Identificação convencional de fungos filamentosos1

1. Identificação convencional de fungos filamentosos e identificação automatizada e convencional de fungos leveduriformes Disciplina : Micologia Médica Profº .: Luís Henrique Acadêmicos: Carlos Alberto; Joilce Portela; Marcos Allan; Maria Inês e Maria Josenilda

2. Introdução Identificação do fungo de maneira ideal seria: Gênero e espécie O processamento da amostra passa por 3 fases: Pré-analítica Analítica Processamento da amostra Indicar a coleta transporte Processamento identificação do microrganismo laudo e estocagem Estudos Dados epidemiológicos

3. Isolamento do fungo Para isolamento primário em micologia se utiliza o meio Sabouraud (podendo estar acrescido de antibiótico) Semear Exame direto Macroscópico Microcultivo/ análise bioquímica Levedura Filamentoso Gram

4. Identificação de fungos filamentosos Cultura pura (Cultura mista é uma causa comum de erro) 1. Exame Macroscópico Textura: algodonosa , velutina, pulverulenta ( furfuráceas ), penugentas

5. Identificação de fungos filamentosos 1. Exame Macroscópico Relevo: cerebriformes , rugosa, apiculadas, crateriformes Bordas: vários desenhos (franjas) Pigmentação: anverso e reverso/ difusível ou não Tamanho: variável (quantidade e qualidade do substrato)

6. Identificação de fungos filamentosos 2 . Exame Microscópico: É a base do diagnóstico da maioria dos fungos filamentosos Se baseia nas diferenças morfológicas das estruturas reprodutivas e na ontogenia dos esporos Os isolados primários e subcultivo devem ser submetidos a avaliação micromorfológica (40x)

7. Identificação de fungos filamentosos 2. Exame Microscópico - 2 técnicas podem ser empregadas: Técnica Material Montagem Exame Microscópico Direto Amostra biológica Material é colocado entre lâmina e lamínula com líquido de montagem apropriado Microcultivo Fragmento da cultura 1ª ou 2ª em meio sólido ou líquido, Material é previamente depositados sobre lâmina e/ou lâminula Lactofenol azul de algodão (hialinos) Lactofenol de Aman / KOH/ NaOH / ( demáceos )

8. Identificação de fungos filamentosos Exame microscópico Direto

9. Agar “ cornmeal ” Potato Dextrose Agar (PDA) SDA Dextrose Agar (SDA) Agar malte Identificação de fungos filamentosos Técnica de microcultivo em lâmina (método 1) 121ºC 20-30min 30ºC 3-5 dias

10. Identificação de fungos filamentosos Técnica de microcultivo em lâmina (método 1)

11. Resistencia à cicloheximida Separar as culturas de: Blastomyces dermatitidis , Paracoccidiodes brasiliensis, Histoplasma capsulatum , Sporothrix schenckii , Coccidioides immitis , Epidermophyton floccosum Microsporum ssp ., Trichophyton ssp . Observação Meio Resultado Crescimento SDA e Mycosel Resistente Crescimento SDA Sensível Não SDA Repetir Identificação de fungos filamentosos SDA Mycosel 30°C 7 dias Fungos Oportunistas Absidia , Rhizopus , Mucor e Aspergillus fumigatus

12. Identificação de fungos filamentosos 4.Demonstração de balistosporos Alguns fungos Zygomycetes tem habilidade de produzir balistosporos – dilatação propulsiva Produção de balistosporos Formação espontânea de colônias periféricas ( Basidiobolus e Conidiobolus )

13. Identificação de fungos filamentosos 4.Demonstração de balistosporos 30ºC 2-3 dias

14. Identificação de fungos filamentosos 5. Teste da Perfuração do fio de cabelo Distinção entre Trichophyton rubrum e T. Mentagrophytes Extrato de levedura (10%) + fio de cabelo + cultura suspeita → incubar 30°C/ 10-14 dias

15. . Teste da Perfuração do fio de cabelo Trichophyton mentagrophytes , Hair perforation test is positive. Trichophyton rubrum , Hair perforation test is negative. Perforations

16. Identificação de fungos filamentosos 6. Testes Fisiológicos Urease Habilidade de hidrolisar ou não a Uréia Distinguir isolados atipicos de Trichophyton rubrum (-) e T. Mentagrophytes (+) Agar usado: Agar uréia Christensen Tempo: 3-4 dias controle

17. Identificação de fungos filamentosos 7. Dimorfismo Dimórficos são fungos filamentosos que podem, sob determinadas condições, assumir forma de levedura , diminuindo a capacidade de filamentação - colônias aspecto cremoso Filamentosa a 25-30 ⁰ C Levedura a 37 ⁰ C É um critério útil para identificação desses fungos patogênicos → Temperatura , composição do meio e concentração de CO ₂

18. Identificação de fungos filamentosos 7. Dimorfismo Histoplasma capsulatum , Blastomyces dermatitidis , Paracoccidiodes brasiliensis, Sporothrix schenckii , Coccidioides immitis , gênero Emmonsia , Penicillium marneffei

19. Técnica de conversão da fase micelial à fase leveduriforme Todos os procedimentos devem ser feitos em câmara de fluxo laminar Blastomyces dermatitidis e Paracoccidioides brasiliensis Agar Kelley Agar semente de algodão Sporothrix schenckii , Histoplasma capsulatum BHIB + glicose + cisteína Sporothrix schenckii , BHIA Exame direto – hifas em levedura (semanas) 1º - 30°C 2º - 37°C

