Khóa luận Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virus
driversvn
11 views
95 slides
Nov 01, 2024
Slide 1 of 95
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
About This Presentation
Begomovirus gây bệnh trên các loại cây đều có các triệu chứng đặc trưng, điển hình là: cuốn lá (cong lại hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lá nhỏ hẹp; cây nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh tí...
Slide Content
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA NÔNG HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI
“Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam
virus ”
Giảng viên hướng dẫn : TS.Hà Viết Cường
Họ và tên : Hà Văn Dũng
Lớp : BVTVB-K55
Chuyên ngành : Bảo vệ thực vật
Hà Nội-2014
https://drivers.vn/
KHOA NÔNG HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI
“Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam
virus ”
Giảng viên hướng dẫn : TS.Hà Viết Cường
Họ và tên : Hà Văn Dũng
Lớp : BVTVB-K55
Chuyên ngành : Bảo vệ thực vật
Hà Nội-2014
https://drivers.vn/
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình hoàn thành báo cáo này ngoài những nỗ lực của bản thân,
tôi đã nhận được những sự giúp đỡ hết sức tận tình và quý báu từ nhiều tập thể và cá
nhân.
Trước hết tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới thầy TS.
Hà Viết Cường – Giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới – Trường Học
viện nông nghiệp Việt Nam, Phó khoa Nông học và Ths. Trần Thị Như Hoa - Phó
giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình
chỉ bảo và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành báo cáo.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới cán bộ công nhân viên thuộc
Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới – Trường Học viện nông nghiệp Việt
Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực tập tại Trung tâm.
Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy giáo, Cô giáo trong bộ
môn bệnh cây cũng như các Thầy cô trong khoa Nông học, Trường Học viện nông
nghiệp Việt Nam đã nhiệt tình dạy dỗ, chỉ bảo cho tôi trong suốt thời gian tôi học
tập tại trường.
Cuối cùng tôi xin được chân thành cảm ơn những người thân, gia đình, bạn bè
đã hết lòng giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập cũng như hoàn thành báo cáo
này.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 31 tháng 7 năm 2014
Sinh viên
Hà Văn Dũng
https://drivers.vn/
Trong suốt quá trình hoàn thành báo cáo này ngoài những nỗ lực của bản thân,
tôi đã nhận được những sự giúp đỡ hết sức tận tình và quý báu từ nhiều tập thể và cá
nhân.
Trước hết tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới thầy TS.
Hà Viết Cường – Giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới – Trường Học
viện nông nghiệp Việt Nam, Phó khoa Nông học và Ths. Trần Thị Như Hoa - Phó
giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình
chỉ bảo và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành báo cáo.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới cán bộ công nhân viên thuộc
Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới – Trường Học viện nông nghiệp Việt
Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực tập tại Trung tâm.
Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy giáo, Cô giáo trong bộ
môn bệnh cây cũng như các Thầy cô trong khoa Nông học, Trường Học viện nông
nghiệp Việt Nam đã nhiệt tình dạy dỗ, chỉ bảo cho tôi trong suốt thời gian tôi học
tập tại trường.
Cuối cùng tôi xin được chân thành cảm ơn những người thân, gia đình, bạn bè
đã hết lòng giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập cũng như hoàn thành báo cáo
này.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 31 tháng 7 năm 2014
Sinh viên
Hà Văn Dũng
https://drivers.vn/
MỤC LỤC
1 ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................................. 10
1.1 Giới thiệu ............................................................................................................................... 10
1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài ........................................................................................ 11
1.2.1 Mục tiêu ......................................................................................................................... 11
1.2.2 Yêu cầu .......................................................................................................................... 11
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................................................ 12
2.1 Tầm quan trọng của ớt và cà chua .................................................................................. 12
2.2 Đặc điểm chung của Begomovirus ................................................................................. 12
2.2.1 Đặc điểm hình thái ...................................................................................................... 13
2.2.2 Cấu trúc genome của Begomovirus ....................................................................... 13
2.2.3 Cấu trúc của phân tử DNA-A .................................................................................. 14
2.2.4 Cấu trúc của phân tử DNA-B. ................................................................................. 15
2.2.5 Đặc điểm của vùng IR................................................................................................ 15
2.2.6 Phân loại các Begomovirus ...................................................................................... 16
2.2.7 Tái sinh của Begomovirus ........................................................................................ 16
2.2.8 Triệu chứng bệnh do Begomovirus ........................................................................ 17
2.2.9 Môi giới truyền bệnh và sự lan truyền ................................................................... 18
2.2.10 Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra .............................................................. 19
2.2.11 Phòng chống ................................................................................................................. 20
2.3 Một số begomovirus hại cà chua..................................................................................... 21
2.4 Một số begomovirus hại ớt ............................................................................................... 21
2.5 Kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR ......................................................................................... 22
2.5.1 Giới thiệu và nguyên lý ............................................................................................. 22
2.6 Kỹ thuật RCA (Rolling circle amplication) ................................................................. 23
2.7 Kĩ thuật Agroinoculation................................................................................................... 24
3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU ................................................................. 2
3.1 Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................................... 2
3.2 Địa điểm nghiên cứu và thời gian thực hiện .................................................................. 2
3.2.1 Địa điểm nghiên cứu .................................................................................................... 2
3.3 Thời gian thực hiện ............................................................................................................... 2
3.4 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................................... 2
3.4.1 Cây thí nghiệm: .............................................................................................................. 2
3.4.2 Thu thập mẫu .................................................................................................................. 3 https://drivers.vn/
1 ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................................. 10
1.1 Giới thiệu ............................................................................................................................... 10
1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài ........................................................................................ 11
1.2.1 Mục tiêu ......................................................................................................................... 11
1.2.2 Yêu cầu .......................................................................................................................... 11
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................................................ 12
2.1 Tầm quan trọng của ớt và cà chua .................................................................................. 12
2.2 Đặc điểm chung của Begomovirus ................................................................................. 12
2.2.1 Đặc điểm hình thái ...................................................................................................... 13
2.2.2 Cấu trúc genome của Begomovirus ....................................................................... 13
2.2.3 Cấu trúc của phân tử DNA-A .................................................................................. 14
2.2.4 Cấu trúc của phân tử DNA-B. ................................................................................. 15
2.2.5 Đặc điểm của vùng IR................................................................................................ 15
2.2.6 Phân loại các Begomovirus ...................................................................................... 16
2.2.7 Tái sinh của Begomovirus ........................................................................................ 16
2.2.8 Triệu chứng bệnh do Begomovirus ........................................................................ 17
2.2.9 Môi giới truyền bệnh và sự lan truyền ................................................................... 18
2.2.10 Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra .............................................................. 19
2.2.11 Phòng chống ................................................................................................................. 20
2.3 Một số begomovirus hại cà chua..................................................................................... 21
2.4 Một số begomovirus hại ớt ............................................................................................... 21
2.5 Kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR ......................................................................................... 22
2.5.1 Giới thiệu và nguyên lý ............................................................................................. 22
2.6 Kỹ thuật RCA (Rolling circle amplication) ................................................................. 23
2.7 Kĩ thuật Agroinoculation................................................................................................... 24
3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU ................................................................. 2
3.1 Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................................... 2
3.2 Địa điểm nghiên cứu và thời gian thực hiện .................................................................. 2
3.2.1 Địa điểm nghiên cứu .................................................................................................... 2
3.3 Thời gian thực hiện ............................................................................................................... 2
3.4 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................................... 2
3.4.1 Cây thí nghiệm: .............................................................................................................. 2
3.4.2 Thu thập mẫu .................................................................................................................. 3 https://drivers.vn/
3.4.3 Dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm của
PepYLCVNV ................................................................................................................................. 4
3.4.4 Chất kháng sinh ............................................................................................................ 6
3.4.5 Hóa chất, dung dịch đệm ............................................................................................. 7
3.4.6 Kit thương mại ............................................................................................................... 7
3.4.7 Môi trường ...................................................................................................................... 7
3.4.8 Các thiết bị chủ yếu ...................................................................................................... 8
3.4.9 Dụng cụ nghiên cứu ...................................................................................................... 8
3.5 Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................................... 9
3.5.1 Phương pháp điều tra đồng ruộng ............................................................................. 9
3.5.2 Thí nghiệm trong nhà lưới .......................................................................................... 9
3.5.3 Phương pháp kiểm tra virus bằng PCR ................................................................. 10
3.5.4 Tiến hành phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................. 11
3.5.5 Chạy điện di sản phẩm PCR và xem kết quả phản ứng .................................... 13
3.5.6 Tinh chiết sản phẩm điện di ..................................................................................... 13
3.5.7 Xây dựng cấu trúc xâm nhiễm ................................................................................. 13
3.5.8 Chuẩn bị E.coli chủng X1 Blue khả biến.............................................................. 14
3.5.9 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn E.coli khả biến bằng
phương pháp sốc nhiệt ............................................................................................................... 14
3.5.10 Phản ứng PCR kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc ......... 15
3.5.11 Tinh chiết plasmid ....................................................................................................... 15
3.5.12 Chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens khả biến (competent cells)....................... 16
3.5.13 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn A.tumefaciens khả biến ...
16
3.5.14 Xác định trình tự gen và xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng ... 18
3.5.15 Phản ứng PCR kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc ......... 18
3.5.16 Lây nhiễm nhân tạo sử dụng kỹ thuật agroinoculation ..................................... 19
3.5.17 Đánh giá tính gây bệnh .............................................................................................. 20
3.5.18 Lây nhiễm nhân tạo dùng bọ phấn .......................................................................... 21
3.5.19 Kiểm tra các mẫu bằng phản ứng ELISA ............................................................. 22
4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................................... 26
4.1 Kết quả kiểm tra một số loại virus gây hại trên ớt thu thập trên cả nước giai
đoạn 2012-2013 ............................................................................................................................... 58 https://drivers.vn/
PepYLCVNV ................................................................................................................................. 4
3.4.4 Chất kháng sinh ............................................................................................................ 6
3.4.5 Hóa chất, dung dịch đệm ............................................................................................. 7
3.4.6 Kit thương mại ............................................................................................................... 7
3.4.7 Môi trường ...................................................................................................................... 7
3.4.8 Các thiết bị chủ yếu ...................................................................................................... 8
3.4.9 Dụng cụ nghiên cứu ...................................................................................................... 8
3.5 Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................................... 9
3.5.1 Phương pháp điều tra đồng ruộng ............................................................................. 9
3.5.2 Thí nghiệm trong nhà lưới .......................................................................................... 9
3.5.3 Phương pháp kiểm tra virus bằng PCR ................................................................. 10
3.5.4 Tiến hành phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................. 11
3.5.5 Chạy điện di sản phẩm PCR và xem kết quả phản ứng .................................... 13
3.5.6 Tinh chiết sản phẩm điện di ..................................................................................... 13
3.5.7 Xây dựng cấu trúc xâm nhiễm ................................................................................. 13
3.5.8 Chuẩn bị E.coli chủng X1 Blue khả biến.............................................................. 14
3.5.9 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn E.coli khả biến bằng
phương pháp sốc nhiệt ............................................................................................................... 14
3.5.10 Phản ứng PCR kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc ......... 15
3.5.11 Tinh chiết plasmid ....................................................................................................... 15
3.5.12 Chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens khả biến (competent cells)....................... 16
3.5.13 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn A.tumefaciens khả biến ...
16
3.5.14 Xác định trình tự gen và xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng ... 18
3.5.15 Phản ứng PCR kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc ......... 18
3.5.16 Lây nhiễm nhân tạo sử dụng kỹ thuật agroinoculation ..................................... 19
3.5.17 Đánh giá tính gây bệnh .............................................................................................. 20
3.5.18 Lây nhiễm nhân tạo dùng bọ phấn .......................................................................... 21
3.5.19 Kiểm tra các mẫu bằng phản ứng ELISA ............................................................. 22
4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................................... 26
4.1 Kết quả kiểm tra một số loại virus gây hại trên ớt thu thập trên cả nước giai
đoạn 2012-2013 ............................................................................................................................... 58 https://drivers.vn/
4.1.1 Kiểm tra virus gây hại thu thập ngoài đồng từ các địa điểm điều tra giai
đoạn 2012-2013 bằng phương pháp ELISA ........................................................................ 58
4.1.2 Kiểm tra virus gây hại thu thập ngoài đồng từ các địa điểm điều tra giai
đoạn 2012-2013 bằng phản ứng PCR .................................................................................... 60
4.2 Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng kĩ
thuật agroinoculation ...................................................................................................................... 26
4.2.1 Phục hồi các dòng vi khuẩn A. tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm của
PepYLCVNV ............................................................................................................................... 28
Bảng 4.1. Kết quả phục hồi 2 dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiêm của PepYLCVNV
..................................................................................................................... Error! Bookmark not defined.
4.2.2 Nhân sinh khối dòng vi khuẩn A.tumerfaciens trong môi trường LB-lỏng .... 30
4.2.3 Kết quả đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng phương pháp
Agroinoculation ........................................................................................................................... 30
4.2.4 Tính gây bệnh của DNA-A (lây nhiễm bằng agroinoculation)....................... 32
4.2.5 Tính gây bệnh của cả DNA-A & DNA-B (lây nhiễm bằng agroinoculation)
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 36
4.3 Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng bọ
phấn .................................................................................................................................................. 39
4.3.1 Lây nhiễm PepYLCVNV bằng cây cà tím nguồn bệnh .................................... 41
4.3.2 Lây nhiễm PepYLCVNV bằng cây ớt nguồn bệnh ........................................... 42
4.4 Đánh giá tính kháng của PepYLCVNV trên tập đoàn giống ớt của AVRDC .... 43
4.4.1 Thiết kế cấu trúc xâm nhiễm của PepYLVNV ................................................... 44
4.4.2 Chuẩn bị vector pCAMBIA2300 ............................................................................ 46
5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................................................... 64
5.1 Kết luận .................................................................................................................................. 64
5.2 Kiến nghị ............................................................................................................................... 64
6 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 0
6.1 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ..................................................................................................... 0
6.2 TÀI LIỆU TIẾNG ANH ..................................................................................................... 0
6.3 CÁC TRANG WEB .............................................................. Error! Bookmark not defined.
https://drivers.vn/
đoạn 2012-2013 bằng phương pháp ELISA ........................................................................ 58
4.1.2 Kiểm tra virus gây hại thu thập ngoài đồng từ các địa điểm điều tra giai
đoạn 2012-2013 bằng phản ứng PCR .................................................................................... 60
4.2 Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng kĩ
thuật agroinoculation ...................................................................................................................... 26
4.2.1 Phục hồi các dòng vi khuẩn A. tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm của
PepYLCVNV ............................................................................................................................... 28
Bảng 4.1. Kết quả phục hồi 2 dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiêm của PepYLCVNV
..................................................................................................................... Error! Bookmark not defined.
4.2.2 Nhân sinh khối dòng vi khuẩn A.tumerfaciens trong môi trường LB-lỏng .... 30
4.2.3 Kết quả đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng phương pháp
Agroinoculation ........................................................................................................................... 30
4.2.4 Tính gây bệnh của DNA-A (lây nhiễm bằng agroinoculation)....................... 32
4.2.5 Tính gây bệnh của cả DNA-A & DNA-B (lây nhiễm bằng agroinoculation)
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 36
4.3 Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng bọ
phấn .................................................................................................................................................. 39
4.3.1 Lây nhiễm PepYLCVNV bằng cây cà tím nguồn bệnh .................................... 41
4.3.2 Lây nhiễm PepYLCVNV bằng cây ớt nguồn bệnh ........................................... 42
4.4 Đánh giá tính kháng của PepYLCVNV trên tập đoàn giống ớt của AVRDC .... 43
4.4.1 Thiết kế cấu trúc xâm nhiễm của PepYLVNV ................................................... 44
4.4.2 Chuẩn bị vector pCAMBIA2300 ............................................................................ 46
5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................................................... 64
5.1 Kết luận .................................................................................................................................. 64
5.2 Kiến nghị ............................................................................................................................... 64
6 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 0
6.1 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ..................................................................................................... 0
6.2 TÀI LIỆU TIẾNG ANH ..................................................................................................... 0
