Prof. Dr. Ricardo Wagner Dias Portela do Laboratório
de Imunologia e Biologia Molecular (LABIMUNO). Atualizado em Fevereiro de 2011.
TEIXEIRA, A.C.O.; Ferreira, M.A.S.V. e Marques, A.S.A.. Detecção de Erwinia psidii via enriquecimento
em extrato de folhas de goiabeira e imunodifusão radial dupla. Tropical Plant Patology, vol. 33, nº 3.
Brasilia, Junho de 2008.

2. http://www.analiselaboratorios.com.br/imagem/prodts/014.jpg

3. • Teste utilizado para detectar a presença de anticorpo (ac) específicos
em fluidos corporais

•Possui boa especificidade, porém apresenta falhas de sensibilidade

•A formação do complexo ag/ac e sua precipitação permite a
visualização do teste

•Facilidade de confecção do teste

• Antígeno e anticorpo são colocados em meio sólido ou líquido,
interagem e precipitam formando uma linha de precipitação, que
indica a presença do anticorpo no soro.

4. • Utiliza-se, em geral, uma placa de Petri, lâmina de microscopia ou
placa de poliestireno onde se adiciona o gel contendo ou não
antígeno,
•O gel geralmente é composto de agarose ou ágar nobre (a depender
do teste e o tipo de malha e afinidade eletrônica que o mesmo exige).
Depois de preparado e colocado na placa o gel é perfurado e nestes
poços anticorpo e/ou antígeno são colocados, de onde se difundirão.
•Na região onde o antígeno e o anticorpo se encontrarem (zona de
precipitação) formar-se-á uma linha de precipitação que indica a
positividade da amostra e/ou controle,
• É um método qualitativo (na medida em que indica um resultado
através da presença ou não das zonas de precipitação).

5. o Elementos necessários para a realização:

• Gel de Agarose ou Ágar (o gel pode ser impregnado com Ac ou não a
depender do tipo de imunodifusão),

• Antígeno purificado (imunodifusão dupla),

•Anticorpo purificado (controle positivo),

• Amostras a serem testadas,

• Placa de poliestireno, Petri, ou lâmina de microscopia,

•Cuba de eletroforese horizontal.

6. http://www.analiselaboratorios.com.br/imagem/prodts/014.jpg
o Elementos necessários para a realização:

Placas Imunodifusão
Cuba de eletroforese horizontal
Placa de Petri
Acervo pessoal.
http://www.biomol.com.br/Imagens/Fotos/%7B1isqt6495xo2bv02u0i43
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2014.JPG
http://eximlab.com.br/images/fotos/fotop_DGH12_3.jpg

7. o Vantagens
• É um método de fácil execução,

•Não necessita de aparato sofisticado,

• Teste com boa especificidade (característica que indica que o
teste em questão identificará somente o ag ou ac desejado) –
menor risco de falsos-positivos,

•Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo,
• Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo em
comparação com outras técnicas.

8. oDesvantagens
• Falhas em sensibilidade, o que indica um alto risco de falsos
negativos,

•É um teste que apresenta alguns problemas com a
reprodutibilidade,

•Apesar de ser um texte de rápida execução, o tempo de
incubação é muito grande, de 24 até 72 horas em alguns casos.

•Difícil peservação do gel

• Não aplicável a alguns isotipos de imunoglobulinas.

10. EM MEIO SEMI-SÓLIDO
•IMUNODIFUSÃO RADIAL SIMPLES: dosagem de ac ou ag
• IMUNODIFUSÃO RADIAL DUPLA: detecção de ac
•IMUNOELETROFORESE: avaliação de imunoglobulinas

11. Zona de excesso
de anticorpo
Zona de
equivalência
Zona de excesso
de antígeno
+ - -
+ - -
Anticorpo livre
Antígeno livre


Precipitaçã
o de
anticorpo
Quantidade de antígeno adicionado

12. 1) A placa se encontra cheia de
gel impregnado com um
anticorpo específico,
2) Coloca-se os controles
positivos e as amostras a
serem testadas nos poços
perfurados no gel,
3) Incuba-se a placa por 48
horas,
4) Os halos (zona de
equivalência) formados em
tono dos poços são medidos,
Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio
Didático – UCG –Go.
Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio
Didático – UCG –Go.

13. o Interpretação dos resultados:
• Durante a incubação ocorre a difusão do antígeno na agarose e a formação
de complexos ag-ac.,
• Os complexos precipitam e formam um
halo ao redor do orifício,
• Existe uma relação linear entre o
quadrado do diâmetro do halo (d
2
) e a
concentração do antígeno,
• Utilizando antígeno de concentrações
conhecidas pode-se fazer uma curva
padrão, permitindo determinar a
concentração em amostras
desconhecidas.



http://www.anflalab.com.br/images/Hoja%20Diffuplate%20051.jpg
Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de
Apoio Didático – UCG –Go.
Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático – UCG –
Go.

