Imunodiagnóstico de doenças infecciosas

aula de Sandra do Lago Moraes, Instituto de Medicina Tropical, Universidade de São Paulo, 2013

1. Imunodiagnóstico de doenças infecciosas Sandra do Lago Moraes Pesquisadora Científica Instituto de Medicina Tropical Universidade de São Paulo

2. DIAGNÓSTICO DE CERTEZA DE UMA INFECÇÃO demonstração direta do patógeno ou de seus produtos nos tecidos ou fluidos biológicos dos hospedeiros e/ou presença de sintomas clínicos definidos

3. MÉTODOS IMUNOLÓGICOS DIRETOS OU INDIRETOS Amplamente usados na pesquisa de antígenos, anticorpos ou imunocomplexos Rapidez Simplicidade Possibilidade de automação Baixo custo operacional

4. ANTICORPOS NO DIAGNÓSTICO INDIVIDUAL (#1) Elucidar processos patológicos com sintomas e sinais clínicos confundíveis diferenciar a fase da doença    diagnosticar doença congênita    selecionar doadores de sangue selecionar doadores e receptores de órgãos para transplantes   

5. ANTICORPOS NO DIAGNÓSTICO INDIVIDUAL (#2)    avaliar o prognóstico da doença avaliar a eficácia da terapêutica e suspensão da terapêutica avaliar a imunidade específica naturalmente adquirida ou artificialmente induzida verificar o agravamento da patologia

6. ANTICORPOS EM INQUÉRITOS SOROEPIDEMIOLÓGICOS Estabelecer a prevalência da doença Verificar a erradicação da doença Verificar a reintrodução de novos casos em áreas consolidadas

7. PESQUISA DE ANTÍGENOS Como critério de cura Na definição da etiologia da doença Na seleção de doadores de sangue Em inquéritos epidemiólogicos

8. LIMITAÇÕES DOS TESTES SOROLÓGICOS #1 Dependem da capacidade de resposta imune do hospedeiro Genética Estado de nutrição Integridade dos mecanismos de resposta imunológica

9. Ubiqüidade dos determinantes antigênicos Reação cruzada (anticorpos heterófilos , antígenos semelhantes, experiência imunológica do hospedeiro com estímulos antigênicos variados) LIMITAÇÕES DOS TESTES SOROLÓGICOS #2

10. Interferentes não específicos Detergentes Solventes orgânicos pH Cromógenos endógenos Inibidores enzimáticos LIMITAÇÕES DOS TESTES SOROLÓGICOS #3

11. FATORES DO ANTÍGENO ALVO QUE DEVEM SER CONSIDERADOS NA PESQUISA DE ANTÍGENOS não persistência na circulação na ausência do parasita ser abundante não apresentar grande diversidade genética ser estruturalmente diferente de antígenos encontrados no sangue

12. MANIFESTAÇÕES DAS REAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO Reação Primária ligação dos grupos reativos da molécula antigênica com um de dois sítios de combinação da molécula de anticorpo Reação Secundária visibilização direta ou com auxílio de lupas da precipitação ou da aglutinação Reação terciária expressão biológica da interação Ag-Ac

13. TÉCNICAS SOROLÓGICAS Testes de complemento teste de hemólise fixação de complemento Neutralização Dependentes da reação terciária

14. TÉCNICAS SOROLÓGICAS Precipitação Aglutinação Dependentes da reação secundária

15. TÉCNICAS SOROLÓGICAS Imunofluorescência Radioimunoensaio Enzimaimunoensaios Dependentes da reação primária (técnicas com reagentes marcados )

16. PRECIPITAÇÃO EM MEIO LÍQUIDO EM MEIO SÓLIDO (ÁGAR) Imunodifusão simples - unidimensional ( Oudin ) - radial (Mancini) Imunodifusão dupla - unidimensional (Oakley) - radial ( Ouchterlony ) Imunoletroforese Imunoeletrodifusão - unidimensional simples - unidimensional dupla

17. AGLUTINAÇÃO caracteriza-se pela formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que contêm determinantes antigênicos em sua superfície

18. AGLUTINAÇÃO 1 o estágio: ligação dos anticorpos aos antígenos de superfície, por meio de ligações não-covalentes 2 o estágio: resulta das colisões que ocorrem entre as partículas, de modo que os anticorpos ligados a uma partícula se ligam a determinantes antigênicos de outra formam pontes entre partículas agregados visíveis a olho nu