6.3 CÁC TRANG WEB .............................................................. Error! Bookmark not defined.
https://drivers.vn/
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu Từ viết tắt
A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
AS Acetosyringone
ATP Adenosine triphosphate
Bb Base pair
CP Capsid protein
CTAB Cetryl Ammonium Bromide
ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate
DNA Deoxyribonucleic acid
Dntp Deoxynucleoside triphosphate
dsDNA Double strand DNA
E.coli Escherichia coli
EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid
ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses
IR Itergenic region
Kb Kilo base
LB Luria and Bertani
ORF Open reading frame
PCR Polymerase Chain Reaction
RCA Rolling circle amplification
RE Restriction enzyme
Rep Replication protein
RNA Ribonucleic acid
Rnase Ribonuclease
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
SsDNA Singe strand DNA
TAE Tris – acetate – EDTA
Taq Thermus aquatic
Vir Virulence region
β- ME Beta- Mercaptoethanol
https://drivers.vn/
Ký hiệu Từ viết tắt
A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
AS Acetosyringone
ATP Adenosine triphosphate
Bb Base pair
CP Capsid protein
CTAB Cetryl Ammonium Bromide
ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate
DNA Deoxyribonucleic acid
Dntp Deoxynucleoside triphosphate
dsDNA Double strand DNA
E.coli Escherichia coli
EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid
ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses
IR Itergenic region
Kb Kilo base
LB Luria and Bertani
ORF Open reading frame
PCR Polymerase Chain Reaction
RCA Rolling circle amplification
RE Restriction enzyme
Rep Replication protein
RNA Ribonucleic acid
Rnase Ribonuclease
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
SsDNA Singe strand DNA
TAE Tris – acetate – EDTA
Taq Thermus aquatic
Vir Virulence region
β- ME Beta- Mercaptoethanol
https://drivers.vn/
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.4. Cây thí nghiệm ........................................................................................ 2
Bảng 3.3. Các mẫu ớt, cà tím thu thập (2013) ........................................................ 3
Bảng 3.1. Thang phân cấp bệnh ............................................................................ 10
Bảng 3.6. Thí nghiệm lây nhiễm được thực hiện với các công thức .................... 19
Bảng 4.1. Kết quả kiểm tra ELISA các mẫu ớt thu được tại Việt Nam giai đoạn
2012-2013 .............................................................................................................. 58
Bảng 4.2. Kết quả kiểm tra các mẫu ớt bằng PCR sử dụng cặp mồi BegoA – For1
và BegoA – Rev1 .................................................................................................. 61
Bảng 5. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A giống cà chua
Hồng Lan (T20) ..................................................................................................... 33
Bảng 5. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A giống ớt Hiểm
Lai F1-207 ............................................................................................................. 34
Bảng 4.13. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A trên cây chỉ
thị. .......................................................................................................................... 35
Bảng 5. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và DNA-B
trên giống cà chua Hồng Lan (T20) ...................................................................... 36
Bảng 5. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và DNA-B
trên giống ớt Hiểm Lai F1-207 .............................................................................. 37
Bảng 4.13. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và DNA-
B trên cây chỉ thị. .................................................................................................. 38
Bảng 7. Kết quả lây nhiễm PepYLCV bằng bọ phấn trên cây cà tím nguồn bệnh
............................................................................................................................... 41
Bảng 8. Kết quả lây nhiễm PepYLCV bằng bọ phấn trên cây ớt nguồn bệnh ..... 42
Bảng 4.10. Cấp bệnh xoăn vàng lá của các giống ớt AVRDC ............................. 43
Bảng 4.3. Tóm tắt các bước xây dựng cấu trúc xâm nhiễm .................................. 45
Bảng 4.4. Hiệu quả xử lý sản phẩm RCA với các phương pháp chiết khác nhau 48
Bảng 4.5. Tối ưu hóa điều kiện cho phản ứng cắt không hoàn toàn sản phẩm RCA
của PepYLCV ........................................................................................................ 49
https://drivers.vn/
Bảng 3.4. Cây thí nghiệm ........................................................................................ 2
Bảng 3.3. Các mẫu ớt, cà tím thu thập (2013) ........................................................ 3
Bảng 3.1. Thang phân cấp bệnh ............................................................................ 10
Bảng 3.6. Thí nghiệm lây nhiễm được thực hiện với các công thức .................... 19
Bảng 4.1. Kết quả kiểm tra ELISA các mẫu ớt thu được tại Việt Nam giai đoạn
2012-2013 .............................................................................................................. 58
Bảng 4.2. Kết quả kiểm tra các mẫu ớt bằng PCR sử dụng cặp mồi BegoA – For1
và BegoA – Rev1 .................................................................................................. 61
Bảng 5. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A giống cà chua
Hồng Lan (T20) ..................................................................................................... 33
Bảng 5. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A giống ớt Hiểm
Lai F1-207 ............................................................................................................. 34
Bảng 4.13. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A trên cây chỉ
thị. .......................................................................................................................... 35
Bảng 5. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và DNA-B
trên giống cà chua Hồng Lan (T20) ...................................................................... 36
Bảng 5. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và DNA-B
trên giống ớt Hiểm Lai F1-207 .............................................................................. 37
Bảng 4.13. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và DNA-
B trên cây chỉ thị. .................................................................................................. 38
Bảng 7. Kết quả lây nhiễm PepYLCV bằng bọ phấn trên cây cà tím nguồn bệnh
............................................................................................................................... 41
Bảng 8. Kết quả lây nhiễm PepYLCV bằng bọ phấn trên cây ớt nguồn bệnh ..... 42
Bảng 4.10. Cấp bệnh xoăn vàng lá của các giống ớt AVRDC ............................. 43
Bảng 4.3. Tóm tắt các bước xây dựng cấu trúc xâm nhiễm .................................. 45
Bảng 4.4. Hiệu quả xử lý sản phẩm RCA với các phương pháp chiết khác nhau 48
Bảng 4.5. Tối ưu hóa điều kiện cho phản ứng cắt không hoàn toàn sản phẩm RCA
của PepYLCV ........................................................................................................ 49
https://drivers.vn/
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Hình thái của begomovirus ................................................................... 13
Hình 2.2. Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B của begomovirus ........................... 14
Hình 2.3. Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus ......................................... 14
Hình 2.4. Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus ......................................... 15
Hình 2.5. Triệu chứng do Begomovirus gây ra trên ớt và cà chua ....................... 18
Hình 2.6. Bọ phấn Bemisia tabaci ........................................................................ 19
Hình 3.1. Sơ đồ tổ chức bộ gen DNA-A ................................................................. 5
Hình 4.32. Kết quả ELISA phát hiện ChiVMV .................................................... 60
Hình 4.1. Triệu chứng của Begomovirus gây hại trên ớt tại Đà Nẵng ................. 62
Hình 4.2. Kiểm tra PCR các mẫu đậu đỗ bằng cặp mồi cặp mồi BegoA – For1 và
BegoA – Rev1 ....................................................................................................... 62
Bảng 4.1. Kết quả phục hồi 2 dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiêm của
PepYLCVNV ........................................................ Error! Bookmark not defined.
Hình 4.2. Dòng vi khuẩn A.tumerfaciens chứa cấu trúc xâm nhiễm PepYLCVNV
nuôi trong LB – lỏng ............................................................................................. 30
Hình4.6. Phương pháp tiêm trực tiếp dịch vi khuẩn vào mô lá ............................ 32
Hình 4.3. Sơ đồ các bước xây dựng cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV sử
dụng kỹ thuật RCA ................................................................................................ 45
Hình 4.4. Sơ đồ vector pCAMBIA2300 ............................................................... 46
Hình 4.5.Điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid sử dụng cặp mồi
pCAMseqF1/R ....................................................................................................... 47
Hình 4.11. Điện di sản phẩm khi mở vòng pCAMBIA 2300 bằng BamHI ......... 47
Hình 4.8. Xử lý sản phẩm RCA mẫu VNP1500 bằng cách cắt hoàn toàn với
enzyme BamHI 10 u/µl ......................................................................................... 49
Hình 4.9.Cắt không triệt để sản phẩm RCA ở các điều kiện khác nhau ............... 50
https://drivers.vn/
Hình 2.1. Hình thái của begomovirus ................................................................... 13
Hình 2.2. Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B của begomovirus ........................... 14
Hình 2.3. Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus ......................................... 14
Hình 2.4. Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus ......................................... 15
Hình 2.5. Triệu chứng do Begomovirus gây ra trên ớt và cà chua ....................... 18
Hình 2.6. Bọ phấn Bemisia tabaci ........................................................................ 19
Hình 3.1. Sơ đồ tổ chức bộ gen DNA-A ................................................................. 5
Hình 4.32. Kết quả ELISA phát hiện ChiVMV .................................................... 60
Hình 4.1. Triệu chứng của Begomovirus gây hại trên ớt tại Đà Nẵng ................. 62
Hình 4.2. Kiểm tra PCR các mẫu đậu đỗ bằng cặp mồi cặp mồi BegoA – For1 và
BegoA – Rev1 ....................................................................................................... 62
Bảng 4.1. Kết quả phục hồi 2 dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiêm của
PepYLCVNV ........................................................ Error! Bookmark not defined.
Hình 4.2. Dòng vi khuẩn A.tumerfaciens chứa cấu trúc xâm nhiễm PepYLCVNV
nuôi trong LB – lỏng ............................................................................................. 30
Hình4.6. Phương pháp tiêm trực tiếp dịch vi khuẩn vào mô lá ............................ 32
Hình 4.3. Sơ đồ các bước xây dựng cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV sử
dụng kỹ thuật RCA ................................................................................................ 45
Hình 4.4. Sơ đồ vector pCAMBIA2300 ............................................................... 46
Hình 4.5.Điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid sử dụng cặp mồi
pCAMseqF1/R ....................................................................................................... 47
Hình 4.11. Điện di sản phẩm khi mở vòng pCAMBIA 2300 bằng BamHI ......... 47
Hình 4.8. Xử lý sản phẩm RCA mẫu VNP1500 bằng cách cắt hoàn toàn với
enzyme BamHI 10 u/µl ......................................................................................... 49
Hình 4.9.Cắt không triệt để sản phẩm RCA ở các điều kiện khác nhau ............... 50
https://drivers.vn/
TÓM TẮT
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu tập trung chủ yếu về
begomovirus đó là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) gây bệnh
xoăn vàng lá trên ớt và cà chua.
Đánh giá đặc trưng sinh học bằng cách đánh giá tính gây bệnh thông qua
Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation), đồng thời chúng tôi tiến hành lây
nhiễm PepYLCVNV thông qua môi giới truyền bệnh trung gian là bọ phấn..
Dựa trên mồi đặc hiệu và mồi chung, các phản ứng PCR đã được thực hiện
trên một loạt các mẫu ớt thu tại miền Bắc và miền Trung Việt Nam nhằm phát hiện
PepYLCV và begomovirrus khác. Lần đầu tiên phát hiện sự có mặt của
begomovirrus trên ớt tại miền Bắc.
Chúng tôi đã tiến hành xây dựng thành công cấu trúc xâm nhiễm của
PepYLCVNV, phân tích đặc trưng phân tử của của PepYLCVNV.
https://drivers.vn/
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu tập trung chủ yếu về
begomovirus đó là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) gây bệnh
xoăn vàng lá trên ớt và cà chua.
Đánh giá đặc trưng sinh học bằng cách đánh giá tính gây bệnh thông qua
Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation), đồng thời chúng tôi tiến hành lây
nhiễm PepYLCVNV thông qua môi giới truyền bệnh trung gian là bọ phấn..
Dựa trên mồi đặc hiệu và mồi chung, các phản ứng PCR đã được thực hiện
trên một loạt các mẫu ớt thu tại miền Bắc và miền Trung Việt Nam nhằm phát hiện
PepYLCV và begomovirrus khác. Lần đầu tiên phát hiện sự có mặt của
begomovirrus trên ớt tại miền Bắc.
Chúng tôi đã tiến hành xây dựng thành công cấu trúc xâm nhiễm của
PepYLCVNV, phân tích đặc trưng phân tử của của PepYLCVNV.
https://drivers.vn/
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu
Chi Begomovirus là chi lớn nhất và quan trọng nhất trong họ Geminiviridae
cả về số lượng loài và bệnh do chúng gây ra với cây trồng. Begomovirus (được đặt
tên từ Bean golden mosaic virus) là tên gọi chung chỉ các virus thuộc chi
Begomovirus có phân virion (hạt virus) dạng hình cầu kép (hình chùy) và bộ gen
DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2,7 kb, lan truyền trên đồng ruộng bằng bọ
phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn.
Begomovirus có thể có bộ gen đơn (gồm một phân tử DNA-A) hoặc có bộ
gen kép (gồm hai phân tử DNA-A và DNA-B). Ở một số loại cây chỉ cần phân tử
DNA-A đã gây triệu chứng điển hình, còn ở một số loại cấy khác thì cần có cả phân
tử DNA-A và DNA-B mới gây ra triệu chứng bệnh.
Begomovirus gây bệnh trên các loại cây đều có các triệu chứng đặc trưng,
điển hình là: cuốn lá (cong lại hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lá
nhỏ hẹp; cây nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh tính virus chỉ có
thể được xác định dựa vào các phân tích phân tử
Việt Nam được chứng minh là trung tâm đa dạng quan trọng của
begomovirus. Mặc dù vậy số lượng begomovirus xác định trên thực vật của Việt
Nam vẫn còn ít chỉ gồm 19 loài được phân lập từ nhiều loài cây, trong đó có nhiều
cây dại. (Green, Tsai et al., 2001), (Ha, 2007).
Trên cây họ cà, đã có 6 begomovirus được phát hiện gây bệnh xoăn vàng lá
cà chua tại Việt Nam. Tuy nhiên hiện vẫn chưa có công bố nào cho thấy sự có mặt
của begomovirus trên ớt. Năm 2012, một loạt các mẫu ớt biểu hiện triệu chứng
bệnh virus trên ớt đã được TTNC Bệnh cây Nhiệt đới (Trường ĐHNN Hà Nội) thu
thập khắp cả nước. Các phân tích phân tử từ một mẫu virus phân lập đầu tiên từ ớt
thu thập tại Đà Nẵng (mẫu VNP93) đã xác định được một loài begomovirus mới
và virus này được đặt tên là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV). https://drivers.vn/
1.1 Giới thiệu
Chi Begomovirus là chi lớn nhất và quan trọng nhất trong họ Geminiviridae
cả về số lượng loài và bệnh do chúng gây ra với cây trồng. Begomovirus (được đặt
tên từ Bean golden mosaic virus) là tên gọi chung chỉ các virus thuộc chi
Begomovirus có phân virion (hạt virus) dạng hình cầu kép (hình chùy) và bộ gen
DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2,7 kb, lan truyền trên đồng ruộng bằng bọ
phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn.
Begomovirus có thể có bộ gen đơn (gồm một phân tử DNA-A) hoặc có bộ
gen kép (gồm hai phân tử DNA-A và DNA-B). Ở một số loại cây chỉ cần phân tử
DNA-A đã gây triệu chứng điển hình, còn ở một số loại cấy khác thì cần có cả phân
tử DNA-A và DNA-B mới gây ra triệu chứng bệnh.
Begomovirus gây bệnh trên các loại cây đều có các triệu chứng đặc trưng,
điển hình là: cuốn lá (cong lại hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lá
nhỏ hẹp; cây nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh tính virus chỉ có
thể được xác định dựa vào các phân tích phân tử
Việt Nam được chứng minh là trung tâm đa dạng quan trọng của
begomovirus. Mặc dù vậy số lượng begomovirus xác định trên thực vật của Việt
Nam vẫn còn ít chỉ gồm 19 loài được phân lập từ nhiều loài cây, trong đó có nhiều
cây dại. (Green, Tsai et al., 2001), (Ha, 2007).
Trên cây họ cà, đã có 6 begomovirus được phát hiện gây bệnh xoăn vàng lá
cà chua tại Việt Nam. Tuy nhiên hiện vẫn chưa có công bố nào cho thấy sự có mặt
của begomovirus trên ớt. Năm 2012, một loạt các mẫu ớt biểu hiện triệu chứng
bệnh virus trên ớt đã được TTNC Bệnh cây Nhiệt đới (Trường ĐHNN Hà Nội) thu
thập khắp cả nước. Các phân tích phân tử từ một mẫu virus phân lập đầu tiên từ ớt
thu thập tại Đà Nẵng (mẫu VNP93) đã xác định được một loài begomovirus mới
và virus này được đặt tên là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV). https://drivers.vn/
Các nghiên cứu sơ bộ tại TT NCBC NĐ cũng cho thấy virus này cũng nhiễm
tự nhiên cả trên cây cà chua bị bệnh xoăn vang lá. Việc lần đầu tiên phát hiện được
một begomovirus gây hại tự nhiên trên ớt ở Việt Nam có ý nghĩa quan trọng cả về
mặt khoa học và thực tiễn vì cây cây ớt cũng như cây cà chua là các cây trồng quan
trọng của Việt Nam.
Do PepYLCVNV là một virus mới nên phân bố cũng như đặc điểm sinh
học, đặc biệt là phổ ký chủ của virus vẫn chưa được nghiên cứu.
Dựa trên cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài: “Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam
virus”
1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
1.2.1 Mục tiêu
Xác định sự có mặt của PepLCVNV trên các mẫu ớt và cà chua thu thập tại
miền Bắc và đánh giá tính gây bệnh của virus.
1.2.2 Yêu cầu
- Điều tra bệnh cuốn lá ớt tại một số điểm trồng ớt chính thuộc Hà Nội, Hưng
Yên.
- Thu thập mẫu bệnh trên ớt với triệu chứng cuốn lá điển hình
- Phát hiện PepYLCVNV bằng PCR dùng mồi đặc hiệu trên các mẫu ớt và cà
chua thu thập trong nghiên cứu này và thu thập từ trước.
- Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng kỹ
thuật agroinoculation trên cà chua, ớt và một số cây chỉ thị
- Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng
vector bọ phấn.
https://drivers.vn/
tự nhiên cả trên cây cà chua bị bệnh xoăn vang lá. Việc lần đầu tiên phát hiện được
một begomovirus gây hại tự nhiên trên ớt ở Việt Nam có ý nghĩa quan trọng cả về
mặt khoa học và thực tiễn vì cây cây ớt cũng như cây cà chua là các cây trồng quan
trọng của Việt Nam.
Do PepYLCVNV là một virus mới nên phân bố cũng như đặc điểm sinh
học, đặc biệt là phổ ký chủ của virus vẫn chưa được nghiên cứu.
Dựa trên cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài: “Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam
virus”
1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
1.2.1 Mục tiêu
Xác định sự có mặt của PepLCVNV trên các mẫu ớt và cà chua thu thập tại
miền Bắc và đánh giá tính gây bệnh của virus.
1.2.2 Yêu cầu
- Điều tra bệnh cuốn lá ớt tại một số điểm trồng ớt chính thuộc Hà Nội, Hưng
Yên.
- Thu thập mẫu bệnh trên ớt với triệu chứng cuốn lá điển hình
- Phát hiện PepYLCVNV bằng PCR dùng mồi đặc hiệu trên các mẫu ớt và cà
chua thu thập trong nghiên cứu này và thu thập từ trước.
- Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng kỹ
thuật agroinoculation trên cà chua, ớt và một số cây chỉ thị
- Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng
vector bọ phấn.
https://drivers.vn/
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tầm quan trọng của ớt và cà chua
Cây ớt là một loại quả của cây cây thuộc chi Capsicum của họ Cà
(Solanaceae). Ớt có nguồn gốc từ châu Mỹ, ngày nay nó được trồng khắp nơi trên
thế giới và được sử dụng làm gia vị, rau, và thuốc. Hiện nay, Ấn Độ là nước sản
xuất ớt lớn nhất thế giới với khoảng 1 triệu tấn mỗi năm, nơi chỉ riêng
Chợ Guntur (lớn nhất châu Á) có 1 triệu bao ớt. Ở Việt Nam, ớt là một gia vị thường
xuyên có mặt trong các bữa ăn, ngoài ra ớt còn có rất nhiều công dụng như: cải
thiện hệ tiêu hóa, giảm cân, chữa bệnh ung thư, ngừa tai biến mạch, tăng sức đề
kháng.
Cà chua (S.lycopersicum) có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nó được người Tây Ban
Nha lan truyền tới Pilippine, Đông Nam Á và toàn bộ Châu Á, cuối cùng là Châu
Âu. Cà chua là loài trái cây vườn phổ biến nhất ở Hoa Kỳ. Khoảng 150 triệu tấn cà
chua đã được sản xuất ra trên Thế giới trong năm 2009. Trung Quốc là nước sản
xuất cà chua lớn nhất, chiếm khoảng một phần tư sản lượng toàn cầu, tiếp theo là
Hoa Kỳ và Ấn Độ. Các khu vực chế biến tại California chiếm 90% lượng sản xuất
ở Mỹ và 35% lượng sản xuất thế giới (Hartz, Miyao et al., 1997). Cũng như ớt, ở
nước ta cà chua là một gia vị hay có trong mỗi bữa ăn, bởi cà chua là một thực rất
giàu : Nước (chiếm 93 đến 95 % ), giàu nguyên tố khoáng,và vitamine A, C, và E.