14. o Aplicações na medicina humana e veterinária:
• Diagnóstico de doenças infecto-contagiosas, onde a detecção de
imunoglobulinas e proteinas séricas seja significativa
• Exemplos: dosagem de imunoglobulinas e proteina séricas (tanto em
humanos como em animais).

15. Acervo Pessoal.
1) O gel de agarose ou agar é
preparado e colocado na
placa,
2) Após a solidificação do gel,
poços são perfurados com um
molde (perfurador ou roseta),
3) adiciona-se antígeno ,
controle positivo e a amostra
a ser testada nos poços
perfurados,
4) Incuba-se a placa por 48
horas.
5) Os complexos ac-ag se
formam e precipitam
formando linhas de
precipitação que indicam o
resultado.
Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático – UCG –Go.

Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático – UCG –Go

16. o Interpretação dos resultados:
• A formação e localização da banda de
precipitação indicam a presença de ac
bem como sua concentração em relação
ao ag,
• Quanto mais perto do ag maior a
concentração de ac na amostra .
Acervo pessoal.

17. o Aplicações na medicina humana e veterinária:
• Muito usado no diagnóstico de doenças infecto-contagiosas,
• Exemplos na Medicina Humana: Candidísase, Histoplasmose e
Aspergilose
• Exemplos na Medicina Veterinária: Doença de Maedi-visna, Brucella
ovis.

18. 1) O gel é preparado e
perfurado após sua
solidificaçação,
3) É colocado o ac e/ou ag (a
depender do tipo de
imunoeletroforese) nos poços
ou canaleta perfurados,
4) O gel numa cuba de
eletroforese horizontal,
5) É aplicada carga no gel, esta
carga é a responsável pela
migração de ag,
7) Ac e ag formam arcos de
precipitação no gel
2) O pH do gel éescolhido de
forma que partículas
negativas migrem para o
eletrodo positivo,
6) É cortada uma canaleta
entre os poços, a qual será
preenchida com ac,
BURMESTER, G.R.; Pezzutto, A.. Color Atlas of Immunology. Thieme, Germany, 2003.

19. o Interpretação dos resultados:
• Proteínas podem ser identificadas baseado na intensidade, forma e posição
das linhas de precipitação,
• Cada arco de precipitação representa um antígeno.



Imunoeletroforese
Rocket Eletroforese

20. o Aplicações na Medicina Humana e Veterinária:
• Utilizada em pacientes com suspeitas de gamopatias monoclonais e
policlonais. Imunoglobulinas policlonais são distribuídas uniformemente
através da fração de gama-globulina depois da separação eletroforética.
• Diagnóstico sorológico de algumas doenças
• Exemplo na Medicina Humana: detecção de ac e ag bacterianos
(Meningite e Septicemia), Cisticercose.
• Exemplo na Medicina Veterinária: cisticercose, alérgenos.

21. • BURMESTER, G.R.; Pezzutto, A.. Color Atlas of Immunology. Thieme, Germany, 2003.
• ROITT,I.M.; Rabson, A.; Delves, P.J.. Really Essential Medical Immunology. Ed – 2.
Blackwell Publishing. Massachusetts – USA, 2005.
• TEIXEIRA, A.C.O.; Ferreira, M.A.S.V. e Marques, A.S.A.. Detecção de Erwinia psidii via
enriquecimento em extrato de folhas de goiabeira e imunodifusão radial dupla. Tropical
Plant Patology, vol. 33, nº 3. Brasilia, Junho de 2008.
• http://www.analiselaboratorios.com.br/imagem/prodts/014.jpg
• http://pathmicro.med.sc.edu/Portuguese/13.GIF
• http://eximlab.com.br/images/fotos/fotop_DGH12_3.jpg
•http://www.biomol.com.br/Imagens/Fotos/%7B1isqt6495xo2bv02u0i43dlgfdrxh4%7D
_Cubas%20de%20Eletroforese%20Horizontal%2014%20x%2014.JPG
• http://www.anflalab.com.br/images/Hoja%20Diffuplate%20051.jpg
• http://www.fcf.usp.br/Ensino/Graduacao/Disciplinas/LinkAula/imunoprecipitacao.pdf
• http://www.unirio.br/DMP/Graduacao/Medicina/Imunologia/Ag-
Ab%20Reactions.pdf
• http://www.scielosp.org/img/revistas/rsp/v12n1/11f1.gif