19. FATORES QUE INTERFEREM NA FORMAÇÃO DE AGREGADOS: tipo do anticorpo ( IgM é 750x mais eficiente que IgG ) eletrólitos pH (ideal entre 6,0 e 8,0) macromoléculas hidrofílicas (em baixas concentrações impedem a autoaglutinação ) enzimas (afastam reações inespecíficas) tempo temperatura A G L U T I N A Ç Ã O

20. FENÔMENO DE PROZONA falsos resultados negativos em soros com elevado título de anticorpos aglutinantes esse efeito é eliminado empregando-se diluições seriadas do soro A G L U T I N A Ç Ã O

21. AGLUTINAÇÃO DIRETA ocorre com partículas que apresentam determinantes antigênicos naturais em sua superfície ( Ex : hemácias, bactérias, protozoários, fungos)

22. AGLUTINAÇÃO DIRETA hemácias como antígeno: tipagem de grupos sangüíneos do sistema ABO e Rh (antígenos específicos) reação de Paul- Bunnel -Davidson (antígenos heterófilos ) antígenos íntegros ou fragmentados de bactérias, espiroquetas, protozoários: teste de Widal ( salmoneloses ) teste de Wright (brucelose) teste de Weil -Felix (rickettsiose) teste de aglutinação para leptospirose, toxoplasmose e tripanossomíase

23. INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO DIRETA baseia-se na capacidade que certos antígenos virais têm de, espontaneamente, aglutinarem certos tipos de hemácias. Os anticorpos, se presentes na amostra, revestem as partículas virais, resultando na inibição da aglutinação, indicando um teste positivo para a presença de anticorpos Exemplos: anticorpos contra os vírus da rubéola, sarampo, influenza e certos enterovírus

24. AGLUTINAÇÃO PASSIVA OU INDIRETA Aglutinação de partículas inertes (látex, poliestireno, bentonita , sepharose , colódio , charcoal , etc.) ou células antigenicamente não relacionadas (hemácias, bactérias, leveduras) sensibilizadas com antígenos solúveis

25. HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA Hemácias possuem uma superfície complexa, o que facilita a ligação de muitos antígenos mais usadas: hemácias de carneiro ou humanas do grupo O, fixadas com formaldeído ou glutaraldeído (resolve o problema da fragilidade e permite que sejam estocadas por longos períodos de tempo) Ags polissacarídicos aderem prontamente a hemácias antígenos protéicos requerem pré -tratamento com ácido tânico ou cloreto de cromo

26. INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA baseia-se na competição, pelos sítios de combinação do anticorpo, entre o antígeno fixado à hemácia e o antígeno solúvel ou o hapteno . O grau de inibição relaciona-se com a quantidade do antígeno presente na amostra e, também, com a afinidade pelos sítios de combinação do anticorpo

27. AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX Partículas de látex são esferas de poliestireno que podem ser utilizadas como suportes na adsorção de proteína solúvel e antígenos polissacarídicos , funcionando como sistema indicador da reação antígeno-anticorpo

28. AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX fator reumatóide antígenos polissacarídicos bacterianos ( Haemaphilus influenzae , Rickettsia sp , estreptococos do grupo B, Staphylococcus aureus , Neisseria meningitidis , etc., no soro, urina ou líquor ) drogas e hormônios (  -HCG ) anticorpos na rubéola proteína C reativa útil na pesquisa de:

29. AGLUTINAÇÃO DE CRISTAIS DE COLESTEROL O teste de VDRL ( Venereal Disease Research Laboratory ) emprega cristais de colesterol que são sensibilizados com lecitina e cardiolipina , para a pesquisa de anticorpos antilipídios na sífilis formação de flóculos (  aglutinação??)

30. IMUNOFLUORESCÊNCIA Baseia-se na capacidade de anticorpos/antígenos se ligarem covalentemente a fluorocromos , sem perder sua reatividade específica com o antígeno antígeno/anticorpo Fluorocromos - substâncias que absorvem luz em comprimento de onda menor e quando excitadas com luz UV emitem luz em comprimento maior mais comuns: isotiocianato de fluoresceína , lisamina-rodamina b

31. IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA empregada na pesquisa e localização de antígenos em células ou tecidos através de um anticorpo específico marcado com fluorocromo Ex.: Chlamydia trachomatis , Treponema pallidum, Legionella sp , Escherichia coli Luz de excitação Luz emitida

32. IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA Empregada na pesquisa de anticorpos/antígenos. O antígeno fixado em lâmina reage com um anticorpo específico e o complexo Ag/Ac é revelado com conjugado fluorescente ( anti-Ig marcado) Exemplos: pesquisa de antígenos: Plasmodium sp pesquisa de anticorpos: T. pallidum , T.cruzi , CMV, Plasmodium sp , autoanticorpos

33. RADIOIMUNOENSAIO anticorpo antígeno marcado+ não marcado (amostra) medir radioatividade Método de competição com antígeno marcado

34. antígeno fase sólida anticorpo marcado+ antígeno (amostra) medir radioatividade Método de competição com anticorpo marcado RADIOIMUNOENSAIO

35. anticorpo antígeno (amostra) anti-antígeno marcado medir radioatividade Método de captura RADIOIMUNOENSAIO

36. TÉCNICAS IMUNOENZIMÁTICAS Baseadas na utilização de antígenos ou anticorpos marcados com enzimas e permitem a detecção, titulação e quantificação de substâncias de interesse biológico

37. IMUNOPEROXIDASE Enzima converte o componente cromógeno (substrato + doador de hidrogênio) em produto insolúvel, que precipita no sítio da reação precipitado visível ao microscópio óptico comum e eletrônico (por ser eletrodenso )

38. ENZIMAIMUNOENSAIO Método quantitativo em que a reação Ag-Ac é monitorada pela medida da atividade enzimática Homogêneo: não é necessária a separação entre os complexos Ag-Ac e o Ag e/ou Acs , pois a atividade da enzima não é alterada pela reação Ag-Ac Heterogêneo: a atividade da enzima é alterada pela reação Ag-Ac e a separação se faz necessária

39. Ensaios heterogêneos peroxidase glicose oxidase fosfatase alcalina anidrase carbônica  - galactosidase acetilcolinesterase Ensaios homogêneos lisozima ribonuclease A malato desidrogenase  - galactosidase glicose-6-desidrogenase ENZIMAS MAIS UTILIZADAS EM ENZIMAIMUNOENSAIOS:

40. EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay (ELISA) Princípio básico: imobilização de um dos reagentes numa fase sólida, enquanto outro reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservação tanto da atividade enzimática como da atividade imunológica do Ac

41. ELISA para pesquisa de anticorpos antígeno lavagem anticorpo (amostra) E E anti-imunoglobulina marcada lavagem lavagem E E substrato cromogênico Método indireto

42. Método de Captura de IgM lavagem lavagem lavagem lavagem anti-IgM IgM (amostra) antígeno anti-antígeno marcado E E Substrato cromogênico E E ELISA para pesquisa de anticorpos

43. ELISA para pesquisa de antígenos Método de captura anticorpo antígeno (amostra) E E anti-antígeno marcado E E substrato cromogênico lavagem lavagem lavagem

44. ELISA para pesquisa de antígenos Método de competição com anticorpo marcado antígeno E E E antígeno (amostra) + anticorpo marcado E substrato cromogênico lavagem lavagem

45. ELISA para pesquisa de antígenos Método de competição com antígeno marcado anticorpo E E E E E antígeno marcado e não marcado (amostra) E E substrato cromogênico lavagem lavagem

46. Immunodot (ou dot -ELISA , dot-immunobinding assay , dot-blotting assay , dot-blot ELISA) pequenas quantidades do imuno-reagente são aplicadas como gotas em membrana de nitrocelulose (fase sólida) membranas de nitrocelulose adsorvem proteínas com grande eficiência (praticamente 100%) (volumes de 0,1 a 1 ml, contendo de 100 a 400 pg de imuno-reagente , são suficientes) simplicidade rapidez sensibilidade

47. Immunodot enzimas mais utilizadas: peroxidase fosfatase alcalina glicose oxidase substratos devem sob ação da enzima, originar um precipitado colorido para peroxidase : diaminobenzidina /H 2 O 2 e 4-cloro-1-naftol/H 2 O 2 ) outros sistemas de detecção: substratos fluorescentes ou luminescentes, radioisótopos

48. Western blotting ( Immunoblotting ) 1 a etapa: proteínas são separadas, de acordo com seu tamanho, por eletroforese em gel de poliacrilamida , contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) 2 a etapa: as proteínas separadas são transferidas eletroforeticamente , do gel para uma membrana de nitrocelulose, onde ficam imobilizadas, como uma réplica do padrão de bandas do gel 3 a etapa: a reação imunoenzimática é então processada na membrana para identificação das proteínas separadas e transferidas

49. Western blotting pode ser empregado para: determinar se há antígeno ou anticorpo em uma amostra e qual é a sua especificidade determinar se o preparado é puro ou não determinar quais proteínas estão sendo reconhecidas por um anticorpo distinguir diferentes perfis de anticorpos, de acordo com a fase da doença ou infecção, ou de acordo com a presença ou não da infecção diferenciar entre cepas patogênicas e não-patogênicas, etc.