Cà chua chín chứa nhiều sắc tố trong nhóm của caroténoïdes, như β-carotène cho
một hoạt chất tiền vitamine A rất có lợi cho sức khỏe.
2.2 Đặc điểm chung của Begomovirus
Trong bốn chi của họ Geminiviradae, chi Begomovirus (được đặt tên từ Bean
golden mosaic virus) là chi quan trọng nhất, cả về số lượng loài (198 loài vào năm
2010, website ICTV) cũng như các bệnh mà chúng gây ra trên cây trồng. Tất cả
các begomovirus (tên gọi chỉ các virus thuộc chi Begomovirus) đều không truyền
qua hạt giống nhưng lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn (Bemisia tabaci) theo
kiểu bền vững tuần hoàn (Fauquet and Stanley, 2005). https://drivers.vn/
2.1 Tầm quan trọng của ớt và cà chua
Cây ớt là một loại quả của cây cây thuộc chi Capsicum của họ Cà
(Solanaceae). Ớt có nguồn gốc từ châu Mỹ, ngày nay nó được trồng khắp nơi trên
thế giới và được sử dụng làm gia vị, rau, và thuốc. Hiện nay, Ấn Độ là nước sản
xuất ớt lớn nhất thế giới với khoảng 1 triệu tấn mỗi năm, nơi chỉ riêng
Chợ Guntur (lớn nhất châu Á) có 1 triệu bao ớt. Ở Việt Nam, ớt là một gia vị thường
xuyên có mặt trong các bữa ăn, ngoài ra ớt còn có rất nhiều công dụng như: cải
thiện hệ tiêu hóa, giảm cân, chữa bệnh ung thư, ngừa tai biến mạch, tăng sức đề
kháng.
Cà chua (S.lycopersicum) có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nó được người Tây Ban
Nha lan truyền tới Pilippine, Đông Nam Á và toàn bộ Châu Á, cuối cùng là Châu
Âu. Cà chua là loài trái cây vườn phổ biến nhất ở Hoa Kỳ. Khoảng 150 triệu tấn cà
chua đã được sản xuất ra trên Thế giới trong năm 2009. Trung Quốc là nước sản
xuất cà chua lớn nhất, chiếm khoảng một phần tư sản lượng toàn cầu, tiếp theo là
Hoa Kỳ và Ấn Độ. Các khu vực chế biến tại California chiếm 90% lượng sản xuất
ở Mỹ và 35% lượng sản xuất thế giới (Hartz, Miyao et al., 1997). Cũng như ớt, ở
nước ta cà chua là một gia vị hay có trong mỗi bữa ăn, bởi cà chua là một thực rất
giàu : Nước (chiếm 93 đến 95 % ), giàu nguyên tố khoáng,và vitamine A, C, và E.
Cà chua chín chứa nhiều sắc tố trong nhóm của caroténoïdes, như β-carotène cho
một hoạt chất tiền vitamine A rất có lợi cho sức khỏe.
2.2 Đặc điểm chung của Begomovirus
Trong bốn chi của họ Geminiviradae, chi Begomovirus (được đặt tên từ Bean
golden mosaic virus) là chi quan trọng nhất, cả về số lượng loài (198 loài vào năm
2010, website ICTV) cũng như các bệnh mà chúng gây ra trên cây trồng. Tất cả
các begomovirus (tên gọi chỉ các virus thuộc chi Begomovirus) đều không truyền
qua hạt giống nhưng lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn (Bemisia tabaci) theo
kiểu bền vững tuần hoàn (Fauquet and Stanley, 2005). https://drivers.vn/
2.2.1 Đặc điểm hình thái
Đặc điểm hình thái chung của các Begomovirus đều có cấu trúc phân tử
(virion) tương tự nhau bao gồm 2 hình cầu 20 mặt (icosahedron), mỗi mặt là 1 tam
giác đều với số đơn vị tam giác (T) trên mỗi mặt bằng 1, nối với nhau để tạo ra
phân tử hình cầu đa diện kép (gemini). Do nối với nhau nên 2 hình cầu này không
hoàn thiện dẫn tới trên mỗi hình cầu chỉ có 55 tiểu phần protein (protein vỏ) được
xắp xếp thành 11 đơn vị hình thái, mỗi đơn vị gồm 5 tiểu phần protein (pentameric
capsomer). Kết quả là toàn bộ phân tử có 110 tiểu phần và 22 đơn vị hình thái
(Gafni and Yedidya, 2003), (Zhang, Cheng et al., 2001).
Hình 2.1 Hình thái của begomovirus (Nguồn ảnh:
www.ncbi.nlm.nih.gov)
2.2.2 Cấu trúc genome của Begomovirus
Begomovirus là virus thực vật có bộ gen DNA sợi vòng đơn có kích thước
khoảng 2,6- 2,8 kb. Chúng hoặc có bộ gen kép (bipartite) gồm 2 phân tử DNA gọi
là DNA-A và DNA-B hoặc có bộ gen đơn (monopartite) tương đương DNA-A (Ha,
2007)
https://drivers.vn/
Đặc điểm hình thái chung của các Begomovirus đều có cấu trúc phân tử
(virion) tương tự nhau bao gồm 2 hình cầu 20 mặt (icosahedron), mỗi mặt là 1 tam
giác đều với số đơn vị tam giác (T) trên mỗi mặt bằng 1, nối với nhau để tạo ra
phân tử hình cầu đa diện kép (gemini). Do nối với nhau nên 2 hình cầu này không
hoàn thiện dẫn tới trên mỗi hình cầu chỉ có 55 tiểu phần protein (protein vỏ) được
xắp xếp thành 11 đơn vị hình thái, mỗi đơn vị gồm 5 tiểu phần protein (pentameric
capsomer). Kết quả là toàn bộ phân tử có 110 tiểu phần và 22 đơn vị hình thái
(Gafni and Yedidya, 2003), (Zhang, Cheng et al., 2001).
Hình 2.1 Hình thái của begomovirus (Nguồn ảnh:
www.ncbi.nlm.nih.gov)
2.2.2 Cấu trúc genome của Begomovirus
Begomovirus là virus thực vật có bộ gen DNA sợi vòng đơn có kích thước
khoảng 2,6- 2,8 kb. Chúng hoặc có bộ gen kép (bipartite) gồm 2 phân tử DNA gọi
là DNA-A và DNA-B hoặc có bộ gen đơn (monopartite) tương đương DNA-A (Ha,
2007)
https://drivers.vn/
Hình 2.2. Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B của begomovirus (Nguồn
ảnh: www.expasy.ch)
2.2.3 Cấu trúc của phân tử DNA-A
Cấu trúc của một DNA-A điển hình gồm 6 ORF (Open Reading Frame) được
sắp xếp theo hai chiều ngược nhau. Trên chiều kim đồng hồ (chiều virus) có hai
gen AV1 và AV2. Gen AV1(CP) mã hóa vỏ protein có chức năng chính là tạo vỏ
phân tử virus, lan truyền Begomovirus qua vector, vận chuyển bộ gen virus vào và
ra khỏi nhân tế bào ký chủ và vận chuyển bộ gen giữa các tế bào. Gen AV2 mã hóa
Protein có chức năng cảm ứng triệu chứng, di chuyển hệ thống và tích lũy DNA
của virus. Trên chiều ngược kim đồng hồ (chiều sợi tương đồng virus) gồm có 4
ORF: AC1, AC2, AC3, AC4. Trong đó, gen AC1 mã hóa protein tái sinh (Rep
protein) có chức năng chính là cắt- nối bộ gen virus trong quá trình tái sinh và tương
tác với protein của ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào. Gen AC2 (TrAP-
Transcriptional Activator Protein) mã hóa Protein hoạt hóa phiên mã có chức năng
ức chế phản ứng phòng thủ của cây. Gen AC3 mã hóa protein tăng cường tái sinh
(REn- Replication Enhancer) có chức năng tương tác với prote ký chủ điều khiển
chu kỳ tế bào. Gen AC4 mã hóa protein có chức năng liên quan tới phổ ký chủ,
phát triển triệu chứng, ức chế hoạt động câm gen của tế bào ký chủ (Ha, 2007).
Hình 2.3. Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus
(http://wcrc.confex.com) https://drivers.vn/
ảnh: www.expasy.ch)
2.2.3 Cấu trúc của phân tử DNA-A
Cấu trúc của một DNA-A điển hình gồm 6 ORF (Open Reading Frame) được
sắp xếp theo hai chiều ngược nhau. Trên chiều kim đồng hồ (chiều virus) có hai
gen AV1 và AV2. Gen AV1(CP) mã hóa vỏ protein có chức năng chính là tạo vỏ
phân tử virus, lan truyền Begomovirus qua vector, vận chuyển bộ gen virus vào và
ra khỏi nhân tế bào ký chủ và vận chuyển bộ gen giữa các tế bào. Gen AV2 mã hóa
Protein có chức năng cảm ứng triệu chứng, di chuyển hệ thống và tích lũy DNA
của virus. Trên chiều ngược kim đồng hồ (chiều sợi tương đồng virus) gồm có 4
ORF: AC1, AC2, AC3, AC4. Trong đó, gen AC1 mã hóa protein tái sinh (Rep
protein) có chức năng chính là cắt- nối bộ gen virus trong quá trình tái sinh và tương
tác với protein của ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào. Gen AC2 (TrAP-
Transcriptional Activator Protein) mã hóa Protein hoạt hóa phiên mã có chức năng
ức chế phản ứng phòng thủ của cây. Gen AC3 mã hóa protein tăng cường tái sinh
(REn- Replication Enhancer) có chức năng tương tác với prote ký chủ điều khiển
chu kỳ tế bào. Gen AC4 mã hóa protein có chức năng liên quan tới phổ ký chủ,
phát triển triệu chứng, ức chế hoạt động câm gen của tế bào ký chủ (Ha, 2007).
Hình 2.3. Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus
(http://wcrc.confex.com) https://drivers.vn/
2.2.4 Cấu trúc của phân tử DNA-B.
DNA-B của các Begomovirus kép chỉ chứa 2 ORF và cũng được sắp xếp
theo 2 chiều ngược nhau. Trên chiều kim đồng hồ chứa gen BV1, trên chiều ngược
kim đồng hồ chứa gen BC1.
BV1 là một protein con thoi: (NSP- Nuclear shuttle protein) có chức năng
chính là vận chuyển bộ gen virus vào, ra khỏi nhân tế bào, tuy vậy nó không liên
quan đến việc nhập nhân của virus trong lúc xâm nhiễm, chức năng này được kiểm
soát bởi CP.
BC1 là một protein vận chuyển : (MP- Movement protein) có chức năng vận
chuyển bộ gen virus giữa các tế bào ký chủ.
Hình 2.4: Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus (Ha, Coombs et al.,
2008).
2.2.5 Đặc điểm của vùng IR
Vùng IR (Intergenic region) là vùng liên gen không mã hóa, nằm giữa 2 vùng
gen mã hóa ngược chiều nhau, có cả trên DNA-A và DNA-B. Vùng này có chứa
nguồn gốc tái sinh (ori- origin of replication) gồm các chuỗi lặp đảo (iteron) cần
thiết cho sự nhận biết và gắn kết protein Rep và 1 cấu trúc thân- thòng lọng (stem-
loop) có chứa chuỗi TAATATTAC giống nhau ở tất cả các begomovirus. Vị trí T
7
– C
8
của chuỗi này là nơi protein Rep cắt và nối bộ gen Begomovirus trong quá
trình tái sinh.
Đối với begomovirus có bộ gen kép có chứa 1 chuỗi bảo thủ cao (khoảng
150 nucleotide) giữa 2 phân tử gọi là vùng chung CR (Common Region). Vùng CR
có vai trò quan trọng trong quá trình tái sinh của DNA-B bởi chuỗi ori- nguồn gốc
BV1 (NSP)
DNA-B
~2.7kb
CR
CR=Common Region
BC1 (MPB) https://drivers.vn/
DNA-B của các Begomovirus kép chỉ chứa 2 ORF và cũng được sắp xếp
theo 2 chiều ngược nhau. Trên chiều kim đồng hồ chứa gen BV1, trên chiều ngược
kim đồng hồ chứa gen BC1.
BV1 là một protein con thoi: (NSP- Nuclear shuttle protein) có chức năng
chính là vận chuyển bộ gen virus vào, ra khỏi nhân tế bào, tuy vậy nó không liên
quan đến việc nhập nhân của virus trong lúc xâm nhiễm, chức năng này được kiểm
soát bởi CP.
BC1 là một protein vận chuyển : (MP- Movement protein) có chức năng vận
chuyển bộ gen virus giữa các tế bào ký chủ.
Hình 2.4: Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus (Ha, Coombs et al.,
2008).
2.2.5 Đặc điểm của vùng IR
Vùng IR (Intergenic region) là vùng liên gen không mã hóa, nằm giữa 2 vùng
gen mã hóa ngược chiều nhau, có cả trên DNA-A và DNA-B. Vùng này có chứa
nguồn gốc tái sinh (ori- origin of replication) gồm các chuỗi lặp đảo (iteron) cần
thiết cho sự nhận biết và gắn kết protein Rep và 1 cấu trúc thân- thòng lọng (stem-
loop) có chứa chuỗi TAATATTAC giống nhau ở tất cả các begomovirus. Vị trí T
7
– C
8
của chuỗi này là nơi protein Rep cắt và nối bộ gen Begomovirus trong quá
trình tái sinh.
Đối với begomovirus có bộ gen kép có chứa 1 chuỗi bảo thủ cao (khoảng
150 nucleotide) giữa 2 phân tử gọi là vùng chung CR (Common Region). Vùng CR
có vai trò quan trọng trong quá trình tái sinh của DNA-B bởi chuỗi ori- nguồn gốc
BV1 (NSP)
DNA-B
~2.7kb
CR
CR=Common Region
BC1 (MPB) https://drivers.vn/
tái sinh nằm trên vùng này. Tuy nhiên, với số gen ít ỏi của mình, DNA-B không
thể tự tái sinh trong tế bào ký chủ mà cần có sự nhận biết và cắt- nối của protein
Rep được mã hóa trên DNA-A (Ha, 2008)
2.2.6 Phân loại các Begomovirus
Begomovirus được chia làm hai nhóm chính là nhóm Tân thế giới (New
world) bao gồm Châu Mỹ và nhóm Cựu thế giới (Old world) là khu vực Đông bán
cầu bao gồm châu Âu, châu Phi, châu Á (Padidam, Stanley et al., 1999), (Rybicki,
1994)
Các begomovirus của hai nhóm tân thế giới và cựu thế giới được phân biệt
nhau bởi đặc điểm bộ gen. Tất cả các begomovirus ở cụm Tân thế giới đều có bộ
gen kép, trong khi đó các begomovirus ở cụm Cựu thế giới có cả bộ gen đơn và
kép, thêm vào đó tất cả các begomovirus của cụm Cựu thế giới có thêm một gen
AV2 trên DNA-A, gen này không tồn tại ở các virus của cụm Tân thế giới (Rybicki
et al., 1994; Stanley et al., 2005). Begomovirus ở cụm Tân thế giới có chuỗi
PWRsmaGT ở đầu N trong vỏ protein (CP) mã hóa bởi gen AV1, chuỗi này không
có mặt ở begomovirus của cụm Cựu thế giới (Harrison and Robinson, 2005)
Rybicki (1994) dự đoán rằng bọ phấn di chuyển từ Châu Á sang châu Mỹ có
thể đã mang tổ tiên virus của cụm Tân thế giới mà chúng ta quan sát thấy ngày nay.
Các virus này sau đó tiến hóa theo một hướng khác với các virus ở cụm Cựu thế
giới.
2.2.7 Tái sinh của Begomovirus
Begomovirus tái sinh theo cơ chế vòng lăn (rolling circular mechanism). Cơ
chế vòng lăn có thể được chia làm 2 pha và được thực hiện trong nhân tế bào ký
chủ (Gutierrez, Ramirez-Parra et al., 2004), (Picó, Díez et al., 1996). Pha tổng hợp
sợi DNA vòng đơn (bộ gen có mặt trong phân tử virus) thành sợi DNA vòng kép
khi bộ gen virus được chuyển vào nhân tế bào. Như vậy sợi kép sẽ gồm một sợi
virus và một sợi tương đồng virus. Pha này vẫn chưa được hiểu rõ. (2) Pha tái sinh
theo cơ chế vòng lăn: Protein Rep (sau khi được tổng hợp) sẽ cắt sợi virus tại chuỗi
bảo toàn TATATTAC. Nhờ vật liệu cũng như enzyme DNA polymearase của tế
bào, sợi virus được tổng hợp liên tục trên sợi tương đồng virus. Protein Rep lại tiếp https://drivers.vn/
thể tự tái sinh trong tế bào ký chủ mà cần có sự nhận biết và cắt- nối của protein
Rep được mã hóa trên DNA-A (Ha, 2008)
2.2.6 Phân loại các Begomovirus
Begomovirus được chia làm hai nhóm chính là nhóm Tân thế giới (New
world) bao gồm Châu Mỹ và nhóm Cựu thế giới (Old world) là khu vực Đông bán
cầu bao gồm châu Âu, châu Phi, châu Á (Padidam, Stanley et al., 1999), (Rybicki,
1994)
Các begomovirus của hai nhóm tân thế giới và cựu thế giới được phân biệt
nhau bởi đặc điểm bộ gen. Tất cả các begomovirus ở cụm Tân thế giới đều có bộ
gen kép, trong khi đó các begomovirus ở cụm Cựu thế giới có cả bộ gen đơn và
kép, thêm vào đó tất cả các begomovirus của cụm Cựu thế giới có thêm một gen
AV2 trên DNA-A, gen này không tồn tại ở các virus của cụm Tân thế giới (Rybicki
et al., 1994; Stanley et al., 2005). Begomovirus ở cụm Tân thế giới có chuỗi
PWRsmaGT ở đầu N trong vỏ protein (CP) mã hóa bởi gen AV1, chuỗi này không
có mặt ở begomovirus của cụm Cựu thế giới (Harrison and Robinson, 2005)
Rybicki (1994) dự đoán rằng bọ phấn di chuyển từ Châu Á sang châu Mỹ có
thể đã mang tổ tiên virus của cụm Tân thế giới mà chúng ta quan sát thấy ngày nay.
