Informe de Práctica de Laboratorio de Sistema de Electroforesis.pdf

Curso de Biotecnología

1. Arocutipa Ticona, Miriam Elizabeth
Callacondo Guillen, Yoselyn
Florian Ope, Alanna Sasha
Huiza Lorenzo Paola Aracelli
Huayllani Huanca, Kassandra del Carmen
Mamani Alavarez, Olenka Fiorella
CURSO:
Biotecnología
DOCENTE:
Soto Gonzales, Hebert Hernan
ELABORADO POR:
Informe de
Práctica de
Laboratorio
de Sistema de
Electroforesis
2023

2. “AÑODELAUNIDAD,LAPAZYELDESARROLLO.”
UNIVERSIDADNACIONALDEMOQUEGUA
ESCUELAPROFESIONALDEINGENIERÍA
AMBIENTAL
BIOTECNOLOGÍA
“INFORMEDEPRACTICADELABORATORIODESISTEMADE
ELECTROFORESIS”
DOCENTE:
BLGO.SOTOGONZALES,HEBERTHERNAN
INTEGRANTES:
AROCUTIPATICONA,MIRIAMELIZABETH
CALLACONDO GUILLEN,YOSELYN
FLORIANOPE,ALANNASASHA
HUAYLLANIHUANCA,KASSANDRADELCARMEN
HUIZALORENZO,PAOLAARACELLI
MAMANIALVAREZ,OLENKAFIORELLA
ILO,14DEJULIODEL2023
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3. UNIVERSIDADNACIONALDEMOQUEGUA
ESCUELAPROFESIONALDEINGENIERÍAAMBIENTAL
ÍNDICE
1.INTRODUCCIÓN ................................................................................................................3
2.OBJETIVOS.........................................................................................................................4
2.1.ObjetivoGeneral...........................................................................................................4
2.2.ObjetivosEspecíficos....................................................................................................4
3.MARCOTEÓRICO............................................................................................................4
¿QuéeselADN?..................................................................................................................4
¿QuéeselGeldeAgarosa?..................................................................................................5
SistemadeElectroforesis.....................................................................................................7
4.LISTADODELMATERIALNECESARIO......................................................................8
MATERIALES.....................................................................................................................8
EQUIPOS.............................................................................................................................9
REACTIVOS.....................................................................................................................10
5.METODOLOGÍA...............................................................................................................11
PreparacióndelGeldeAgarosa.........................................................................................11
Electroforesis......................................................................................................................14
6.RESULTADOS...................................................................................................................18
7.DISCUSIÓN........................................................................................................................18
8.CONCLUSIONES ..............................................................................................................19
9.BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................19
10.ANEXOS...........................................................................................................................20
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4. UNIVERSIDADNACIONALDEMOQUEGUA
ESCUELAPROFESIONALDEINGENIERÍAAMBIENTAL
1.INTRODUCCIÓN
Elaceleradodesarrollodelastécnicasdelaboratorioconllevaconsigounacantidadde
metodologías,lascualesunaomásmetodologíasllevaríanaunmismofin,solosiel
casolopermite.
Enestecasoelsistemadeelectroforesisengelesdeagarosaesunadelas
metodologíasmásutilizadasenellaboratorioentodolorelacionadoconeltrabajo
conácidosnucleicos.Asímismo,mediantelaelectroforesissepuedeseparar
fragmentosdeADNyARNenfuncióndesutamaño,visualizarlosmedianteuna
sencillatinción,ydeestaformadeterminarelcontenidodelosácidosnucleicosde
unamuestra,teniendounaestimacióndesuconcentraciónygradodeentereza.
PodemosademásextraerdelgellosfragmentosdeADNqueseandeinterés,para
posteriormenteutilizarlosendiferentesaplicaciones.