20. Identificação de fungos leveduriformes

21. Identificação de fungos leveduriformes 1 - Exame Macroscópico Características: Textura Topografia Bordos Coloração meios sólidos Formação de película meios líquidos

22. Colônias de cor laranja a vermelha, aspecto cremoso. Rhodothorula spp Macromorfologia ( ágar Sabouraud ) Ágar Sabouraud : colônias de cor branca a creme, cremosas e lisas. Candida albicans Em ágar sangue, colônias de cor creme, com formação de franjas que lembram “ estrelas”. Candida krusei Colônia rosa Macromorfologia em Chromagar Macromorfologia

23. Identificação de fungos leveduriformes 2 - Exame Microscópico Preparações diretas e/ou cultivo em lâmina Célula leveduras Blastoporos Blastosporos Balistosforos Pseudo-hifas Tubos germinativos Clamidosforos Artrosporos Ascos Ascoporos Cápsulas

24. Pseudohifas: abundantes e ramificadas Clamidósporos terminais estruturas arredondadas de parede espessa Blastoconídeos são ovais e formam aglomerados no septo das pseudohifas. Candida albicans Micromorfologia

25. Identificação de fungos leveduriformes Tubo Germinativo Objetivo: Identificação presuntiva de Candida albicans e C. stellatoidea (incubado com soro humano a 37 ° C/ 2-3 horas) Descrição Método 1 Método 2 Meio de cultura Soro humano ou animal Clara de ovo Procedimento 0,3 - 0,5mL (tubo de ensaio) → cultura suspeita (idade 18-72h) → incubar a 37°C / 2-3h → Inocular 1gt entre lâmina e lamínula → microscópico Inocular a cultura suspeita em clara de ovo → incubar a 37°C / 2 -3h → montagem microscópica (tubos germinativos)

26. Identificação de fungos leveduriformes Tubo Germinativo CUIDADO: observar a constricção entre a célula mãe ( blastoconídio ) e o início da formação da pseudohifa . Formação do tubo diretamente da célula leveduriforme ALMEIDA, G. M. D., et al.

27. Identificação de fungos leveduriformes Demonstração de cápsula Indicar presuntivamente o agente etiológico – Cryptococcus neoformans (cápsulas em torno da célula) Realizada com preparações microscópicas com nanquim ou nigrosina Suspensão de levedura em água destilada + tinta da China + lâmina e lamínula → microscópio

28. Identificação de fungos leveduriformes 3 – Testes fisiológicos ou bioquímicos São usados para identificação final deste grupo de fungos Assimilação de carboidratos Assimilação de nitrato Fermentação de carboidratos Teste de Urease → ZIMOGRAMA Sistemas comerciais AUXANOGRAMA }

29. Suspensãode células do fungo Solução-padrão= 10 6 ufc/mL Comparação para ajuste de turbidez: espectrofotômetro ou visual = INÓCULO

30. Auxanograma Presença de oxigênio Utilização de fontes de: Carbono (a partir de açúcares) Nitrogênio (a partir de nitrato)

31. Auxanograma Meio basal sem fonte de carbono Sólido ou líquido Yeast Nitrogen Base (YNB)- 40mL Inóculo : escala 1 McFarland (2mL) Incorporar suspensão de levedura ao meio Aplicação de discos ou açúcar in natura Incubação 30 o C por 24-48h

32. Auxanograma Aplicação de compostos nitrogenados Peptona (controle positivo) Nitrato de potássio Incubação 30 o C por 24-48 h até 7 dias Resultados: presença de zona de crescimento (leitura visual)

33. Identificação de fungos leveduriformes Teste da Urease Hidrólise da Uréia Cryptococcus neoformans (99%), Rhodotorula e Trichosporon → urease positivo Rápido crescimento em Agar Uréia de Christensen – coloração rosa escuro (30ºC/5 dias) Teste da Urease rápida Controle positivo: C. neoformans

34. Identificação de fungos leveduriformes Sistemas Comerciais Manuais Automatizados ( Vitek 2 , ID 32C ) Para identificação específica de C. albicans São empregados tiras ou cartelas contendo uma série de galerias plásticas com carboidratos desidratados ou outro substrato bioquímico Inoculação nas galerias → incubação (varia de 4h-2-3 dias) → leitura

35. Cultura positiva Exame direto Bactéria Levedura Cultura Pura Sim Não Obter Colônia Pura por isolamento Cápsula + Macromorfologia Colônia bege : Criptococcus sp Colônia salmão/laranja: Rhodothorula sp - Tubo Germinativo - + C. albicans Provas Bioquímicas e Cultivo em Lâmina (continua)

36. Cultivo em lâmina

37. Obrigado!!!

38. Bibliografia LEVY, C. E. Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em Serviços de Saúde , 1ª edição, Módulo VII, Editora Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Campinas SP., 2004. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/ servicosaude /manuais/ microbiologia.asp>. Acesso em 17/10/12 . SIDRIM, J. J. C.; ROCHA, M. F. G. Micologia Médica à Luz de Autores Contemporâneos, 1ª edição,   Guanabara Koogan , 2004 . ZAITZ. C , et al, Compêndio de Micologia Médica , 2º edição, Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2010.

39. Micologia Médica à Luz de AutoresContemporâneosSidrim JJC, Rocha MFGGuanabara  Koogan