Các virus này sau đó tiến hóa theo một hướng khác với các virus ở cụm Cựu thế
giới.
2.2.7 Tái sinh của Begomovirus
Begomovirus tái sinh theo cơ chế vòng lăn (rolling circular mechanism). Cơ
chế vòng lăn có thể được chia làm 2 pha và được thực hiện trong nhân tế bào ký
chủ (Gutierrez, Ramirez-Parra et al., 2004), (Picó, Díez et al., 1996). Pha tổng hợp
sợi DNA vòng đơn (bộ gen có mặt trong phân tử virus) thành sợi DNA vòng kép
khi bộ gen virus được chuyển vào nhân tế bào. Như vậy sợi kép sẽ gồm một sợi
virus và một sợi tương đồng virus. Pha này vẫn chưa được hiểu rõ. (2) Pha tái sinh
theo cơ chế vòng lăn: Protein Rep (sau khi được tổng hợp) sẽ cắt sợi virus tại chuỗi
bảo toàn TATATTAC. Nhờ vật liệu cũng như enzyme DNA polymearase của tế
bào, sợi virus được tổng hợp liên tục trên sợi tương đồng virus. Protein Rep lại tiếp https://drivers.vn/
tục cắt sợi virus mới được tổng hợp tại chuỗi TATATTAC (cũng vừa mới được
tổng hơp) thành một sợi virus hoàn chỉnh dưới dạng sợi đơn mạch thẳng. Protein
Rep sau đó sẽ nối 2 đầu của mạch thẳng để tạo ra bộ gen virus sợi đơn mạch vòng
hoàn chỉnh.
2.2.8 Triệu chứng bệnh do Begomovirus
Do virus phải dựa hoàn toàn vào vật chất của tế bào ký chủ để sinh sản, nên
ở cây non và phần non của cây là nơi virus sinh sản rất mạnh. Ở các cây, tế bào già
cỗi, quá trình này sẽ chậ m lại hay hầu như ngừng hẳn. Vì vậy điều kiện ngoại cảnh
như: nhiệt độ quá cao, quá thấp, độ pH của môi trường, ánh sáng, chế độ dinh
dưỡng, chăm sóc cũng có ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện triệu chứng của bệnh
do các begomovirus. Tuy nhiên, thông thường triệu chứng xuất hiện sau 2-4 tuần
nhiễm bệnh và phát triển đầy đủ trong vòng 2 tháng (Pico et al., 1996). Một chất
được nhiều nhà khoa học xác nhận có bản chất protein tan là interferon có thể đã
được sản sinh ra ở tế bào ký chủ khi virus xâm nhập. Với nồng độ thấp khoảng một
phần triệu gram đã có khả năng ức chế sinh sản của virus. Chính vì những lý do
trên bệnh virus không gây được tác hại huỷ diệt ngay mà thường gây thoái hoá. Sự
huỷ diệt chỉ xảy ra khi điều kiện môi trường và cây bệnh thuận lợi cho virus sinh
sản và lây nhiễm, như trong các trận dịch của bệnh lúa vàng lụi ở nước ta những
năm 1960. (Nguyễn Thị Hà Uyên, 2012)
Triệu chứng sớm nhất là lá cong xuống dưới vào phía bên trong. Về sau, lá
không có hình dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chót lá lan vào giữa gân; lá cuốn
cong lên phía trên thành hình thuyền; lá non biến vàng mạnh, giòn và nhỏ hẹp.
Cuống lá có thể xoắn vặn. Cây lùn còi cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ, đốt thân
ngắn. Cây nhiễm sớm thường không ra quả do hoa bị rụng (Picó, Díez et al., 1996).
Bệnh thường xuất hiện vào các vụ có thời tiết nóng như hè thu và xuân hè. https://drivers.vn/
tổng hơp) thành một sợi virus hoàn chỉnh dưới dạng sợi đơn mạch thẳng. Protein
Rep sau đó sẽ nối 2 đầu của mạch thẳng để tạo ra bộ gen virus sợi đơn mạch vòng
hoàn chỉnh.
2.2.8 Triệu chứng bệnh do Begomovirus
Do virus phải dựa hoàn toàn vào vật chất của tế bào ký chủ để sinh sản, nên
ở cây non và phần non của cây là nơi virus sinh sản rất mạnh. Ở các cây, tế bào già
cỗi, quá trình này sẽ chậ m lại hay hầu như ngừng hẳn. Vì vậy điều kiện ngoại cảnh
như: nhiệt độ quá cao, quá thấp, độ pH của môi trường, ánh sáng, chế độ dinh
dưỡng, chăm sóc cũng có ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện triệu chứng của bệnh
do các begomovirus. Tuy nhiên, thông thường triệu chứng xuất hiện sau 2-4 tuần
nhiễm bệnh và phát triển đầy đủ trong vòng 2 tháng (Pico et al., 1996). Một chất
được nhiều nhà khoa học xác nhận có bản chất protein tan là interferon có thể đã
được sản sinh ra ở tế bào ký chủ khi virus xâm nhập. Với nồng độ thấp khoảng một
phần triệu gram đã có khả năng ức chế sinh sản của virus. Chính vì những lý do
trên bệnh virus không gây được tác hại huỷ diệt ngay mà thường gây thoái hoá. Sự
huỷ diệt chỉ xảy ra khi điều kiện môi trường và cây bệnh thuận lợi cho virus sinh
sản và lây nhiễm, như trong các trận dịch của bệnh lúa vàng lụi ở nước ta những
năm 1960. (Nguyễn Thị Hà Uyên, 2012)
Triệu chứng sớm nhất là lá cong xuống dưới vào phía bên trong. Về sau, lá
không có hình dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chót lá lan vào giữa gân; lá cuốn
cong lên phía trên thành hình thuyền; lá non biến vàng mạnh, giòn và nhỏ hẹp.
Cuống lá có thể xoắn vặn. Cây lùn còi cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ, đốt thân
ngắn. Cây nhiễm sớm thường không ra quả do hoa bị rụng (Picó, Díez et al., 1996).
Bệnh thường xuất hiện vào các vụ có thời tiết nóng như hè thu và xuân hè. https://drivers.vn/
Hình 2.5. Triệu chứng do Begomovirus gây ra trên ớt và cà chua
(httpwww.avrdc.org)
2.2.9 Môi giới truyền bệnh và sự lan truyền
Tất cả các begomovirus lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn (B. tabaci)
theo kiểu bền vững tuần hoàn (persistant- circulant). Bọ phấn Bemisa tabaci
Gennadius (1989) thuộc họ rầy phấn (Aleyrodidae), bộ cánh đều (Homotera).
Cho đến nay trên thế giới có hai loài bọ phấn được công nhận đó là: Bemisia
tabaci và Bemisia argentifolii, loài Bemisia argentifolii được tìm thấy nhiều ở Hoa
kỳ, Nhật, Pháp, Colombia, Israel, Ai Cập, Trung Quốc, … Sự khác nhau giữa hai
loài bọ phấn này là B. argentifolii ăn tạp, mắn đẻ hơn, gây rối loạn độc tố cho cây
trồng.
Theo Navot và cộng sự (1991), bọ phấn Bemisia tabaci hoàn thành một vòng
đời khoảng 20 – 30 ngày ở điều kiện thích hợp. Trung bình có khoảng 11 – 15
lứa/năm. Bọ phấn phát triển mạnh trong điều kiện khô và nóng, mưa nhiều làm
giảm mật độ bọ phấn, chúng thường chích hút và bay vào buổi sáng, buổi chiều
mát. Để tránh ánh sáng mặt trời bọ phấn núp vào mặt dưới của lá, điều này phù hợp
với phân bố chủ yếu ở khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới.
Chưa có bằng chứng chứng minh begomovirus nhân lên trong cơ thể bọ
phấn. Bọ phấn dùng vòi chọc vào mô mạch dẫn để hút dịch cây từ mạch phloem.
Virus được hút qua vòi, tới diều, thấm qua màng ruột vào xoang cơ thể, đạt tới
tuyến nước bọt và cuối cùng vào ống nước bọt. Chúng hút dịch cây trong khoảng
15 – 30 phút và tiềm ẩn trong cơ thể chúng là 8-24 giờ (thời gian để virus nâng cao
nồng độ trong bọ phấn) là chúng có khả năng truyền bệnh, khoảng thời gian để https://drivers.vn/
(httpwww.avrdc.org)
2.2.9 Môi giới truyền bệnh và sự lan truyền
Tất cả các begomovirus lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn (B. tabaci)
theo kiểu bền vững tuần hoàn (persistant- circulant). Bọ phấn Bemisa tabaci
Gennadius (1989) thuộc họ rầy phấn (Aleyrodidae), bộ cánh đều (Homotera).
Cho đến nay trên thế giới có hai loài bọ phấn được công nhận đó là: Bemisia
tabaci và Bemisia argentifolii, loài Bemisia argentifolii được tìm thấy nhiều ở Hoa
kỳ, Nhật, Pháp, Colombia, Israel, Ai Cập, Trung Quốc, … Sự khác nhau giữa hai
loài bọ phấn này là B. argentifolii ăn tạp, mắn đẻ hơn, gây rối loạn độc tố cho cây
trồng.
Theo Navot và cộng sự (1991), bọ phấn Bemisia tabaci hoàn thành một vòng
đời khoảng 20 – 30 ngày ở điều kiện thích hợp. Trung bình có khoảng 11 – 15
lứa/năm. Bọ phấn phát triển mạnh trong điều kiện khô và nóng, mưa nhiều làm
giảm mật độ bọ phấn, chúng thường chích hút và bay vào buổi sáng, buổi chiều
mát. Để tránh ánh sáng mặt trời bọ phấn núp vào mặt dưới của lá, điều này phù hợp
với phân bố chủ yếu ở khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới.
Chưa có bằng chứng chứng minh begomovirus nhân lên trong cơ thể bọ
phấn. Bọ phấn dùng vòi chọc vào mô mạch dẫn để hút dịch cây từ mạch phloem.
Virus được hút qua vòi, tới diều, thấm qua màng ruột vào xoang cơ thể, đạt tới
tuyến nước bọt và cuối cùng vào ống nước bọt. Chúng hút dịch cây trong khoảng
15 – 30 phút và tiềm ẩn trong cơ thể chúng là 8-24 giờ (thời gian để virus nâng cao
nồng độ trong bọ phấn) là chúng có khả năng truyền bệnh, khoảng thời gian để https://drivers.vn/
chúng truyền ngắn nhất là 15 phút (EPPO/CABI, 1996). Thời gian chích hút của
bọ phấn dài hơn thời gian truyền dịch virus sang cây khỏe và thời gian tiềm ẩn là
21 giờ. Bọ phấn hút dịch cây ở giai đoạn sâu non và ngay sau khi hóa trưởng thành
chúng có thể truyền nhiễm bệnh virus theo hệ thống và không truyền lại cho đời
sau. Có thể phát hiện thấy virus ở bất kì giai đoạn phát triển nàocủa bọ phấn từ giai
đoạn trứng (Ghanim and Czosnek, 2000). Triệu chứng xuất hiện trên cây con khi
bị xâm nhiễm từ 2 – 5 tuần. Virus không truyền qua chứng bọ phấn.
Hình 2.6. Bọ phấn Bemisia tabaci
2.2.10 Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra
Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng đã được xác định là do begomovirus
gây ra như bệnh bệnh xoăn vàng lá (ngọn) cà chua, một bệnh được xem là bệnh
virus nguy hiểm nhất trên cà chua khắp thế giới (Moriones and Navas-Castillo,
2000).Các bệnh nguy hiểm tương tự là bệnh khảm lá sắn, bệnh cuốn lá bông
(Briddon, 2003). Trong đó gây thiệt hại lớn nhất là bệnh xoăn vàng lá ngọn cà chua.
Bệnh xoăn vàng lá cà chua gây thiệt hại lớn cả về năng suất và chất lượng.
Bệnh đã trở thành bệnh virus quan trọng nhất trên cây cà chua khắp Thế Giới, đặc
biệt vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Picó, Díez et al., 1996). https://drivers.vn/
bọ phấn dài hơn thời gian truyền dịch virus sang cây khỏe và thời gian tiềm ẩn là
21 giờ. Bọ phấn hút dịch cây ở giai đoạn sâu non và ngay sau khi hóa trưởng thành
chúng có thể truyền nhiễm bệnh virus theo hệ thống và không truyền lại cho đời
sau. Có thể phát hiện thấy virus ở bất kì giai đoạn phát triển nàocủa bọ phấn từ giai
đoạn trứng (Ghanim and Czosnek, 2000). Triệu chứng xuất hiện trên cây con khi
bị xâm nhiễm từ 2 – 5 tuần. Virus không truyền qua chứng bọ phấn.
Hình 2.6. Bọ phấn Bemisia tabaci
2.2.10 Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra
Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng đã được xác định là do begomovirus
gây ra như bệnh bệnh xoăn vàng lá (ngọn) cà chua, một bệnh được xem là bệnh
virus nguy hiểm nhất trên cà chua khắp thế giới (Moriones and Navas-Castillo,
2000).Các bệnh nguy hiểm tương tự là bệnh khảm lá sắn, bệnh cuốn lá bông
(Briddon, 2003). Trong đó gây thiệt hại lớn nhất là bệnh xoăn vàng lá ngọn cà chua.
Bệnh xoăn vàng lá cà chua gây thiệt hại lớn cả về năng suất và chất lượng.
Bệnh đã trở thành bệnh virus quan trọng nhất trên cây cà chua khắp Thế Giới, đặc
biệt vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Picó, Díez et al., 1996). https://drivers.vn/
2.2.11 Phòng chống
Cho đến nay vẫn chưa có loài thuốc hóa học nào phòng trừ được trực tiếp
bệnh do virus gây ra. Phòng trừ begomovirus chủ yếu dựa vào 2 chiến lược chính
là phòng chống vector và tạo cây kháng bệnh.
- Phòng chống vector: (Kheyr-Pour, Bendahmane et al., 1991) cho biết, trên thế
giới có khoảng 500 loài cây là ký chủ của bọ phấn, chúng có mặt quanh năm
trên đồng ruộng. Đây là nguyên nhân khiến cho việc phòng trừ bọ phấn gặp
nhiều khó khăn. (Murugan and Uthamasamy, 2001) nghiên cứu đặt bẫy dính bọ
phấn theo dõi mặt độ bọ phấn trên cánh đồng bông ở Coimbatace (Ấn Độ) cho
thấy: từ tháng 9 đến tháng 3 năm sau lượng mưa thấp, nhiệt độ cao, cường độ
ánh sáng lớn với ẩm độ trung bình tạo điều kiện cho bọ phấn sinh sôi nảy nở
nhanh chóng nên mật độ bọ phấn cao, từ tháng 5 đến tháng 8 mưa nhiều nên
mật độ bọ phấn thấp, đỉnh cao của mật độ bọ phấn khoảng tháng 11 đến tháng
1 năm sau. Từ đặc điểm đó, nhiều kỹ thuật phòng trừ bọ phấn được áp dụng tùy
điều kiện:
+ Dùng giống kháng bọ phấn.
+ Dùng thuốc hóa học.
+ Trồng cây trong nhà lưới, nhà kính.
+ Dùng bẫy hấp dẫn màu vàng hoặc bề mặt phản xạ (chỉ áp dụng có
hiệu quả trong điều kiện nhà lưới) .
- Tạo giống kháng virus: Tính kháng begomovirus có thể được tạo ra nhờ 2 cơ
chế: Tính kháng từ cây và tính kháng từ tác nhân gây bệnh (PRD). Những
năm gần đây, cùng với tiến bộ khoa học kĩ thuật các nhà khoa học đã tạo ra
các giống ớt có khả năng chống lại sự xâm nhiễm, tái tổ hợp của virus trong
tế bào cây. Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau châu Á (AVRDC) đã lai
tạo ra những dòng ớt có tính kháng rất cao với bọ phấn Bemisia tabaci cũng
như kháng bệnh do begomovirus gây ra. Ở nước ta đang có dự án thí nghiệm
nghiên cứu tính kháng bệnh virus (begomovirus) củ 34 giống ớt có nguồn
gốc từ AVRDC (trung tâm rau màu thế giới) tại Đồng Tháp bước đầu đã cho https://drivers.vn/
Cho đến nay vẫn chưa có loài thuốc hóa học nào phòng trừ được trực tiếp
bệnh do virus gây ra. Phòng trừ begomovirus chủ yếu dựa vào 2 chiến lược chính
là phòng chống vector và tạo cây kháng bệnh.
- Phòng chống vector: (Kheyr-Pour, Bendahmane et al., 1991) cho biết, trên thế
giới có khoảng 500 loài cây là ký chủ của bọ phấn, chúng có mặt quanh năm
trên đồng ruộng. Đây là nguyên nhân khiến cho việc phòng trừ bọ phấn gặp
nhiều khó khăn. (Murugan and Uthamasamy, 2001) nghiên cứu đặt bẫy dính bọ
phấn theo dõi mặt độ bọ phấn trên cánh đồng bông ở Coimbatace (Ấn Độ) cho
thấy: từ tháng 9 đến tháng 3 năm sau lượng mưa thấp, nhiệt độ cao, cường độ
ánh sáng lớn với ẩm độ trung bình tạo điều kiện cho bọ phấn sinh sôi nảy nở
nhanh chóng nên mật độ bọ phấn cao, từ tháng 5 đến tháng 8 mưa nhiều nên
mật độ bọ phấn thấp, đỉnh cao của mật độ bọ phấn khoảng tháng 11 đến tháng
1 năm sau. Từ đặc điểm đó, nhiều kỹ thuật phòng trừ bọ phấn được áp dụng tùy
điều kiện:
+ Dùng giống kháng bọ phấn.
+ Dùng thuốc hóa học.
+ Trồng cây trong nhà lưới, nhà kính.
+ Dùng bẫy hấp dẫn màu vàng hoặc bề mặt phản xạ (chỉ áp dụng có
hiệu quả trong điều kiện nhà lưới) .