Laideadeutilizarlatécnicadeelectroforesisatravésdeunamatrizparaanalizar
muestrasdeADNcorrespondeaVinThorne(bioquímicodelInstitutodeVirologíade
Glasgow).Surazonamientoeraqueunacombinacióndefuerzaseléctricasyde
fricciónpermitiríaeldesplazamientoyseparaciónenfuncióndeltamañootopología
endiferentesmoléculasdeADN,esteeraelprincipioenquesebasabala
electroforesisdeácidosnucleicos.
Enelpresenteinformedescribiremoslaprácticadesarrolladaenellaboratoriode
biotecnología,elcualnosmostróeldesarrollodelsistemadeelectroforesisusandoel
geldeagarosa,veremoselprincipio,elprocedimiento,losmaterialescomotambién
elresultadodeestapráctica.CaberesaltarquelaelectroforesisdeADNfue,ysigue
siendo,unaherramientadeimportanciaprimordialeneldesarrollodelastécnicasdel
ADNrecombinanteoingenieríagenética,además,suconocimientoydesarrolloes
útilparafuturasinvestigacionesquerequieranesteprocedimiento.
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2.OBJETIVOS
2.1.ObjetivoGeneral
-ConocereldesarrollodelsistemadeelectroforesisdeADN.
2.2.ObjetivosEspecíficos
-Hacerunadescripcióndetodaslasetapasdelatécnicadelsistemade
electroforesis,parallevaraunbuenymejorentendimiento.
-Conocerelresultadodelatécnicaconlascuatromuestrasutilizadasenel
desarrollodelapráctica.
3.MARCOTEÓRICO
¿QuéeselADN?
ElADNeslabasedelosorganismosvivosyasuvezcontieneelcódigoo
instruccionesquelocomponen.ElADNconstadedoscadenas,cadaunadelascuales
estáformadapornucleótidos.Cadanucleótidoasuvezconstadeunazúcar
(desoxirribosa),ungrupofosfatoyunabasenitrogenada.Haycuatrobases
nitrogenadas:adenina(A),timina(T),citosina(C)yguanina(G),yAsiemprees
opuestaaTyCenladoblecadena.Podríadecirsequelascausasopuestasson
complementarias.ElADNtienelaformadeunadoblehélice,cuyosladosson
cadenasdeazúcaresyfosfatosunidosabasesnitrogenadas.UnamoléculadeADN
estáunidaaproteínasllamadashistonas,queestánfuertementeenrolladasy
compactadasparaformaruncromosoma.
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6. UNIVERSIDADNACIONALDEMOQUEGUA
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UnaprioridadimportantedelADNesquepuedereplicarseohacerdesímismo,cada
cadenadeADNenladoblehélicepuedeservircomopatrónparaduplicarla
secuenciadebases,copiaexactadeADNpresenteenlacélulaantigua.
Lasmacromoléculasbasedelaherencia(ADN),elnucleicoquecontienela
informacióndelascaracterísticas,ensegmentosdenominadosgenesoempaquetada
encromosomas.
Figura1:EstructuradelADN.
¿QuéeselGeldeAgarosa?
Laagarosaesunpolímerolinealdegalactosayelgelseobtienedisolviendoagarosa
entampónTAEoTBEyfundiéndoseenunhornodemicroondashastaobteneruna
soluciónhomogéneaytransparente.Seviertelasoluciónenunmoldeysecolocaun
peine(elpeineformalospozosenlosquesecolocanlasmuestras).Estosedeja
enfriarparapolimerizarparaformarunamatrizporosa,dondeeltamañodelosporos
varíasegúnlaconcentracióndeagarosaenlasolución.Además,lamigracióndelos
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7. UNIVERSIDADNACIONALDEMOQUEGUA
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fragmentosdeADNvaríasegúneltamaño,laformadelamolécula(lineal,circular,
superenrollada),laconcentracióndeagarosaenelgel,elvoltaje,ladireccióndel
campoeléctrico,lapresenciadecolorantesañadidos.queseintercalanenelgel.
ADN(comobromurodeetidioyverdeSYBR)ycomposicióndeltampónenelgel.
