ICSA29 - Proteínas plasmáticas

Aula de ICSA29 Imunodiagnóstico Biotecnologia - UFBA

1. Dosagem de proteínas plasmáticas através de ensaios de Imunodiagnóstico Prof. Ricardo Portela Salvador – Fevereiro 2013

2. Proteínas plasmáticas Resumidamente, todo e qualquer tipo de molécula complexa que pode ser encontrada no soro Sua identificação e dosagem têm como objetivo avaliar o estado clínico de algum paciente perante algum tipo possível de patologia e/ou tratamento.

3. Proteínas plasmáticas Intervalos de referência ou valores de referência: Intervalo de valores no qual 95 a 99% da população da espécie estudada apresenta os níveis de proteínas plasmáticas sem apresentar nenhum tipo de alteração patológica – pacientes hígidos! É calculado levando em consideração os valores obtidos em uma população clinicamente hígida!

4. Intervalos de Referência Cálculos de Intervalo de Referências: TEMA DE AULA PRÁTICA!

5. Proteínas Constituintes Tipos de proteínas a serem analisadas: Proteínas constituintes básicas: albumina “Colesterol” “Triglicerídeos”

6. Enzimas São proteínas altamente especializadas com atividade catalítica; praticamente todas as reações químicas celulares onde participam biomoléculas orgânicas são catalisadas por enzimas. Existem milhares de enzimas, cada uma capaz de catalisar um tipo de reação química diferente. Exemplos: fosfatase ácida, fosfatase básica, transaminases Podem não ser típicas do soro, mas sua presença neste serve de marcador de injúria tecidual

7. Proteínas Transportadoras São proteínas que se ligam a íons ou a moléculas específicas, as quais são transportadas de um órgão para outro. Transportam hormônios, vitaminas, metais, drogas e oxigênio (hemoglobina); solubilizam os lipídios ( apoproteínas ). Transportam, por exemplo, a glicose, aminoácidos e outras substâncias.

8. Proteínas de Armazenamento Atuam no armazenamento de certas substâncias, ex.: ferritina, que armazena átomos de ferro.

9. Proteínas com função imunológica Imunoglobulinas Proteínas da cascata da coagulação Proteínas do Sistema do Complemento Proteínas de Fase Aguda

10. Proteínas Reguladoras - Hormônios Muitas vezes presentes na circulação sanguínea, pois é a via de transporte desde o órgão produtor ao órgão alvo Prolactina, FSH, LH, TSH, eritropoietina, hormônio do crescimento Não proteínas: testosterona, progesterona, estrógeno

11. Escolha do método a ser empregado Natureza da molécula: proteína, açúcar, lipídeo Tamanho da molécula e complexidade Peso molecular Possibilidade ou não de formação de complexos com outras moléculas Função da molécula: hormônio, enzima... Concentração da molécula no soro

12. ENZIMAS - MÉTODOS Grande parte das enzimas plasmáticas NÃO são quantificadas por métodos imunológicos Levando-se em consideração a sua ação enzimática específica, utilizam-se métodos nos quais se adiciona o substrato da enzima, e um marcador para a transformação enzimática Resultados lidos por espectrofotometria

13. ENZIMAS Exemplos Amilase: adição de amido e iodo, e a diminuição da cor azul é correspondente a quantidade de amilase na amostra; GamaGT : catalisa a transferência de glutamil para glicilglicina , formando p- nitroanilina , que absorve a 405nm Lipase: clivagem de triglicéride de cadeia longa, com formação de composto de coloração vermelha

14. ENZIMAS Exemplos Fosfatase ácida: atuando sobre timolftaleína , e um álcali converte o resultado da reação em substância de cor azul Transaminase pirúvica: formação de piruvato e hidrazona , formando cor em meio alcalino CK-MB: formação de tiocolina , e redução de ferricianeto .

15. ENZIMAS Mas... Algumas enzimas são presentes em baixas concentrações no soro, e não se pode dosá-las por métodos bioquímicos de pouca sensibilidade; A ação enzimática de algumas é difícil de reproduzir in vitro, com alto custo de substrato e co-enzimas ; Algumas tem ação enzimática muito específica, e ainda não foi desenvolvida técnica para tornar essa ação detectável...