- Tạo giống kháng virus: Tính kháng begomovirus có thể được tạo ra nhờ 2 cơ
chế: Tính kháng từ cây và tính kháng từ tác nhân gây bệnh (PRD). Những
năm gần đây, cùng với tiến bộ khoa học kĩ thuật các nhà khoa học đã tạo ra
các giống ớt có khả năng chống lại sự xâm nhiễm, tái tổ hợp của virus trong
tế bào cây. Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau châu Á (AVRDC) đã lai
tạo ra những dòng ớt có tính kháng rất cao với bọ phấn Bemisia tabaci cũng
như kháng bệnh do begomovirus gây ra. Ở nước ta đang có dự án thí nghiệm
nghiên cứu tính kháng bệnh virus (begomovirus) củ 34 giống ớt có nguồn
gốc từ AVRDC (trung tâm rau màu thế giới) tại Đồng Tháp bước đầu đã cho https://drivers.vn/
những kết quả rất khả quan, đây đều là các giống kháng chuyển gen dùng
gen kháng từ cây.
2.3 Một số begomovirus hại cà chua
Hiện nay có tới hơn 50 begomovirus phân lập từ cà chua (có từ tomato ở đầu
tên virus) đã được công bố trên thế giới (Fauquet, Briddon et al., 2008). Trên cây
cà chua, các begomovirus tạo triệu chứng giống nhau, điểm hình là cuốn lá (cong
lại hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lá nhỏ hẹp; cây nhiểm sớm còi
cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh tính virus gây bệnh chỉ có thể biết được dựa
vào các phân tích phân tử (Moriones & Navas-Castillo, 2000).
Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá được xem là bệnh virus quan trọng nhất
trên cà chua với tỉ lệ nhiễm bệnh trên các ruộng trồng cà chua thường rất cao, có
khi tới 100%. Bệnh đã được phát hiện thấy trên cà chua từ những năm 80. Một số
nghiên cứu về tạo huyết thanh chuẩn đoán, lây nhiễm nhân tạo đã được thực hiện
trong thời gian này nhưng bản chất thực sự của virus vẫn chưa rõ. Gần đây dựa vào
các phân tích phân tử, có ít nhất 3 loài begomovirus được phát hiện gây ra bệnh
xoăn vàng lá cà chua ở Việt Nam. Loài thứ nhất là Tomato leaf curl Việt Nam virus
(ToLCVNV) được phân phập từ cây cà chua bị bệnh xoăn vàng ngọn ở miền Bắc
vào năm 2001 (Green et al., 2001), Loài thứ hai là Tomato yellow leaf curl
Kanchanaburi virus (TYLCKaV), được phân lập đầu tiên ở tỉnh Kanchanaburi
(Thái Lan) vào năm 2002 (Green et al., 2002) và được phát hiện trên cây cà chua ở
Việt Nam vào năm 2005 (mã số Genbank của mẫu Việt Nam là DQ169054, -55).
Năm 2007, từ một mẫu cà chua bị bênh xoăn vàng ngọn thu thập tại Hà Nội, cùng
với ToLCVV, một loài begomovirus thứ ba cũng đã được phân lập. Loài này được
đặt tên là Tomato yellow leaf curl Việt Nam virus (ToYLCKaV) (Hà et al., 2008).
Trong số 3 virus trên có 2 virus được phân lập trên mẫu cà chua gây bệnh xoăn
vàng lá ở miền Bắc là ToLCVNV và TYLCVNV.
2.4 Một số begomovirus hại ớt
Theo (Green and Kim, 1991) có khoảng 35 loài virus khác nhau gây hại trên
ớt ở các vùng trồng trên thế giới đã được phát hiện thì có 12 loài gây hại trên ớt ở https://drivers.vn/
gen kháng từ cây.
2.3 Một số begomovirus hại cà chua
Hiện nay có tới hơn 50 begomovirus phân lập từ cà chua (có từ tomato ở đầu
tên virus) đã được công bố trên thế giới (Fauquet, Briddon et al., 2008). Trên cây
cà chua, các begomovirus tạo triệu chứng giống nhau, điểm hình là cuốn lá (cong
lại hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lá nhỏ hẹp; cây nhiểm sớm còi
cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh tính virus gây bệnh chỉ có thể biết được dựa
vào các phân tích phân tử (Moriones & Navas-Castillo, 2000).
Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá được xem là bệnh virus quan trọng nhất
trên cà chua với tỉ lệ nhiễm bệnh trên các ruộng trồng cà chua thường rất cao, có
khi tới 100%. Bệnh đã được phát hiện thấy trên cà chua từ những năm 80. Một số
nghiên cứu về tạo huyết thanh chuẩn đoán, lây nhiễm nhân tạo đã được thực hiện
trong thời gian này nhưng bản chất thực sự của virus vẫn chưa rõ. Gần đây dựa vào
các phân tích phân tử, có ít nhất 3 loài begomovirus được phát hiện gây ra bệnh
xoăn vàng lá cà chua ở Việt Nam. Loài thứ nhất là Tomato leaf curl Việt Nam virus
(ToLCVNV) được phân phập từ cây cà chua bị bệnh xoăn vàng ngọn ở miền Bắc
vào năm 2001 (Green et al., 2001), Loài thứ hai là Tomato yellow leaf curl
Kanchanaburi virus (TYLCKaV), được phân lập đầu tiên ở tỉnh Kanchanaburi
(Thái Lan) vào năm 2002 (Green et al., 2002) và được phát hiện trên cây cà chua ở
Việt Nam vào năm 2005 (mã số Genbank của mẫu Việt Nam là DQ169054, -55).
Năm 2007, từ một mẫu cà chua bị bênh xoăn vàng ngọn thu thập tại Hà Nội, cùng
với ToLCVV, một loài begomovirus thứ ba cũng đã được phân lập. Loài này được
đặt tên là Tomato yellow leaf curl Việt Nam virus (ToYLCKaV) (Hà et al., 2008).
Trong số 3 virus trên có 2 virus được phân lập trên mẫu cà chua gây bệnh xoăn
vàng lá ở miền Bắc là ToLCVNV và TYLCVNV.
2.4 Một số begomovirus hại ớt
Theo (Green and Kim, 1991) có khoảng 35 loài virus khác nhau gây hại trên
ớt ở các vùng trồng trên thế giới đã được phát hiện thì có 12 loài gây hại trên ớt ở https://drivers.vn/
Châu Á Thái Bình Dương. Cho đến năm 2001 thì có đến 65 loài virus khác nhau
đã được phát hiện trong đó có những loài thuộc chi Begomovirus (AVRDC, 2001).
Theo kết quả nghiên cứu của (Green and Kim, 1991), triệu chứng cuốn lá ớt
trồng ở Banthra lan truyền qua bọ phấn Bemissia tabaci là do Chilli Leaf Curl Virus
(ChiLCV) gây ra.
Số lượng các loài virus mới gây hại trên ớt ngọt và ớt cay ngày càng được
phát hiện. Đã có hơn 9 loài virus thuộc chi begomovirus gây hại trên các cây trồng
khác ở Trung Quốc và Đài Loan
Ở nước ta, tại miền Bắc, Nguyễn Thị Thu Ngọc (2009) đã phát hiện được
sự có mặt của begomovirus cụ thể là 2 virus Tomato yellow leaf curl virus
(TYLCVNV) và Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) trên ớt. Tuy nhiên hiện
tại ở Việt Nam lại chưa có nhiều nghiên cứu về xác định thành phần bệnh virus hại
ớt nói chung và Begomovirus hại ớt nói riêng.
Trên ớt triệu chứng do begomovirus gây ra gồm có: biến vàng, cuốn lá, khảm
lá,...Triệu chứng của Pepper leaf curl virus gây ra: gây hại là non, lá biến dạng, bị
cuốn mép.
2.5 Kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR
Giới thiệu: PCR là một trong các phát minh quan trọng nhất của thế kỷ 20
trong sinh học phân tử. PCR là kỹ thuật đơn giản nhưng được sử dụng trong hầu
hết các nghiên cứu CNSH (Hà Viết Cường, 2010), đặc biệt là trong lĩnh vực chẩn
đoán bệnh virus. Ngoài các kỹ thuật chẩn đoán thông thường bằng mắt, chỉ thị,
kháng nguyên- kháng thể thì PCR là kỹ thuật chẩn đoán cho kết quả chính xác và
hiệu quả nhất. Trên thực tế những loài tác nhân gây bệnh trong cùng 1 chi hay 1 họ
sẽ gây ra những triệu chứng tương tự nhau, khó phân biệt. PCR giúp phân biệt
chính xác đến loài nhờ vào mồi đặc hiệu, được thiết kế trên vùng bảo thủ của gen.
Nguyên lý: PCR là phản ứng sinh tổng hợp DNA, gồm nhiều chu kỳ nối tiếp
nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: https://drivers.vn/
đã được phát hiện trong đó có những loài thuộc chi Begomovirus (AVRDC, 2001).
Theo kết quả nghiên cứu của (Green and Kim, 1991), triệu chứng cuốn lá ớt
trồng ở Banthra lan truyền qua bọ phấn Bemissia tabaci là do Chilli Leaf Curl Virus
(ChiLCV) gây ra.
Số lượng các loài virus mới gây hại trên ớt ngọt và ớt cay ngày càng được
phát hiện. Đã có hơn 9 loài virus thuộc chi begomovirus gây hại trên các cây trồng
khác ở Trung Quốc và Đài Loan
Ở nước ta, tại miền Bắc, Nguyễn Thị Thu Ngọc (2009) đã phát hiện được
sự có mặt của begomovirus cụ thể là 2 virus Tomato yellow leaf curl virus
(TYLCVNV) và Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) trên ớt. Tuy nhiên hiện
tại ở Việt Nam lại chưa có nhiều nghiên cứu về xác định thành phần bệnh virus hại
ớt nói chung và Begomovirus hại ớt nói riêng.
Trên ớt triệu chứng do begomovirus gây ra gồm có: biến vàng, cuốn lá, khảm
lá,...Triệu chứng của Pepper leaf curl virus gây ra: gây hại là non, lá biến dạng, bị
cuốn mép.
2.5 Kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR
Giới thiệu: PCR là một trong các phát minh quan trọng nhất của thế kỷ 20
trong sinh học phân tử. PCR là kỹ thuật đơn giản nhưng được sử dụng trong hầu
hết các nghiên cứu CNSH (Hà Viết Cường, 2010), đặc biệt là trong lĩnh vực chẩn
đoán bệnh virus. Ngoài các kỹ thuật chẩn đoán thông thường bằng mắt, chỉ thị,
kháng nguyên- kháng thể thì PCR là kỹ thuật chẩn đoán cho kết quả chính xác và
hiệu quả nhất. Trên thực tế những loài tác nhân gây bệnh trong cùng 1 chi hay 1 họ
sẽ gây ra những triệu chứng tương tự nhau, khó phân biệt. PCR giúp phân biệt
chính xác đến loài nhờ vào mồi đặc hiệu, được thiết kế trên vùng bảo thủ của gen.
Nguyên lý: PCR là phản ứng sinh tổng hợp DNA, gồm nhiều chu kỳ nối tiếp
nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: https://drivers.vn/
- Biến tính: Hỗn hợp phản ứng được dặt ở nhiệt độ cao (92-94
0
C) trong khoảng
thời gian ngắn (20-60 giây). Ở nhiệt độ này, khuôn DNA dạng sợi kép tách
thành sợi đơn.
- Gắn mồi: Hỗn hợp phản ứng được đặt ở nhiệt độ gắn mồi trong thời gian ngắn
(35 giây). Nhiệt độ gắn mồi được tính toán tùy thuộc đặc điểm mồi, thường
trong khoảng 40-60
0
C, ở nhiệt độ này mồi được gắn vào sợi khuôn ở vị trí đặc
hiệu.
- Tổng hợp sản phẩm PCR: hỗn hợp phản ứng được tăng tới nhiệt độ tối ưu cho
phản ứng tổng hợp chuỗi, tùy thuộc DNA polymerase chịu nhiệt.
2.6 Kỹ thuật RCA (Rolling circle amplication)
Gần đây, một phương pháp nhân bản DNA mới dùng kỹ thuật RCA (Rolling
Circle Amplification) đã được sử dụng để nhân các bộ gen DNA dạng mạch vòng.
Kỹ thuật RCA dùng enzyme DNA polymerase của thực khuẩn thể Φ29, một
enzyme có hoạt tính chuyển mạch (strand-displacement) rất cao, và mồi hexamer
để nhân các phân tử DNA mạch vòng thành các multimer mạch thẳng (gồm nhiều
bộ gen virus liên tiếp) (Hình 2.10) Sản phẩm RCA sẽ được cắt bằng enzyme cắt
giới hạn thích hợp và được dòng hóa trong các vector dòng hóa thông thường. Đây
là kỹ thuật hiện đang rất thông dụng trong nghiên cứu các virus có bộ gen DNA
mạch vòng kể cả các begomovirus và vệ tinh ((Inoue-Nagata, Albuquerque et al.,
2004), (Haible, Kober et al., 2006), (Knierim and Maiss, 2007)). https://drivers.vn/
0
C) trong khoảng
thời gian ngắn (20-60 giây). Ở nhiệt độ này, khuôn DNA dạng sợi kép tách
thành sợi đơn.
- Gắn mồi: Hỗn hợp phản ứng được đặt ở nhiệt độ gắn mồi trong thời gian ngắn
(35 giây). Nhiệt độ gắn mồi được tính toán tùy thuộc đặc điểm mồi, thường
trong khoảng 40-60
0
C, ở nhiệt độ này mồi được gắn vào sợi khuôn ở vị trí đặc
hiệu.
- Tổng hợp sản phẩm PCR: hỗn hợp phản ứng được tăng tới nhiệt độ tối ưu cho
phản ứng tổng hợp chuỗi, tùy thuộc DNA polymerase chịu nhiệt.
2.6 Kỹ thuật RCA (Rolling circle amplication)
Gần đây, một phương pháp nhân bản DNA mới dùng kỹ thuật RCA (Rolling
Circle Amplification) đã được sử dụng để nhân các bộ gen DNA dạng mạch vòng.
Kỹ thuật RCA dùng enzyme DNA polymerase của thực khuẩn thể Φ29, một
enzyme có hoạt tính chuyển mạch (strand-displacement) rất cao, và mồi hexamer
để nhân các phân tử DNA mạch vòng thành các multimer mạch thẳng (gồm nhiều
bộ gen virus liên tiếp) (Hình 2.10) Sản phẩm RCA sẽ được cắt bằng enzyme cắt
giới hạn thích hợp và được dòng hóa trong các vector dòng hóa thông thường. Đây
là kỹ thuật hiện đang rất thông dụng trong nghiên cứu các virus có bộ gen DNA
mạch vòng kể cả các begomovirus và vệ tinh ((Inoue-Nagata, Albuquerque et al.,
2004), (Haible, Kober et al., 2006), (Knierim and Maiss, 2007)). https://drivers.vn/
Hình 2.7. Cơ chế tái bản các phân tử DNA mạch vòng bằng kỹ thuật
RCA (Rolling Circle Amplification) dùng hexamer và Φ29 polymerase DNA
(Fujii, Kitaoka et al., 2006)
Kỹ thuật RCA đã được ứng dụng để thiết kế các cấu trúc xâm nhiễm của
begomovirus.Sản phẩm RCA dạng multimers được cắt đơn bằng enzyme cắt giới
hạn thích hợp trong điều kiện không triệt để để tạo ra nhiều sản phẩm monomer (1
bộ gen), dimer (2 bộ gen) và multimer (nhiều bộ gen). Chỉ các sản phẩm dimer
được tinh chiết khỏi gel agarose và nối vào vector nhị nguyễn.Bằng cách đơn giản
này, các cấu trúc xâm nhiễm của begomovirus có thể được tạo ra khá nhanh chóng.
(Inoue-Nagata, Albuquerque et al., 2004), (Knierim and Maiss, 2007), (Ferreira,
Lemos et al., 2008), (Wu, Lai et al., 2008), (Wu, Lai et al., 2008), (Wyant,
Gotthardt et al., 2011).
2.7 Kĩ thuật Agroinoculation
Kỹ thuật chuyển cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào cây nhờ vi khuẩn
A.tumerfaciens được gọi là agroinoculation.Agroinoculation là kỹ thuật chuyển
cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào cây nhờ vi khuẩn A. tumerfaciens. https://drivers.vn/
RCA (Rolling Circle Amplification) dùng hexamer và Φ29 polymerase DNA
(Fujii, Kitaoka et al., 2006)
Kỹ thuật RCA đã được ứng dụng để thiết kế các cấu trúc xâm nhiễm của
begomovirus.Sản phẩm RCA dạng multimers được cắt đơn bằng enzyme cắt giới
hạn thích hợp trong điều kiện không triệt để để tạo ra nhiều sản phẩm monomer (1
bộ gen), dimer (2 bộ gen) và multimer (nhiều bộ gen). Chỉ các sản phẩm dimer
được tinh chiết khỏi gel agarose và nối vào vector nhị nguyễn.Bằng cách đơn giản
này, các cấu trúc xâm nhiễm của begomovirus có thể được tạo ra khá nhanh chóng.
(Inoue-Nagata, Albuquerque et al., 2004), (Knierim and Maiss, 2007), (Ferreira,
Lemos et al., 2008), (Wu, Lai et al., 2008), (Wu, Lai et al., 2008), (Wyant,
Gotthardt et al., 2011).
2.7 Kĩ thuật Agroinoculation
Kỹ thuật chuyển cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào cây nhờ vi khuẩn
A.tumerfaciens được gọi là agroinoculation.Agroinoculation là kỹ thuật chuyển
cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào cây nhờ vi khuẩn A. tumerfaciens. https://drivers.vn/
Agrobacterium tumerfaciens là vi khuẩn đất, gram (-), được sử dụng như các
vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai vào mô và tế bào thực vật. A.
tumerfaciens có chứa một plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi là Ti-plasmid
(Tumor inducing plasmid) chính là tác nhân truyền bệnh cho cây. Khi cây bị nhiễm
A. tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện bệnh rõ nhất là các khối u được hình
thành ở ngay chỗ lây nhiễm. Sự hình thành khối u sau đó có thể tiếp tục mà không
cần thiết phải có sự hiện diện của vi khuẩn. Khả năng này có được do A. tumefaciens
đã chuyển một đoạn DNA của Ti-plasmid (T-DNA) xâm nhập vào hệ gen của cây
bị bệnh, dẫn đến sự rối loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u.