Elgelcontienecapilaresmicroscópicosqueactúancomo"tamices"moleculares,las
propiedadesdelgeldeterminanlavelocidaddemigracióndelasmoléculas:las
pequeñasmoléculasmigranmásrápidamentequelasgrandes,además,lasmoléculas
demismamasaycargapuedentenerformasdistintas:lasdeformamáscompacta(las
formasredondeadassonmáscompactasquelasformasalargadas)migranmás
rápidamente.
Figura2:ProcedimientoparaGeldeAgarosa.
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8. UNIVERSIDADNACIONALDEMOQUEGUA
ESCUELAPROFESIONALDEINGENIERÍAAMBIENTAL
SistemadeElectroforesis
Laelectroforesisesunatécnicadeseparaciónmuyusadaenlasinvestigacionesde
proteínasyácidosnucleicos,quesebasaenlamovilizacióndelasmoléculas
disueltasenunasolucióndeelectrolitosatravésdeungelporlaaccióndelacorriente
eléctrica.Estatécnicafuedesarrolladabasándoseeninvestigacionesadelantadaspor
variosinvestigadoresinteresadosenexplicarporquélosionesdisueltosenaguase
muevenbajolainfluenciadeunacorrienteeléctrica,dichasinvestigaciones
describieronlamigracióndelosionesyelordenenquelohacían,peronolograron
separarmoléculasopartículas.
LacargadelasmoléculasesinfluenciadaporelpHdelasolución(medidadela
acidezoalcalinidad)yéstaescontroladaenlaelectroforesiscon
solucionesamortiguadorascomoelqueseutilizaparacargarlamuestra,elque
seutilizaenelgelyeldecorridadelaelectroforesis.Unasolución
amortiguadoraesdefinidacomounsistemaquímicoqueprevienecambiosdepH
cuandoionesdehidrógenosonremovidosoañadidosenlasoluciónquemantienen
elpHaproximadamentea8.3.
Lastécnicasdeelectroforesisrevolucionaronlosmétodosdeanálisisdebiomoléculas
ylacaracterizacióndemicroorganismosendiversoscamposdelasciencias
biológicascomolasmicrociencias(genómica,transcriptómica,proteómica,
metagenómica)porqueestastécnicassecombinabanconotrasplataformascomola
PCR,técnicasdesecuenciacióndenuevageneración.yespectroscopiademasas
combinadacon,entreotrascosas,cromatografíalíquida,quepermitióunamejor
resoluciónyprecisióndelosresultadosdelaspruebas.Sinembargo,laslimitaciones
asociadasconestatecnologíadebenabordarseparamejorarlacomposición,
funcionamientoycambioseneltiempodelossistemasbiológicos.
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9. UNIVERSIDADNACIONALDEMOQUEGUA
ESCUELAPROFESIONALDEINGENIERÍAAMBIENTAL
4.LISTADODELMATERIALNECESARIO
MATERIALES
Papelaluminio Guantesdelátex
Parafilm Probetas
Tijeras Micropipetasypuntasdesechablesparalas
mismas
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10. UNIVERSIDADNACIONALDEMOQUEGUA
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Bolsaziploc Tuboseppendorfde1,5mL
EQUIPOS
Balanzaanalítica Microondasoplacacalefactora
Equipodetratamientodeimageny
fotografíatérmica
Equipodeelectroforesis(cubeta,soporte,
peine,fuentedealimentación)
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11. UNIVERSIDADNACIONALDEMOQUEGUA
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PowerpacBásicoBio-Rad Fotodocumentadordegeles
REACTIVOS
AgarosadeMacroalgas 1kbDNA(1μl)
Tris-Acetate-EDTA(TAE)(20ml)ADN3decangrejo(4μl)
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12. UNIVERSIDADNACIONALDEMOQUEGUA
ESCUELAPROFESIONALDEINGENIERÍAAMBIENTAL
Aguadestilada ADN4decangrejo(4μl)
Tampóndecargadelasmuestras.BromurodeEtidio(BrEt)
5.METODOLOGÍA
PreparacióndelGeldeAgarosa
Paso1:
Prepararemoselgeldeagarosaal1%,paraelloenunpedazodepapelaluminio,
pesamos1gramodeagarosa.