16. MÉTODOS E SUAS UTILIZAÇÕES

17. IMUNODIFUSÃO (IMUNODIFUSÃO SIMPLES) Método antigo, de boa especificidade, mas de baixa sensibilidade Medição dos halos de precipitação, e comparação com os halos de calibradores Praticidade, baixo custo, não há necessidade de aparato sofisticado, confecção rápida

18. IMUNODIFUSÃO ( IMUNODIFUSÃO RADIAL SIMPLES ) Limitação: utilizado para proteínas séricas que tenham alta concentração em fluidos corporais (nível de mg/ mL ) Utilizado para proteínas séricas que tenham um intervalo de referência largo (pequenas variações não influenciariam no resultado) Em desuso atualmente, principalmente devido a problemas de reprodutibilidade, de manutenção do gel (comercialmente)

19. IMUNODIFUSÃO O caso das Imunoglobulinas: Por terem uma concentração sérica considerada alta (com exceção de IgE), e por terem largas faixas de referências, podem ser dosadas por Imunodifusão simples. Praticidade, custo baixo Exceção: quando se necessita do resultado com urgência (incubações podem durar até 3 dias)

20. ELISA SANDUÍCHE Utilizado atualmente como método de referência para diversas proteínas plasmáticas Consegue realizar detecção e quantificação de proteínas plasmáticas com sensibilidade de até nanogramas (dependendo do tipo de sistema utilizado) Relação custo/benefício boa

21. Outros componentes do soro ELISA “SANDWICH” Antígeno a ser dosado Anticorpo primário Anticorpo conjugado TMB Enzima Peroxidase

22. ELISA SANDUÍCHE Para o desenvolvimento do método: Necessário a proteína ser de um peso molecular e complexidade razoáveis – necessidade de haver mais de um epitopo Necessário o emprego de anticorpos para dois epitopos diferentes, e espacialmente afastados um do outro Necessário o analito purificado e quantificado de forma confiável

23. ELISA SANDUÍCHE Para o desenvolvimento do método: Necessário quantidade razoável de soros para serem empregados como referências – previamente quantificados para o analito em questão Decidir quanto ao método enzimático a ser empregado Verificar questões de sensibilidade analítica, linearidade, range de detecção, reprodutibilidade, repetitividade...

24. QUESTÃO DO MEIO PONTO O caso do PSA e do PSA Livre: PSA utilizado como um marcador para alterações e patologias prostáticas Dosado rotineiramente por Elisa Sanduíche Encontrado normalmente complexado com anti-proteases PSA Livre e relação PSA Livre/PSA Total normalmente é mais informativo do que somente PSA Livre Pergunta-se: como desenvolver uma dosagem em ELISA sanduíche de PSA Livre, sem ser influenciado pelo PSA Total?

25. ELISA COMPETIÇÃO Moléculas monovalentes – possuem somente um epitopo (as vezes a molécula inteira é um anticorpo) – incapacidade de realizar um ELISA Sanduíche Alternativa para dosar esse tipo de molécula: ELISA de competição

26. ELISA DE COMPETIÇÃO Outros componentes do soro Antígeno a ser dosado Anticorpo primário Antígeno biotinilado TMB ST-AV- Peroxidase

27. ELISA COMPETIÇÃO Exemplos de moléculas séricas com essas características: T3, T4, estrógeno, progesterona, testosterona Diferença importante: Na competição a correlação entre reação desenvolvida e quantidade de analito é inversamente proporcional! Importante frisar: a curva desenvolvida é, além de inversa, também logarítmica, para a grande maioria dos analitos em ELISA Competição!

28. ELISA COMPETIÇÃO Pontos necessários para desenvolvimento de um ELISA competição: Necessário: ter um anticorpo específico para o epitopo único de seu analito! Necessário: ter o seu analito marcado/conjugado com substância enzimática, purificado e quantificado corretamente Necessário: Saber previamente o intervalo de referência do analito para poder fazer calibrações na concentração de analito conjugado a ser utilizado no ensaio

29. QUESTÃO DO MEIO PONTO O caso de T3/T4 : T3 e T4 são moléculas bem pequenas, que devem ser dosadas em sistema de competição. Enzimas como a peroxidase e a fosfatase alcalina são grandes, complexas A diferença de tamanho entre a enzima e o analito pode influenciar em seu reconhecimento pelo anticorpo de captura PERGUNTA: como proceder?

30. ELISA DE COMPETIÇÃO A questão da Biotina: Biotina - vitamina H, B7 ou B8 Streptoavidina : quelação de biotina em indivíduos infectados com Streptomyces Ligação de grande afinidade de Streptoavidina com biotina

31. ELISA DE COMPETIÇÃO A questão da Biotina: Biotina: pode ser usada em mecanismos de conjugação com grande sucesso! Streptoavidina : pode ser conjugada com peroxidase ! Uma streptoavidina pode carregar 4 peroxidases (3 para deixar um sítio para ligar a biotina) E daí???