Kỹ thuật agroinoculation đòi hỏi 1 cấu trúc xâm nhiễm bao gồm bộ gen virus
(hoặc vệ tinh) được thiết kế chứa 2 nguồn gốc tái sinh (ori) ở 2 đầu và được gắn
vào vị trí giữa bờ trái và bờ phải của 1 vector nhị nguyên. Cấu trúc xâm nhiễm sẽ
được biến nạp vào tế bào vi khuẩn A. tumerfaciens. Khi lây nhiễm, tế bào vi khuẩn
sẽ tiếp xúc với tế bào cây ký chủ và các protein chức năng (nằm trên Ti-plasmid)
sẽ chuyển toàn bộ phần DNA nằm giữa bờ trái và bờ phải của cấu trúc xâm nhiễm
vào nhân tế bào cây ký chủ và tổng hợp phần DNA này vào bộ gen tế bào cây ký
chủ. Trong tế bào chứa gen chuyển, gen Rep của virus sẽ được biểu hiện thành
protein Rep. Protein Rep sẽ cắt bộ gen virus khỏi bộ gen tế bào cây tại vị trí đặc
hiệu trên chuỗi ori và nối lại thành bộ gen virus nguyên vẹn. Bộ gen virus nguyên
vẹn này sẽ thực hiện chức năng sinh học và gây bệnh. https://drivers.vn/
vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai vào mô và tế bào thực vật. A.
tumerfaciens có chứa một plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi là Ti-plasmid
(Tumor inducing plasmid) chính là tác nhân truyền bệnh cho cây. Khi cây bị nhiễm
A. tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện bệnh rõ nhất là các khối u được hình
thành ở ngay chỗ lây nhiễm. Sự hình thành khối u sau đó có thể tiếp tục mà không
cần thiết phải có sự hiện diện của vi khuẩn. Khả năng này có được do A. tumefaciens
đã chuyển một đoạn DNA của Ti-plasmid (T-DNA) xâm nhập vào hệ gen của cây
bị bệnh, dẫn đến sự rối loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u.
Kỹ thuật agroinoculation đòi hỏi 1 cấu trúc xâm nhiễm bao gồm bộ gen virus
(hoặc vệ tinh) được thiết kế chứa 2 nguồn gốc tái sinh (ori) ở 2 đầu và được gắn
vào vị trí giữa bờ trái và bờ phải của 1 vector nhị nguyên. Cấu trúc xâm nhiễm sẽ
được biến nạp vào tế bào vi khuẩn A. tumerfaciens. Khi lây nhiễm, tế bào vi khuẩn
sẽ tiếp xúc với tế bào cây ký chủ và các protein chức năng (nằm trên Ti-plasmid)
sẽ chuyển toàn bộ phần DNA nằm giữa bờ trái và bờ phải của cấu trúc xâm nhiễm
vào nhân tế bào cây ký chủ và tổng hợp phần DNA này vào bộ gen tế bào cây ký
chủ. Trong tế bào chứa gen chuyển, gen Rep của virus sẽ được biểu hiện thành
protein Rep. Protein Rep sẽ cắt bộ gen virus khỏi bộ gen tế bào cây tại vị trí đặc
hiệu trên chuỗi ori và nối lại thành bộ gen virus nguyên vẹn. Bộ gen virus nguyên
vẹn này sẽ thực hiện chức năng sinh học và gây bệnh. https://drivers.vn/
Hình 2.8. Khối u do A.tumerfaciens gây ra Hình 2.9. Quá trình lây nhiễm của Ti
Plasmid trong A.tumerfaciens vào cây
A: Agrobacterium tumefaciens. B: Agrobacterium genome. C: Ti
Plasmid : a: T-DNA , b: Vir genes , c: Replication origin , d: Opines
catabolism genes. D: Plant cell. E: Mitochondria. F: Chloroplast. G: Nucleus
Có 3 kỹ thuật agroinoculation chính là: (i) thấm chân không (lá cây được
nhúng trong dung dịch vi khuẩn, được xử lý chân không để hút khí trong gian bào;
vi khuẩn sẽ dễ dàng xâm nhập vào trong mô qua khí khổng khi áp suất trở lại bình
thường); (ii) tiêm trực tiếp vi khuẩn vào mô; và (iii) tưới trực tiếp dịch vi khuẩn
vào đất
https://drivers.vn/
Plasmid trong A.tumerfaciens vào cây
A: Agrobacterium tumefaciens. B: Agrobacterium genome. C: Ti
Plasmid : a: T-DNA , b: Vir genes , c: Replication origin , d: Opines
catabolism genes. D: Plant cell. E: Mitochondria. F: Chloroplast. G: Nucleus
Có 3 kỹ thuật agroinoculation chính là: (i) thấm chân không (lá cây được
nhúng trong dung dịch vi khuẩn, được xử lý chân không để hút khí trong gian bào;
vi khuẩn sẽ dễ dàng xâm nhập vào trong mô qua khí khổng khi áp suất trở lại bình
thường); (ii) tiêm trực tiếp vi khuẩn vào mô; và (iii) tưới trực tiếp dịch vi khuẩn
vào đất
https://drivers.vn/
3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU
3.1 Đối tượng nghiên cứu
Virus: Pepper yellow leaf curl virus (PepYLCV)
Cây: ớt, cà chua
3.2 Địa điểm nghiên cứu và thời gian thực hiện
3.2.1 Địa điểm nghiên cứu
- Điều tra, thu mẫu đồng ruộng đồng ruộng được thực hiện tại Khu trồng rau
Lĩnh Nam (Thanh Trì – Hà Nội), Văn Đức (Văn Giang – Hưng Yên), Quỳnh
Phụ (Thái Bình)
- Thí nghiệm trong phòng được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu bệnh cây
nhiệt đới - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
3.3 Thời gian thực hiện
Từ tháng 1/2014 đến tháng 7/2014
3.4 Vật liệu nghiên cứu
3.4.1 Cây thí nghiệm:
Bảng 3.1. Cây thí nghiệm
STT Cây Giống Nguồn gốc Đặc điểm
1 Cà chua AVTO1080 AVRDC
Chuẩn nhiễm
(không chứa
gen kháng)
2 Cà chua HT7
BM DT-
Giống
Chuẩn nhiễm
3 Ớt
Hiểm Lai
F1
Địa phương Chuẩn nhiễm https://drivers.vn/
3.1 Đối tượng nghiên cứu
Virus: Pepper yellow leaf curl virus (PepYLCV)
Cây: ớt, cà chua
3.2 Địa điểm nghiên cứu và thời gian thực hiện
3.2.1 Địa điểm nghiên cứu
- Điều tra, thu mẫu đồng ruộng đồng ruộng được thực hiện tại Khu trồng rau
Lĩnh Nam (Thanh Trì – Hà Nội), Văn Đức (Văn Giang – Hưng Yên), Quỳnh
Phụ (Thái Bình)
- Thí nghiệm trong phòng được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu bệnh cây
nhiệt đới - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
3.3 Thời gian thực hiện
Từ tháng 1/2014 đến tháng 7/2014
3.4 Vật liệu nghiên cứu
3.4.1 Cây thí nghiệm:
Bảng 3.1. Cây thí nghiệm
STT Cây Giống Nguồn gốc Đặc điểm
1 Cà chua AVTO1080 AVRDC
Chuẩn nhiễm
(không chứa
gen kháng)
2 Cà chua HT7
BM DT-
Giống
Chuẩn nhiễm
3 Ớt
Hiểm Lai
F1
Địa phương Chuẩn nhiễm https://drivers.vn/
4
Thuốc lá cảnh
(Nicotiana
benthamiana)
AVRDC
Cây mô hình
cho virus thực
vật
5 Thuốc lá (N. tabacum)
cv.
Samsum
AVRDC Cây chỉ thị
6 Thuốc lá (N. tabacum) cv. Xanthi AVRDC Cây chỉ thị
7 Thuốc lá (N. tabacum) cv. K326 Viện NCTL Cây chỉ thị
8
Thuốc lào (N.
glutinosa)
AVRDC Cây chỉ thị
9
Hoa ngũ sắc
(Ageratum
conyzoides)
Cây dại Cây chỉ thị
10 Cà bát Địa phương Chuẩn nhiễm
11 Cà pháo Địa phương Chuẩn nhiễm
3.4.2 Thu thập mẫu
Mẫu bênh có triệu chứng điển hình được thu thập từ các địa điểm điều tra
(bảng 3.3), sau đó được bảo quản khô bằng hạt Silicagel để kiểm tra virus.
Bảng 3.2. Các mẫu ớt, cà tím thu thập (2013)
Ký hiệu Địa điểm, khu vực thu mẫu Đối tượng Triệu chứng
VNP 4 FAVRI Ớt Khảm vàng, cuốn lá
VNP 93 Đà Nẵng Ớt Xoăn vàng lá
VNP 96 Túy Loan- Đà Nẵng Ớt Cuốn lá, khảm
VNP 120 Thái Bình Ớt Khảm
VNP 179 Cam lộ- Quảng Trị Ớt Cuốn lá, khảm
VNP 192 Cam Đường- Lào Cai Ớt Khảm
VNP 217 Cò Nòi- Sơn La Ớt Khảm
VNP 234 Cổ Phúc- Yên Bái Ớt Khảm
VNP 246 Chiềng Sinh- Sơn La Ớt Xoăn lá
VNP 251 Chiềng Sinh- Sơn La Ớt Cuốn lá, khảm
VNP 291 Vĩnh Tường- Vĩnh Phúc Ớt Khảm vàng, lá nhỏ
VNP 300 Sóc Sơn- Hà Nội Ớt Xoăn vàng lá https://drivers.vn/
Thuốc lá cảnh
(Nicotiana
benthamiana)
AVRDC
Cây mô hình
cho virus thực
vật
5 Thuốc lá (N. tabacum)
cv.
Samsum
AVRDC Cây chỉ thị
6 Thuốc lá (N. tabacum) cv. Xanthi AVRDC Cây chỉ thị
7 Thuốc lá (N. tabacum) cv. K326 Viện NCTL Cây chỉ thị
8
Thuốc lào (N.
glutinosa)
AVRDC Cây chỉ thị
9
Hoa ngũ sắc
(Ageratum
conyzoides)
Cây dại Cây chỉ thị
10 Cà bát Địa phương Chuẩn nhiễm
11 Cà pháo Địa phương Chuẩn nhiễm
3.4.2 Thu thập mẫu
Mẫu bênh có triệu chứng điển hình được thu thập từ các địa điểm điều tra
(bảng 3.3), sau đó được bảo quản khô bằng hạt Silicagel để kiểm tra virus.
Bảng 3.2. Các mẫu ớt, cà tím thu thập (2013)
Ký hiệu Địa điểm, khu vực thu mẫu Đối tượng Triệu chứng
VNP 4 FAVRI Ớt Khảm vàng, cuốn lá
VNP 93 Đà Nẵng Ớt Xoăn vàng lá
VNP 96 Túy Loan- Đà Nẵng Ớt Cuốn lá, khảm
VNP 120 Thái Bình Ớt Khảm
VNP 179 Cam lộ- Quảng Trị Ớt Cuốn lá, khảm
VNP 192 Cam Đường- Lào Cai Ớt Khảm
VNP 217 Cò Nòi- Sơn La Ớt Khảm
VNP 234 Cổ Phúc- Yên Bái Ớt Khảm
VNP 246 Chiềng Sinh- Sơn La Ớt Xoăn lá
VNP 251 Chiềng Sinh- Sơn La Ớt Cuốn lá, khảm
VNP 291 Vĩnh Tường- Vĩnh Phúc Ớt Khảm vàng, lá nhỏ
VNP 300 Sóc Sơn- Hà Nội Ớt Xoăn vàng lá https://drivers.vn/
VNP 306 Yên Thế- Bắc Giang Ớt Khảm vàng
VNP 313 Châu Thành- An Giang Ớt Khảm vàng
VNP 453 Vĩnh Bảo- Hải Phòng Ớt Khảm vàng
VNP 456 Quỳnh Phụ- Thái Bình Ớt Sáng gân
VNP 459 Quỳnh phụ- Thái Bình Ớt Sáng gân từ cuống
VNP 535 Hòa An- Cao Bằng Ớt Khảm
VNP 558 Chợ Mới- Bắc Kạn Ớt Khảm nhăn
VNP 626 Túy Loan- Đà Nẵng Ớt Khảm
VNP 632 Túy Loan- Đà Nẵng Ớt Khảm vàng
VNP 634 Điện Bàn- Quảng Nam Ớt Khảm vàng
VNP 649 Phù Cát- Bình Định Ớt Khảm vàng
VNP 683 Thái Bình- Đồng Tháp Ớt Khảm
VNP 706 Châu Thành- An Giang Ớt Khảm vàng
VNP 716 Yên Thế- Bắc Giang Ớt Khảm
VNP 785 Bình Thủy- Cần Thơ Ớt Khảm
VNP 961 An Dương- Hải Phòng Ớt Khảm, biến vàng
VNP
1500
Cao Lãnh- Đồng Tháp Ớt Lá vàng, gân sáng
VNP
1501
Thái Bình- Đồng Tháp Cà tím Vàng lá
Các mẫu gây bệnh virus trên cà tím, ớt và một số cây trồng khác được chúng tôi
thu thập sử dụng cho nghiên cứu này,chủ yếu tập trung nghiên cứu một số mẫu
begomovirus quan trọng trên ớt,cà tím thu được tại miền Trung Việt Nam với
những triệu chứng đặc trưng của begomovirus..
3.4.3 Dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm
của PepYLCVNV
PepYLCVNV là một begomovirus có bộ gen kép (có cả DNA-A và DNA-
B). Cấu trúc xâm nhiễm của cả 2 thành phần genome của virus đã được xây dựng
sẵn trên vector chuyển gen thực vật là pCAMBIA2300 và đã được biến nạp vào tế https://drivers.vn/
VNP 313 Châu Thành- An Giang Ớt Khảm vàng
VNP 453 Vĩnh Bảo- Hải Phòng Ớt Khảm vàng
VNP 456 Quỳnh Phụ- Thái Bình Ớt Sáng gân
VNP 459 Quỳnh phụ- Thái Bình Ớt Sáng gân từ cuống
VNP 535 Hòa An- Cao Bằng Ớt Khảm
VNP 558 Chợ Mới- Bắc Kạn Ớt Khảm nhăn
VNP 626 Túy Loan- Đà Nẵng Ớt Khảm
VNP 632 Túy Loan- Đà Nẵng Ớt Khảm vàng
VNP 634 Điện Bàn- Quảng Nam Ớt Khảm vàng
VNP 649 Phù Cát- Bình Định Ớt Khảm vàng
VNP 683 Thái Bình- Đồng Tháp Ớt Khảm
VNP 706 Châu Thành- An Giang Ớt Khảm vàng
VNP 716 Yên Thế- Bắc Giang Ớt Khảm
VNP 785 Bình Thủy- Cần Thơ Ớt Khảm
VNP 961 An Dương- Hải Phòng Ớt Khảm, biến vàng
VNP
1500
Cao Lãnh- Đồng Tháp Ớt Lá vàng, gân sáng
VNP
1501
Thái Bình- Đồng Tháp Cà tím Vàng lá
Các mẫu gây bệnh virus trên cà tím, ớt và một số cây trồng khác được chúng tôi
thu thập sử dụng cho nghiên cứu này,chủ yếu tập trung nghiên cứu một số mẫu
begomovirus quan trọng trên ớt,cà tím thu được tại miền Trung Việt Nam với
những triệu chứng đặc trưng của begomovirus..
3.4.3 Dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm
của PepYLCVNV
PepYLCVNV là một begomovirus có bộ gen kép (có cả DNA-A và DNA-
B). Cấu trúc xâm nhiễm của cả 2 thành phần genome của virus đã được xây dựng
sẵn trên vector chuyển gen thực vật là pCAMBIA2300 và đã được biến nạp vào tế https://drivers.vn/
bào A. tumefaciens chủng LBA4404. Hai dòng vi khuẩn A. tumefaciens mang cấu
trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV là:
- AT-5-4-11: mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-A
- AT-5-8-1: mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-B
Cả hai dòng vi khuẩn trên được bảo quản trong glycerol 15% ở -80
o
C. Ba
kháng sinh chọn lọc các dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiễm là:
- Rifampicin: gen kháng nằm trên bộ genome vi khuẩn
- Streptomycin: Gen kháng nằm trên plasmid hỗ trợ (Ti plasmid pAL4404) có
sẵn trong tế bào vi khuẩn
- Kanamycin: Gen kháng nằm trên plasmid pCAMBIA2300.
3.4.3.1 Mồi PCR
Cặp mồi chung phát hiện DNA-A của Begomovirus là BegoA-ReV1 &
Bego-AFor1 (Ha Viet Cuong et al., 2006).
BegoA-ReV1: 5’- ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC
*
-3’
BegoA-For1 : 5’- TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC
*
-3’
* Y (C / T), R (G / A), H (A / C / T), M (A / C), B (C / G / T), D (A / G / T),
K (G / T) và i = inosine.
+ Các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng:
Bảng 3.3. Các mồi đặc hiệu
(CEGPCKVQS) (IPT/A/SIF/VLCNP)
AV1
AV2
AC3
AC2
AC1
AC4
BegoAFor1 BegoARev1
~ 1.2 kb
DNA-A
Hình 3.1: Sơ đồ tổ chức bộ gen DNA-A (biểu diễn dưới dạng mạch
thẳng) của begomovirus và vị trí tương đối của cặp mồi BegoA-For1 và
BegoA-Rev1. Mũi tên dạng hộp biểu diễn vị trí và hướng của các ORF.
Dãy chữ trong 2 ngoặc kép là các chuỗi axit amin bảo thủ tương ứng với
2 mồi BegoAFor1 và BegoARev1. https://drivers.vn/
trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV là:
- AT-5-4-11: mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-A
- AT-5-8-1: mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-B
Cả hai dòng vi khuẩn trên được bảo quản trong glycerol 15% ở -80
o
C. Ba
kháng sinh chọn lọc các dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiễm là:
- Rifampicin: gen kháng nằm trên bộ genome vi khuẩn
- Streptomycin: Gen kháng nằm trên plasmid hỗ trợ (Ti plasmid pAL4404) có
sẵn trong tế bào vi khuẩn
- Kanamycin: Gen kháng nằm trên plasmid pCAMBIA2300.
3.4.3.1 Mồi PCR
Cặp mồi chung phát hiện DNA-A của Begomovirus là BegoA-ReV1 &
Bego-AFor1 (Ha Viet Cuong et al., 2006).
BegoA-ReV1: 5’- ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC
*
-3’
BegoA-For1 : 5’- TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC
*
-3’
* Y (C / T), R (G / A), H (A / C / T), M (A / C), B (C / G / T), D (A / G / T),
K (G / T) và i = inosine.