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13. UNIVERSIDADNACIONALDEMOQUEGUA
ESCUELAPROFESIONALDEINGENIERÍAAMBIENTAL
Figura3:PesarlaAgarosadeMacroalgas.
Paso2:
AhoratomaremoselTris-Acetate-EDTA(TAE),tomaremos20mldeTAEylo
colocaremosenunaprobeta,endondetambiénsecolocará980mldeaguadestilada
paraaforarhasta1000mldelaprobeta.
Figura4:Preparacióndesoluciónde1xt.
Paso3:
Despuésdehaberaforadolaprobeta,lotapamosconParafilmyremovemospara
mezclarlo.Estasoluciónseránuestra1xtylovaciamosenunabotelladevidrio.
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14. UNIVERSIDADNACIONALDEMOQUEGUA
ESCUELAPROFESIONALDEINGENIERÍAAMBIENTAL
Figura5:Preservarlasoluciónde1xt.
Paso4:
Enunfrascodepyrex,vertemoslaagarosaquepesamosanteriormenteyañadiremos
100mldelamuestrade1xt.Moveremoselfrascoconlasolución.
Figura6:PreparacióndelGeldeAgarosa.
Paso5:
Colocamoselfrascoconlasoluciónenelmicroondaspor1minutoymediopara
homogeneizarlamuestra.Luegoesperamosuntiempoparaquebajesutemperaturay
podermanipularlo.
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15. UNIVERSIDADNACIONALDEMOQUEGUA
ESCUELAPROFESIONALDEINGENIERÍAAMBIENTAL
Figura7:Llevaralmicroondaslasoluciónyenfriar.
Electroforesis
Paso6:
Armaremoslacubetadeelectroforesis,colocaremoslasplacasaloscostados,y
tambiénelpeine.
Figura8:Armadodelacubeta.
Paso7:
Unavezarmadolacubetavertemoslasoluciónpreparadayesperamosuntiempopara
quesesolidifique.
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16. UNIVERSIDADNACIONALDEMOQUEGUA
ESCUELAPROFESIONALDEINGENIERÍAAMBIENTAL
Figura9:Verterelgeldeagarosa.
Paso8:
Unavezsolidificado,quitamoselpeineylasplacas,yvertemosenlacubetala
solución1xtTAE.
Figura10:Vertemoslasolución1xtTAE.
Paso9:
EnunpedazodeParafilmcolocaremos4muestraslascualescontendrán4microlitros
decolorante.
●Enlaprimeramuestrasecolocará1microlitrode1kbDNA.
●Enlasegundamuestrasecolocará4microlitrosdeADN3decangrejo
●Enlaterceramuestrasecolocará4microlitrosdeADN4decangrejo.
●Enlacuartamuestranosecolocaránada,yseránuestroblanco.
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17. UNIVERSIDADNACIONALDEMOQUEGUA
ESCUELAPROFESIONALDEINGENIERÍAAMBIENTAL
Figura11:Preparacióndelasmuestras.
Paso10:
Conayudadeunamicropipeta,colocaremosnuestrasmuestrasenlosorificiosdejados
porelpeine,enelmismoordenporelcualfueronelaborados.
Figura12:Colocacióndelasmuestrasenelgeldeagarosa.
Paso11:
TaparemoslacubetaylaconectaremosconelPowerpacBásicoBio-Rad.
Encendemoselaparatoyesperamosalrededorde1hora.
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18. UNIVERSIDADNACIONALDEMOQUEGUA
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Figura13:FuncionamientodelPowerpacBásico.