50. anodo mistura de antígenos protéicos catodo migração eletroforética Western blotting catodo anodo papel de filtro membrana gel tampão de transferência

51. Western blotting reação antígeno-anticorpo Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y A B reação com conjugado revelação com substrato cromogênico Substrato cromogênico Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y E Y E Y E Y E Y E Y E Y E Y E Y E Y E A B conjugado A B visualização dos complexos antígeno-anticorpo formados

52. ENSAIOS QUIMIOLUMINESCENTES Quimioluminescência : fenômeno em que se obtém energia luminosa a partir de uma reação química gerada como resultado da dissociação de ligações fracas (são produzidos compostos intermediários em um estado eletronicamente excitado que, quando retornam ao estado de energia inicial, emitem luz Imunofluorescência A fonte de energia que promove a excitação das moléculas é uma r adiação incidente Bioluminescência A energia provém de uma reação biológica, sendo a emissão de luz facilitada por uma enzima ( luciferase ) ou uma fotoproteína

53. VANTAGENS DA QUIMIOLUMINESCÊNCIA Elevada sensibilidade de detecção: de atomol até zeptomol (10 -18 até 10 -21 M) Linearidade da curva dose-resposta Rapidez (sinal é gerado em segundos) Custo (uso de pequenas quantidades de reagentes) Reagentes não perigosos e procedimentos simples Possibilidade de aumento da sensibilidade (amplificadores) Possibilidade de aplicação em sistema automatizados

54. ENZIMAIMUNOENSAIO QUIMIOLUMINESCENTE Consiste na detecção da reação antígeno-anticorpo utilizando uma enzima e uma molécula sintetizada ou uma mistura de moléculas que atuará como substrato para a enzima e como emissor de luz Substratos quimioluminescentes da peroxidase : luminol , isoluminol , polifenóis , ácido gálico, umbiliferone

55. ENZIMAIMUNOENSAIO QUIMIOLUMINESCENTE COM NANOPARTÍCULAS Nanopartículas são mais estáveis, mais baratas e de mais fácil purificação Ex. de ouro coloidal, que podem ser facilmente preparadas em uma gama de tamanhos, de 2 a 100 nm

56. WESTERN BLOTTING ENZIMAIMUNOENSAIO QUIMIOLUMINESCENTE A emissão de luz é detectada com um filme fotográfico ou de raios X IMMUNODOT QUIMIOLUMINESCENTE

57. ENSAIOS IMUNOCROMATOGRÁFICOS Podem ser encontrados em quatro formatos B. “dipstick” C.cartão D.híbrido A1 A2 C2 C1 S ST A.cassete

58. TÉCNICAS EMPREGADA NA AUTOMAÇÃO Nefelometria Turbidimetria Enzimaimunoensaio Imunoensaio quimioluminescente Imunoensaio fluorescente (heterogêneo/ homogêneo) Imunoensaio de polarização de fluorescência Imunoensaio fluorescente de tempo controlado Enzimaimunoensaio fluorescente

59. ENSAIOS MULTIPARAMÉTRICOS Possibilitam a realização de múltiplos ensaios em um único tubo, com a mesma amostra e ao mesmo tempo Duas plataformas principais Microarranjos com proteínas ligadas (chips) Microarranjos com micropartículas (suspensão)

60. SINAL Expressão de um teste sorológico que resulta da integração de um número variável de impulsos elementares, cada um destes correspondendo à reação de uma molécula de anticorpos com o determinante antigênico para o qual mostra afinidade

61. RUÍDO impulsos resultantes de reatividade inespecífica e que interferem na capacidade discriminativa do teste Ideal: SINAL>>>> RUÍDO

62. LIMIAR DE DETECÇÃO número de impulsos necessários para desencadear o sinal. Varia entre as diferentes técnicas imunológicas