+ Các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng:
Bảng 3.3. Các mồi đặc hiệu
(CEGPCKVQS) (IPT/A/SIF/VLCNP)
AV1
AV2
AC3
AC2
AC1
AC4
BegoAFor1 BegoARev1
~ 1.2 kb
DNA-A
Hình 3.1: Sơ đồ tổ chức bộ gen DNA-A (biểu diễn dưới dạng mạch
thẳng) của begomovirus và vị trí tương đối của cặp mồi BegoA-For1 và
BegoA-Rev1. Mũi tên dạng hộp biểu diễn vị trí và hướng của các ORF.
Dãy chữ trong 2 ngoặc kép là các chuỗi axit amin bảo thủ tương ứng với
2 mồi BegoAFor1 và BegoARev1. https://drivers.vn/
No Primer Sequence
Sản
phẩm
(kb)
Aim
1 VNP93-A-F1
CATGCTAGTAATCCAG
TGTATGC
~1.3
Detection
DNA-A of
PepYLCVNV
2 VNP93-A-R1
ATCTGCCAACGACGCA
TATGC
3 VNP93-B-F1
GTGATTCATGTTATACG
CCTTCG
~1.3
Detection
DNA-B of
PepYLCVNV
4 VNP93-B-R1
TCAATCGCTCTGCCTT
CTCTC
5 BegoAReV1
ATHCCMDCHATCKTBC
TiTGCAATCC*
~1.2
Detection
DNA-B of
Begomovirus
6 BegoAFor1
TGYGARGGiCCiTGYAA
RGTYCARTC*
3.4.4 Vật liệu nghiên cứu
3.4.4.1 Chất kháng sinh
Các kháng sinh được sử dụng trong nghiên cứu gồm: Rifampicin,
kanamycin, streptomycin, tetracylin. Các kháng sinh được chuẩn bị dưới dạng dung
dịch gốc như sau:
- Rifampicin 34 μg/μl: hòa 0,034 g trong 1 ml Methanol
- Kanamycin 100 μg/μl: hòa 0,1 g trong 1 ml nước cất hai lần
- Streptomycin 50 μg/μl: hòa 0,05 g trong 1 ml nước cất hai lần
- Tetracylin 12,5 μg/μl: hòa 0,012 g trong 1 ml ethanol 70 %
Các kháng sinh được bảo quản ở tủ lạnh sâu – 20
o
C, trong đó rifampicin và
kanamycin được bọc kín bằng giấy bạc.
3.4.4.2 Các chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu
- Chủng vi khuẩn A. tumefaciens khả biến
Chủng vi khuẩn A.tumefaciens được sử dụng là LBA4404. Chủng này chứa
Ti plasmid pAL4404. Gen kháng Rifampicin nằm trên bộ genome vi khuẩn còn
gen kháng streptomycin nằm trên Ti plasmid pAL4404. https://drivers.vn/
Sản
phẩm
(kb)
Aim
1 VNP93-A-F1
CATGCTAGTAATCCAG
TGTATGC
~1.3
Detection
DNA-A of
PepYLCVNV
2 VNP93-A-R1
ATCTGCCAACGACGCA
TATGC
3 VNP93-B-F1
GTGATTCATGTTATACG
CCTTCG
~1.3
Detection
DNA-B of
PepYLCVNV
4 VNP93-B-R1
TCAATCGCTCTGCCTT
CTCTC
5 BegoAReV1
ATHCCMDCHATCKTBC
TiTGCAATCC*
~1.2
Detection
DNA-B of
Begomovirus
6 BegoAFor1
TGYGARGGiCCiTGYAA
RGTYCARTC*
3.4.4 Vật liệu nghiên cứu
3.4.4.1 Chất kháng sinh
Các kháng sinh được sử dụng trong nghiên cứu gồm: Rifampicin,
kanamycin, streptomycin, tetracylin. Các kháng sinh được chuẩn bị dưới dạng dung
dịch gốc như sau:
- Rifampicin 34 μg/μl: hòa 0,034 g trong 1 ml Methanol
- Kanamycin 100 μg/μl: hòa 0,1 g trong 1 ml nước cất hai lần
- Streptomycin 50 μg/μl: hòa 0,05 g trong 1 ml nước cất hai lần
- Tetracylin 12,5 μg/μl: hòa 0,012 g trong 1 ml ethanol 70 %
Các kháng sinh được bảo quản ở tủ lạnh sâu – 20
o
C, trong đó rifampicin và
kanamycin được bọc kín bằng giấy bạc.
3.4.4.2 Các chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu
- Chủng vi khuẩn A. tumefaciens khả biến
Chủng vi khuẩn A.tumefaciens được sử dụng là LBA4404. Chủng này chứa
Ti plasmid pAL4404. Gen kháng Rifampicin nằm trên bộ genome vi khuẩn còn
gen kháng streptomycin nằm trên Ti plasmid pAL4404. https://drivers.vn/
Hình 3.1.Hình thái vi khuẩn A.tumefaciens
- Chủng vi khuẩn E.coli khả biến
Chủng vi khuẩn E.coli được sử dụng là chủng XL1-Blue. Chủng này chứa
gen kháng Tetracylin nằm trên bộ gen của vi khuẩn
3.4.5 Hóa chất, dung dịch đệm
- Các hóa chất thông dụng và hóa chất để pha dung dịch đệm, chất nền, các kháng
huyết thanh của các virus thử nghiệm..
- Đệm điện di agarose (1X TAE): 10 mM Tris-acetate, 0.5 mM EDTA (pH 7.8).
- Đệm CTAB: 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP
(polyvinylpyrrolidone), 100 mM Tris-HCl pH 8.0 và 25 mM EDTA
- Đệm TE, pH8: 10 mM Tris-Cl and 1 mM EDTA
- Beta-mercaptoethanol (β-ME)
- Đệm chiết Chloroform:isoamyl alcohol (24:1)
- Cồn tuyệt đối
- Agarose
3.4.6 Kit thương mại
Kít PCR: GoTaq Green (hãng Promega) chứa sẵn đệm phản ứng, Taq
polymerase, dNTPs
3.4.7 Môi trường
a. Môi trường LB lỏng : https://drivers.vn/
- Chủng vi khuẩn E.coli khả biến
Chủng vi khuẩn E.coli được sử dụng là chủng XL1-Blue. Chủng này chứa
gen kháng Tetracylin nằm trên bộ gen của vi khuẩn
3.4.5 Hóa chất, dung dịch đệm
- Các hóa chất thông dụng và hóa chất để pha dung dịch đệm, chất nền, các kháng
huyết thanh của các virus thử nghiệm..
- Đệm điện di agarose (1X TAE): 10 mM Tris-acetate, 0.5 mM EDTA (pH 7.8).
- Đệm CTAB: 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP
(polyvinylpyrrolidone), 100 mM Tris-HCl pH 8.0 và 25 mM EDTA
- Đệm TE, pH8: 10 mM Tris-Cl and 1 mM EDTA
- Beta-mercaptoethanol (β-ME)
- Đệm chiết Chloroform:isoamyl alcohol (24:1)
- Cồn tuyệt đối
- Agarose
3.4.6 Kit thương mại
Kít PCR: GoTaq Green (hãng Promega) chứa sẵn đệm phản ứng, Taq
polymerase, dNTPs
3.4.7 Môi trường
a. Môi trường LB lỏng : https://drivers.vn/
Bacto®-tryptone (10g/L), Bacto®-yeast extract (5g/L)và NaCl (5g/L).
Các thành phần được hòa trong nước cất và môi trường được hấp khử trùng ở
121
o
C trong 20 phút. Các kháng sinh cho vào môi trường đang ấm khoảng 55
o
C
trước khi sử dụng.
b. Môi trường LB agar: Thành phần giống môi trường LB lỏng nhưng chứa 15g
agar/L. Các thành phần được hòa trong nước cất và môi trường được hấp
khử trùng ở 121
o
C trong 20 phút. Để môi trường nguội khoảng 55
o
C rồi rót
vào đĩa petri đường kính 9 cm. Các kháng sinh cần thiết được bổ sung trước
khi rót môi trường vào đĩa petri.
3.4.8 Các thiết bị chủ yếu
- Máy PCR
- Thiết bị điện di
- Máy đọc bản ELISA
- Buồng cấy vô trùng
- Nồi hấp
- Tủ ấm
- Tủ ấm có lắc
- Cân điện tử
- Tủ định ôn
3.4.9 Dụng cụ nghiên cứu
- Pipét tự động 1 côn: 10-20 μm, 100 μm, 200 μm, 100-1000 μm …
- Pipét tự động 8 đầu côn.
- Túi PE đựng mẫu.
- Ống đong 10-1000 ml.
- Bình thủy tinh loại 50-1000 ml.
- Phễu lọc, vải lọc, giấy thấm. https://drivers.vn/
Các thành phần được hòa trong nước cất và môi trường được hấp khử trùng ở
121
o
C trong 20 phút. Các kháng sinh cho vào môi trường đang ấm khoảng 55
o
C
trước khi sử dụng.
b. Môi trường LB agar: Thành phần giống môi trường LB lỏng nhưng chứa 15g
agar/L. Các thành phần được hòa trong nước cất và môi trường được hấp
khử trùng ở 121
o
C trong 20 phút. Để môi trường nguội khoảng 55
o
C rồi rót
vào đĩa petri đường kính 9 cm. Các kháng sinh cần thiết được bổ sung trước
khi rót môi trường vào đĩa petri.
3.4.8 Các thiết bị chủ yếu
- Máy PCR
- Thiết bị điện di
- Máy đọc bản ELISA
- Buồng cấy vô trùng
- Nồi hấp
- Tủ ấm
- Tủ ấm có lắc
- Cân điện tử
- Tủ định ôn
3.4.9 Dụng cụ nghiên cứu
- Pipét tự động 1 côn: 10-20 μm, 100 μm, 200 μm, 100-1000 μm …
- Pipét tự động 8 đầu côn.
- Túi PE đựng mẫu.
- Ống đong 10-1000 ml.
- Bình thủy tinh loại 50-1000 ml.
- Phễu lọc, vải lọc, giấy thấm. https://drivers.vn/
- Hộp nhựa có nắp đựng bản ELISA.
3.5 Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp điều tra đồng ruộng
- Phương pháp điều tra tỷ lệ bệnh virus hại cây cà chua, ớt ở ruộng sản xuất:
Áp dụng phương pháp nghiên cứu, điều tra và phát hiện bệnh hại theo
“Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật” của Viện bảo vệ thực vật (2003).
Mỗi điểm trồng ớt điều tra 3 ruộng đại diện cho mỗi giống. Đại diện cho giai
đoạn sinh trưởng và phát triển của cây. Điều tra theo phương pháp 5 điểm chéo góc
( cách bờ 2 mét) mỗi điểm điều tra 50 -100 cây đói với ruộng có diện tích lớn, điều
tra 100% số cây đói với ruộng có diện tích nhỏ.
Theo dõi định kỳ 10 ngày một lần , thu thập số liệu và tính tỉ lệ bệnh.Quan
sát và mô tả đặc điểm cây nhiễm bệnh. Dựa trên triệu chứng điển hình của bệnh
PepYLCVNV trên đồng ruộng tính tỉ lệ bệnh theo công thức:
TLB (%) =
A
B
x100
Trong đó: TLB: tỉ lệ bệnh (%)
A: số cây bị bệnh
B: tổng số cây điều tra
- Phương pháp điều tra diễn biến mật độ bọ phấn: Tiến hành điều tra theo 5 điểm
chéo góc, mỗi điểm cố định 5 cây, trên mỗi cây đếm toàn bộ ấu trùng và trưởng
thành.
- Phương pháp thu thập mẫu lá bệnh:
Được tiến hành theo giai đoạn sinh trưởng, tại mỗi điểm trồng ớt, thu 3
mẫu/giống với triệu chứng điển hình. Các mẫu được số liệu hóa (thời gian, địa
điểm, triệu chứng, giai đoạn sinh trưởng) và được xử lý khô bằng silicagel tự chỉ
thị để bảo quản lâu dài.
3.5.2 Thí nghiệm trong nhà lưới
- Phân cấp bệnh https://drivers.vn/
3.5 Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp điều tra đồng ruộng
- Phương pháp điều tra tỷ lệ bệnh virus hại cây cà chua, ớt ở ruộng sản xuất:
Áp dụng phương pháp nghiên cứu, điều tra và phát hiện bệnh hại theo
“Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật” của Viện bảo vệ thực vật (2003).
Mỗi điểm trồng ớt điều tra 3 ruộng đại diện cho mỗi giống. Đại diện cho giai
đoạn sinh trưởng và phát triển của cây. Điều tra theo phương pháp 5 điểm chéo góc
( cách bờ 2 mét) mỗi điểm điều tra 50 -100 cây đói với ruộng có diện tích lớn, điều
tra 100% số cây đói với ruộng có diện tích nhỏ.
Theo dõi định kỳ 10 ngày một lần , thu thập số liệu và tính tỉ lệ bệnh.Quan
sát và mô tả đặc điểm cây nhiễm bệnh. Dựa trên triệu chứng điển hình của bệnh
PepYLCVNV trên đồng ruộng tính tỉ lệ bệnh theo công thức:
TLB (%) =
A
B
x100
Trong đó: TLB: tỉ lệ bệnh (%)
A: số cây bị bệnh
B: tổng số cây điều tra
- Phương pháp điều tra diễn biến mật độ bọ phấn: Tiến hành điều tra theo 5 điểm
chéo góc, mỗi điểm cố định 5 cây, trên mỗi cây đếm toàn bộ ấu trùng và trưởng
thành.
- Phương pháp thu thập mẫu lá bệnh:
Được tiến hành theo giai đoạn sinh trưởng, tại mỗi điểm trồng ớt, thu 3
mẫu/giống với triệu chứng điển hình. Các mẫu được số liệu hóa (thời gian, địa
điểm, triệu chứng, giai đoạn sinh trưởng) và được xử lý khô bằng silicagel tự chỉ
thị để bảo quản lâu dài.
3.5.2 Thí nghiệm trong nhà lưới
- Phân cấp bệnh https://drivers.vn/
Sử dụng thang phân cấp sau để đánh giá triệu chứng
Bảng 3.4. Thang phân cấp bệnh
Cấp Mô tả triệu chứng Mức độ
1 Cây bình thường , không xuất hiện triệu chứng gì Cây khỏe
2 Lá vàng rất nhẹ , khảm, hoặc bắt đầu có triệu chứng hơi quăn Rất nhẹ
3 Lá vàng nhẹ, khảm hoặc có triệu chứng quăn Nhẹ
4 Lá vàng và quăn lại Vừa phải
5 Lá vàng dữ dội, cong và lá bị phồng dộp Nặng
6 Lá biến dạng, lá nhỏ, cây còi cọc Rất nặng
3.5.3 Phương pháp kiểm tra virus bằng PCR
3.5.3.1 Chiết DNA tổng số từ mô lá
DNA tổng số từ mô lá được chiết theo 2 phương pháp:
+ Phương pháp chiết nhanh nhanh bằng NaOH (Wang, Qi et al., 1993,
Wang, Cardiff et al., 1994)
Cho khoảng 50 mg mô lá mẫu bệnh vào tube 1,5 mL, cho tiếp 500 µl dung
dịch NaOH 0,5 M vào tube 1,5mL, dùng chày nhựa chuyên dụng để nghiền nhuyễn
mẫu lá. Lấy 100 µl dung dịch đệm Tris 0,1 M, pH = 8 vào tube 1,5mL, sau khi
nghiền mẫu xong lấy 2 µl dịch nghiền cho vào tube 1,5mL chứa dung dịch đệm
Tris 0,1M, pH = 8. Dịch hòa loãng này được dùng để chạy PCR.
+ Phương pháp chiết DNA bằng dung dịch đệm CTAB (Cetryl Ammonium
Bromide ) theo mô tả của (Doyle, 1987) như sau:
- Bước 1: Ủ đệm CTAB + β-ME (100 µl β-ME + 10 ml CTAB) ở 65oC trong 30
phút.
- Bước 2: Cho mẫu bênh cần chuẩn đoán vào tube 1,5 mL theo tỉ lệ 0,1g/1 ml
đệm CTAB + β-ME
- Bước 3: Cho vào tube 500 µl CTAB + β-ME. Nghiền nhỏ mẫu, lắc nhẹ.
- Bước 4: Ủ trong điều kiện 60 - 65
o
C, trong khảng 5 phút. https://drivers.vn/
Bảng 3.4. Thang phân cấp bệnh
Cấp Mô tả triệu chứng Mức độ
1 Cây bình thường , không xuất hiện triệu chứng gì Cây khỏe
2 Lá vàng rất nhẹ , khảm, hoặc bắt đầu có triệu chứng hơi quăn Rất nhẹ
3 Lá vàng nhẹ, khảm hoặc có triệu chứng quăn Nhẹ
4 Lá vàng và quăn lại Vừa phải
5 Lá vàng dữ dội, cong và lá bị phồng dộp Nặng
6 Lá biến dạng, lá nhỏ, cây còi cọc Rất nặng
3.5.3 Phương pháp kiểm tra virus bằng PCR
3.5.3.1 Chiết DNA tổng số từ mô lá
DNA tổng số từ mô lá được chiết theo 2 phương pháp:
+ Phương pháp chiết nhanh nhanh bằng NaOH (Wang, Qi et al., 1993,
Wang, Cardiff et al., 1994)
Cho khoảng 50 mg mô lá mẫu bệnh vào tube 1,5 mL, cho tiếp 500 µl dung
dịch NaOH 0,5 M vào tube 1,5mL, dùng chày nhựa chuyên dụng để nghiền nhuyễn
mẫu lá. Lấy 100 µl dung dịch đệm Tris 0,1 M, pH = 8 vào tube 1,5mL, sau khi
nghiền mẫu xong lấy 2 µl dịch nghiền cho vào tube 1,5mL chứa dung dịch đệm
Tris 0,1M, pH = 8. Dịch hòa loãng này được dùng để chạy PCR.
+ Phương pháp chiết DNA bằng dung dịch đệm CTAB (Cetryl Ammonium
Bromide ) theo mô tả của (Doyle, 1987) như sau:
- Bước 1: Ủ đệm CTAB + β-ME (100 µl β-ME + 10 ml CTAB) ở 65oC trong 30
phút.
- Bước 2: Cho mẫu bênh cần chuẩn đoán vào tube 1,5 mL theo tỉ lệ 0,1g/1 ml
đệm CTAB + β-ME
- Bước 3: Cho vào tube 500 µl CTAB + β-ME. Nghiền nhỏ mẫu, lắc nhẹ.