Paso12:
Luegodehaberpasadolahora,loqueharemosescolocareldeagarosaconnuestras
muestrasycolocarlasenunrecipientecubiertoconpapelaluminioelcualcontendrá
bromurodeetidio,dejamosreposarpor10minutos.
Figura14:Reposodelgeldeagarosaenelbromurodeetidio.
20Paso13:
Losacamosylocolocamosenunabolsaziplocyluegolocolocamosenel
fotodocumentadordegelesyesperamosnosarrojenlosresultados.
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19. UNIVERSIDADNACIONALDEMOQUEGUA
ESCUELAPROFESIONALDEINGENIERÍAAMBIENTAL
6.RESULTADOS
LaelectroforesispermitealoscientíficossepararlashebrasdeADN,permitiendoasí
facilitarlaidentificaciónyexaminacióndesuscomponentes.AmedidaqueelADN
semueveatravésdelgel,ayudaasepararlasseccionesmayoresymenoresentresí.
Parayafinalizar,unavezcolocadoenelfotodocumentadordegeles,seesperó1
horaysefueaverlosresultados,loscualesfueronlossiguientesquesemuestranen
lafigura15.
Figura15:Lecturadelosresultados.
Podemosobservarlasbandasdelosgelesposterioresalaelectroforesisrealizada.
7.DISCUSIÓN
Segúnlosresultadosobtenidosenlaprácticadelaboratoriorealizada,podemos
afirmarqueelsistemadeelectroforesisescapazdesepararcualquiertipodemuestra
ADNsegúneltamañoquepresente.LasmuestrasdeADNsecarganenpozosque
vienenaserlasranuras,aplicadasenunextremodelgelalacualseleaplicauna
corrienteeléctricaparaserarrastradasatravésdelgel.
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20. UNIVERSIDADNACIONALDEMOQUEGUA
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Unodelosfragmentospresentacarganegativadebidoaestosemuevenhaciael
electrodopositivo,ytodograciasalgrupofosfato,yestounovesexpuestoaun
campoyaunbuffer,haciaelladopositivoesdondeserealizalaelectroforesis,yde
talmaneraescomosepresentanlosresultadosobservándosemediantela
fluorescencia.
8.CONCLUSIONES
Enconclusión,elsistemadeelectroforesisimplementadodemostróseruna
herramientaeficazparaelanálisisdemuestrasdeADN.Elprocesodepreparacióndel
geldeagarosa,lacargadelasmuestrasylaaplicacióndecorrienteeléctrica
permitieronlaseparaciónyvisualizacióndelosfragmentosdeADN.Estosresultados
contribuyenalconocimientoycomprensióndelaestructuraycomposicióngenética
delasmuestrasanalizadas.
9.BIBLIOGRAFÍA
●Fierro,F.F.(2014).ElectroforesisdeADN.Herramientasmoleculares
aplicadasenecología:aspectosteóricosyprácticos,27.
●PérezdeCastro,A.M.(2010).Electroforesisengeldeagarosa.
●PérezCardona,A.,&GómezPiñerez,L.M.(2018).Electroforesisdeácido
desoxirribonucleico(ADN)engeldeagarosa.
●Porath,J.,Aspberg,K.,Drevin,H.,&Axen,R.(1973).Preparationof
cyanogenbromide-activatedagarosegels.JournalofChromatographyA,86,
53-56.
●Miguel-Morales,M.,Díaz-Barroso,M.,Garrote-Santana,H.,Uley-del
Rosario,G.,Pérez-DiezdelosRíos,G.,&Estrada-delCueto,M.(2012).
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21. UNIVERSIDADNACIONALDEMOQUEGUA
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CuantificacióndehemoglobinaA2porelectroforesisengeldeagarosa.
RevistaCubanadeHematología,InmunologíayHemoterapia,28(4),
423-427.
●AndrésColás,N.,&Yenush,L.P.(2021).Electroforesisengelde
poliacrilamida.
10.ANEXOS
AnexoN°01Geldeagarosasolidificado
AnexoN°02Muestradegeldeagarosaenmicroondas
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