32. IMUNOQUIMIOLUMINESCÊNCIA IMUNOFLUORESCÊNCIA São aplicadas quando se necessita de maior sensibilidade analítica! Pode detectar analitos na ordem de pico a fentogramas ! Muito utilizadas hoje em dia (Luminescência mais) em ensaios de dosagem de analitos séricos humanos (mesmo com concentrações usuais nem tão baixas assim!)

33. Adição de anticorpo monoclonal específico para o antígeno pesquisado conjugado a enzima. Uma microesfera de poliestireno é revestida com anticorpo monoclonal contra antígeno analisado Adição do soro do paciente, que é incubado com agitação intermitente. Lavagem para retirada do antígeno não fixado Incubação do conjugado e mais uma lavagem para tirar o anticorpo não fixado PASSOS DA TÉCNICA Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Adição do substrato da enzima, em seguida, incubação. A adição de substrato quimioluminescente sofre hidrólise na presença da enzima, produzindo substâncias instáveis que geram emissão de fótons (luz). Y Y Anticorpo monoclonal Substrato Conjugado Antígeno do soro do paciente

34. Estes impulsos são lidos em “contagens” de luz por segundo ( cps ). Essa unidade é proporcional a quantidade de antígenos presentes na amostra . Estes fótons são medidos través de um fotomultiplicador (PMT) que tem a função de transformar a luz emitida pelos fótons em impulsos elétricos. PASSOS DA TÉCNICA

35. IMUNOQUIMIOLUMINESCÊNCIA IMUNOFLUORESCÊNCIA Possuem as mesmas variações de um ELISA: Competição, Indireto, Sanduíche, Captura A escolha do tipo vai seguir os mesmos padrões para o ELISA! Grande vantagem: Sensibilidade analítica elevada! Consegue detectar pequenas variações nas concentrações dos analitos !

36. IMUNOQUIMIOLUMINESCÊNCIA IMUNOFLUORESCÊNCIA Necessário: anticorpos diretamente conjugados com substâncias fluorescentes ou quimioluminescentes , ou com enzimas que tenham ação sobre um substrato que se torne luminescente ou fluorescente Necessário: substâncias fluorescentes ou quimioluminescentes , e outras que façam sua estabilização

37. IMUNOQUIMIOLUMINESCÊNCIA IMUNOFLUORESCÊNCIA Necessário: leitores de quimioluminescência ou fluorescência Necessário: soros padrões dosados por técnicas igualmente sensíveis Necessário: PADRONIZAÇÃO CORRETA DE CONCENTRAÇÃO DE REAGENTES, e determinação de sua repetitividade e reprodutibilidade

38. QUESTÃO DE MEIO PONTO A questão da alta sensibilidade: A alta sensibilidade dos ensaios acarreta um preço: Qualquer variação mínima em tempo de incubação, pipetagem , temperatura de incubação, lavagens pode acarretar um resultado distorcido Portanto, a reprodutibilidade pode ser problemática! Pergunta: como proceder?

39. AUTOMAÇÃO

40. Interferentes clássicos em dosagem de proteínas plasmáticas Questão SORO x Plasma! Plasma: contém ainda proteínas da coagulação Soro: sem proteínas da coagulação – mais limpo! Tempo de coagulação: consumo de glicose e de outras enzimas Tamanho das proteínas a serem dosadas: podem estar aprisionadas no processo de coagulação! Interação Antígeno/Anticorpo e moléculas da coagulação!

41. Interferentes clássicos em dosagem de proteínas plasmáticas Hemólise! Liberação de hemoglobina no soro/plasma Alteração da coloração da amostra: influência em ensaios espectrofotométricos com utilização de grande qtdade de amostra Contaminação com componentes internos das células: problema maior em eletrólitos, e em algumas enzimas Interferência na ação de algumas enzimas (inibição) Interferências nas reações antígeno/anticorpo quando em grande concentrações!

42. Interferentes clássicos em dosagem de proteínas plasmáticas Hemólise! Para evitá-la: Retirada de sangue: cuidados com a pressão negativa violenta, com a manipulação de seringas e agulhas, com a retirada correta Evitar altas temperaturas Evitar exposição a luz Tempo de conservação Tempo de permanência do coágulo antes de sua retirada

43. Interferentes clássicos em dosagem de proteínas plasmáticas Cuidados pessoais do paciente pré -coleta: Jejum – fundamental para algumas enzimas e proteínas carreadoras Suspensão de medicação: corticóides principalmente Relato de qualquer tipo de alteração Intervenções e reações cruzadas!