- Bước 4: Ủ trong điều kiện 60 - 65
o
C, trong khảng 5 phút. https://drivers.vn/
- Bước 5: Ly tâm 7 phút.
- Bước 6: Lấy dịch trên tủa (khoảng 400 µl)
- Bước 7: Chiết một thể tích tương đương (400 µl) dung dịch Chlorofom : isoamyl
alcohol (24:1).
- Bước 8: Ly tâm trong 5 phút.
- Bước 9: Lấy dịch trên tủa (khoảng 300 µl), để trong tủ lạnh -20 oC trong khoảng
ít nhất 2 phút.
- Bước 10: Chiết lần 2 với 300 µl Chlorofom : isoamyl alcohol (24:1). Để lạnh 5
phút.
- Bước 11: Ly tâm trong 5 phút.
- Bước 12: Lấy dịch trên tủa (khoảng 200 µl) cho vào tube 1,5 mL.
- Bước 13: Bổ sung một thể tích tương đương (khoảng 200 µl) isopropanol lạnh.
Để ở nhiệt đọ -20
o
C trong 20 phút
- Bước 14: Lắc đều, ly tâm trong 15 phút.
- Loại bỏ dịch trên tủa, giữ lại cặn. Spin trong 15 phút để hút hết dịch trong tube
ra.
- Bước 16: Rửa cặn DNA 2 lần với etanol 70% (khoảng 700 µl).
- Bước 17: Làm khô cặn bằng không khí.
- Bước 18: Hòa cặn DNA với 20 – 25 µl TE, búng nhẹ để DNA tan hết, giữ tube
ở điều kiện -20
o
C.
3.5.4 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) và điện di sản phẩm PCR
3.5.4.1 Chu trình phản ứng PCR
Bảng 3.5. Thành phẩn của mỗi phản ứng PCR
Thành phần Thể tích (µl)
H2O
8.9
GoTaq Master mix (2x)
10
Mồi F (20 µM)
0.3 https://drivers.vn/
- Bước 6: Lấy dịch trên tủa (khoảng 400 µl)
- Bước 7: Chiết một thể tích tương đương (400 µl) dung dịch Chlorofom : isoamyl
alcohol (24:1).
- Bước 8: Ly tâm trong 5 phút.
- Bước 9: Lấy dịch trên tủa (khoảng 300 µl), để trong tủ lạnh -20 oC trong khoảng
ít nhất 2 phút.
- Bước 10: Chiết lần 2 với 300 µl Chlorofom : isoamyl alcohol (24:1). Để lạnh 5
phút.
- Bước 11: Ly tâm trong 5 phút.
- Bước 12: Lấy dịch trên tủa (khoảng 200 µl) cho vào tube 1,5 mL.
- Bước 13: Bổ sung một thể tích tương đương (khoảng 200 µl) isopropanol lạnh.
Để ở nhiệt đọ -20
o
C trong 20 phút
- Bước 14: Lắc đều, ly tâm trong 15 phút.
- Loại bỏ dịch trên tủa, giữ lại cặn. Spin trong 15 phút để hút hết dịch trong tube
ra.
- Bước 16: Rửa cặn DNA 2 lần với etanol 70% (khoảng 700 µl).
- Bước 17: Làm khô cặn bằng không khí.
- Bước 18: Hòa cặn DNA với 20 – 25 µl TE, búng nhẹ để DNA tan hết, giữ tube
ở điều kiện -20
o
C.
3.5.4 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) và điện di sản phẩm PCR
3.5.4.1 Chu trình phản ứng PCR
Bảng 3.5. Thành phẩn của mỗi phản ứng PCR
Thành phần Thể tích (µl)
H2O
8.9
GoTaq Master mix (2x)
10
Mồi F (20 µM)
0.3 https://drivers.vn/
Mồi R (20 µlM)
0.3
DNA
0.5
Tổng thể tích
20
Quy trình thực hiện phản ứng PCR
94
o
C 4 phút x 1
94
o
C 35 giây
54
o
C 35 giây x 35
72
o
C 35 giây
72
o
C 4 phút x 1
- Chu trình phản ứng Multiplex – PCR kiểm tra DNA của begomovirus, sử dụng
cặp mồi đặc hiệu VNP93-A-F1/B-F1 và VNP93-A-F1/B-F1:
Multiplex – PCR : là phản ứng sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi để khuếch
đại nhiều đoạn DNA trong cùng một phản ứng PCR. Phương pháp này được thử
nghiệm thành công vào năm 1988 và được áp dụng và nhiều công trình nghiên cứu.
Cho đến nay, vẫn chưa rõ nguyên tắc chung hay thành phần chuẩn nào cho việc tối
ưu hóa phản ứng multiplex – PCR. Do vậy, ứng với mỗi điều kiện phản ứng, cần
phải điều chỉnh cho phù hợp với mục đích mong muốn.
Thành phần
Thể tích (µl)
H2O
8.3
GoTaq Master mix (2x)
10
Mồi VNP93-A-F1 (20 µM)
0.3
Mồi VNP93-B-F1 (20 µM)
0.3
Mồi VNP93-A-R1 (20 µM)
0.3
Mồi VNP93-B-R1 (20 µM)
0.3
DNA
0.5
Tổng thể tích
20 https://drivers.vn/
0.3
DNA
0.5
Tổng thể tích
20
Quy trình thực hiện phản ứng PCR
94
o
C 4 phút x 1
94
o
C 35 giây
54
o
C 35 giây x 35
72
o
C 35 giây
72
o
C 4 phút x 1
- Chu trình phản ứng Multiplex – PCR kiểm tra DNA của begomovirus, sử dụng
cặp mồi đặc hiệu VNP93-A-F1/B-F1 và VNP93-A-F1/B-F1:
Multiplex – PCR : là phản ứng sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi để khuếch
đại nhiều đoạn DNA trong cùng một phản ứng PCR. Phương pháp này được thử
nghiệm thành công vào năm 1988 và được áp dụng và nhiều công trình nghiên cứu.
Cho đến nay, vẫn chưa rõ nguyên tắc chung hay thành phần chuẩn nào cho việc tối
ưu hóa phản ứng multiplex – PCR. Do vậy, ứng với mỗi điều kiện phản ứng, cần
phải điều chỉnh cho phù hợp với mục đích mong muốn.
Thành phần
Thể tích (µl)
H2O
8.3
GoTaq Master mix (2x)
10
Mồi VNP93-A-F1 (20 µM)
0.3
Mồi VNP93-B-F1 (20 µM)
0.3
Mồi VNP93-A-R1 (20 µM)
0.3
Mồi VNP93-B-R1 (20 µM)
0.3
DNA
0.5
Tổng thể tích
20 https://drivers.vn/
3.5.4.2 Điện di sản phẩm PCR.
- Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1 % được chuẩn bị bằng đệm TAE
và chứa 0.5 mg/mL ethidium bromide.
- Gel được chạy trên thiết bị điện di là Mini-Sub Cell (Biorad) với đệm TAE ở
điện thế 100V trong 30 - 40 phút.
- Bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại và được chụp lại bằng máy chụp
chuyên dụng hoặc máy ảnh kỹ thuật số.
3.5.5 Tinh chiết sản phẩm điện di
Sử dụng bộ kit tinh chiết của BioNeer - Accuprep Gel Purification Kit. Các
bước tinh chiết thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
3.5.6 Xây dựng cấu trúc xâm nhiễm
- Mở vector pCAMBIA2300 bằng BamHI
DNA plasmid 10μL
BamHI (10u/ μL) 2μL
10X React 3 2 μL
H2O hấp vô trùng 6μL
Ủ ở 37
0
C trong một giờ sau đó điện di và tinh chiết DNA plasmid từ gel
agarose bằng kit Accuprep gel purification kit (Bioneer)
Dephosphoryl hóa vector pCAMBIA-2300sau khi được mở vòng bằng
BamHI
pCAMBIA (cắt bằng BamHI, purified) 30 μL
10X Alkaline Phosphatase buffer (Roche) 4 μL
Alkaline Phosphatase (Roche) 6 μL
Sau đó ủ ở 37
0
C trong một giờ và tinh sạch bằng kit Purelink PCR
purification kit (Invitrogen) https://drivers.vn/
- Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1 % được chuẩn bị bằng đệm TAE
và chứa 0.5 mg/mL ethidium bromide.
- Gel được chạy trên thiết bị điện di là Mini-Sub Cell (Biorad) với đệm TAE ở
điện thế 100V trong 30 - 40 phút.
- Bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại và được chụp lại bằng máy chụp
chuyên dụng hoặc máy ảnh kỹ thuật số.
3.5.5 Tinh chiết sản phẩm điện di
Sử dụng bộ kit tinh chiết của BioNeer - Accuprep Gel Purification Kit. Các
bước tinh chiết thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
3.5.6 Xây dựng cấu trúc xâm nhiễm
- Mở vector pCAMBIA2300 bằng BamHI
DNA plasmid 10μL
BamHI (10u/ μL) 2μL
10X React 3 2 μL
H2O hấp vô trùng 6μL
Ủ ở 37
0
C trong một giờ sau đó điện di và tinh chiết DNA plasmid từ gel
agarose bằng kit Accuprep gel purification kit (Bioneer)
Dephosphoryl hóa vector pCAMBIA-2300sau khi được mở vòng bằng
BamHI
pCAMBIA (cắt bằng BamHI, purified) 30 μL
10X Alkaline Phosphatase buffer (Roche) 4 μL
Alkaline Phosphatase (Roche) 6 μL
Sau đó ủ ở 37
0
C trong một giờ và tinh sạch bằng kit Purelink PCR
purification kit (Invitrogen) https://drivers.vn/
Nối vector pCAMBIA (dephosphorylated, purified) and Dimeric (gel
purified)
pCAMBIA-2300 3μL
Dimer 13 μL
T4 ligation buffer 2 μL
T4 ligase (5U/ μL) 2 μL
Sau đó ủ ở 22
o
C trong 2h và để ở 4
o
C qua đêm
3.5.7 Chuẩn bị E.coli chủng X1 Blue khả biến
Tế bào E.coli X1Blue khả biến được chuẩn bị theo Inoue và cộng sự (1990).
Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn trong 5 ml môi trường LB lỏng, để qua đêm ở
nhiệt độ 37
o
C trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm).
Bước 2: Chuyển 2 ml dịch vi khuẩn ở bước 1 sang 50 ml môi trường LB
lỏng đựng trong lọ định mức ở 500 ml. Ủ trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm / 37
0
C) cho tới khi mật độ quang OD600 đạt 0,5 - 1,0.
Bước 3: Làm lạnh vi khuẩn bằng để bình trong đá khoảng 5 phút. Cho toàn
bộ dung dịch chứa vi khuẩn ly tâm với tốc độ 3000 g trong vòng 5 phút ở 4
0
C.
Bước 4: Loại bỏ dịch trên tủa (dùng pipes hút hết dịch trên tủa). Hoà cặn vi
khuẩn với 80 ml dung dịch TB đã được làm lạnh trước trong đá, bổ xung thêm
DMSO cho đến khi đạt nồng độ 7%. Sau đó phân phối cứ 0,1 ml dịch vi khuẩn thì
cho vào 1 tube Eppendorf loại 1,5 ml được làm lạnh trước trong đá. Hoá đông vi
khuẩn khả biến và bảo quản trong tủ lạnh sâu – 80
0
C.
3.5.8 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn E.coli khả biến bằng
phương pháp sốc nhiệt
- Đầu tiên lấy tube chứa XL1–Blue compentent cell (ở tủ -80
o
C ) cho lên khay đá
vụn để tan đông trong 20 – 30 phút (để trong box cấy).
- Cho máy lắc vào trong tủ ầm và đặt nhiệt độ 37
o
C, chuẩn bị 4 đĩa LB đặc. https://drivers.vn/
purified)
pCAMBIA-2300 3μL
Dimer 13 μL
T4 ligation buffer 2 μL
T4 ligase (5U/ μL) 2 μL
Sau đó ủ ở 22
o
C trong 2h và để ở 4
o
C qua đêm
3.5.7 Chuẩn bị E.coli chủng X1 Blue khả biến
Tế bào E.coli X1Blue khả biến được chuẩn bị theo Inoue và cộng sự (1990).
Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn trong 5 ml môi trường LB lỏng, để qua đêm ở
nhiệt độ 37
o
C trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm).
Bước 2: Chuyển 2 ml dịch vi khuẩn ở bước 1 sang 50 ml môi trường LB
lỏng đựng trong lọ định mức ở 500 ml. Ủ trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm / 37
0
C) cho tới khi mật độ quang OD600 đạt 0,5 - 1,0.
Bước 3: Làm lạnh vi khuẩn bằng để bình trong đá khoảng 5 phút. Cho toàn
bộ dung dịch chứa vi khuẩn ly tâm với tốc độ 3000 g trong vòng 5 phút ở 4
0
C.
Bước 4: Loại bỏ dịch trên tủa (dùng pipes hút hết dịch trên tủa). Hoà cặn vi
khuẩn với 80 ml dung dịch TB đã được làm lạnh trước trong đá, bổ xung thêm
DMSO cho đến khi đạt nồng độ 7%. Sau đó phân phối cứ 0,1 ml dịch vi khuẩn thì
cho vào 1 tube Eppendorf loại 1,5 ml được làm lạnh trước trong đá. Hoá đông vi
khuẩn khả biến và bảo quản trong tủ lạnh sâu – 80
0
C.
3.5.8 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn E.coli khả biến bằng
phương pháp sốc nhiệt
- Đầu tiên lấy tube chứa XL1–Blue compentent cell (ở tủ -80
o
C ) cho lên khay đá
vụn để tan đông trong 20 – 30 phút (để trong box cấy).
- Cho máy lắc vào trong tủ ầm và đặt nhiệt độ 37
o
C, chuẩn bị 4 đĩa LB đặc. https://drivers.vn/
- Cho 150 μL vi khuẩn dã đông vào tube 1.5 ml đã đặt trên đá trước đó. Cho 10
μL sản phẩm nối vào tube chứa vi khuẩn, ủ trên đá ít nhất 30 phút.
- Sốc nhiệt ở 42
o
C trong 1 phút rồi để trên đá lạnh 5 phút, spin nhẹ.
- Thêm 600 μL SOC vào mỗi tube, nuôi lắc 1 giờ ở 37
o
C
- Ly tâm 3-5 phút, loại bỏ dịch trên tủa để lại 100 μL. Cấy dịch vi khuẩn trên đĩa
LB agar + Kanamycin + Tetracylin .
- Nuôi qua đêm ở 37
o
C trong tủ binder, kiểm tra số khuẩn lạc mọc.
3.5.9 Phản ứng PCR kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc
Nuôi cấy từng khuẩn lạc mọc trong 3 ml môi trường LB lỏng (chứa hai loại
kháng sinh) ở 37
o
C, lắc 250 vòng/ phút qua đêm. Ly tâm dịch vi khuẩn sau đó rửa
cặn vi khuẩn hai lần bằng nước vô trùng. Hút 50 μL nước vô trùng và hòa tan cặn
vi khuẩn và để trong tủ -20
o
C ít nhất 30 phút. Lấy tube ra thả vào nước sôi 10 phút,
đảo đều tube và đem dịch vi khuẩn đi chạy PCR.
3.5.10 Tinh chiết plasmid
DNA plasmid được chiết từ tế vi khuẩn theo kỹ thuật chiết plasmid
(miniprep) của (Sambrook, Fritsch et al., 1989).
- Bước 1: Lấy 1,5 ml dịch vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường LB lỏng chứa
kháng sinh cho vào mỗi tube Eppendorf loại 1,5 ml.
- Bước 2: Ly tâm 3 phút ở máy ly tâm để bàn để lắng cặn vi khuẩn. Loại bỏ dịch
trong để nguyên cặn trong tube.
- Bước 3. Cho tiếp 1,5 ml dịch vi khuẩn vào tube và lặp lại bước 2.
- Bước 4: Ly tâm 3 phút để lắng cặn vi khuẩn, loại bỏ dịch trong để nguyên cặn
trong tube. Dùng pipes hút hết dịch trên tủa. Để tube trên đá khoảng 3 phút.
- Bước 5: Cho 100 μl dung dịch I đã được để lạnh trên đá vào tube. Cho tiếp 2 μl
RNAse A (dung dịch gốc 10 mg/mL). Votex để hòa tan vi khuẩn.
- Bước 6: Cho 200 μl dung dịch II vào tube (cần kiểm tra xem SDS có bị kết tủa
không nếu có cần làm ấm dung dịch để hoà tan SDS). Ở bước này không cần
trộn tube và phải để tube trên đá và không được để dịch tan quá 2 phút vì plasmid https://drivers.vn/
μL sản phẩm nối vào tube chứa vi khuẩn, ủ trên đá ít nhất 30 phút.
- Sốc nhiệt ở 42
o
C trong 1 phút rồi để trên đá lạnh 5 phút, spin nhẹ.
- Thêm 600 μL SOC vào mỗi tube, nuôi lắc 1 giờ ở 37
o
C
- Ly tâm 3-5 phút, loại bỏ dịch trên tủa để lại 100 μL. Cấy dịch vi khuẩn trên đĩa
LB agar + Kanamycin + Tetracylin .
- Nuôi qua đêm ở 37
o
C trong tủ binder, kiểm tra số khuẩn lạc mọc.
3.5.9 Phản ứng PCR kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc
Nuôi cấy từng khuẩn lạc mọc trong 3 ml môi trường LB lỏng (chứa hai loại
kháng sinh) ở 37
o
C, lắc 250 vòng/ phút qua đêm. Ly tâm dịch vi khuẩn sau đó rửa
cặn vi khuẩn hai lần bằng nước vô trùng. Hút 50 μL nước vô trùng và hòa tan cặn
vi khuẩn và để trong tủ -20
o
C ít nhất 30 phút. Lấy tube ra thả vào nước sôi 10 phút,
đảo đều tube và đem dịch vi khuẩn đi chạy PCR.
3.5.10 Tinh chiết plasmid
DNA plasmid được chiết từ tế vi khuẩn theo kỹ thuật chiết plasmid
(miniprep) của (Sambrook, Fritsch et al., 1989).
- Bước 1: Lấy 1,5 ml dịch vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường LB lỏng chứa
kháng sinh cho vào mỗi tube Eppendorf loại 1,5 ml.
- Bước 2: Ly tâm 3 phút ở máy ly tâm để bàn để lắng cặn vi khuẩn. Loại bỏ dịch
trong để nguyên cặn trong tube.
- Bước 3. Cho tiếp 1,5 ml dịch vi khuẩn vào tube và lặp lại bước 2.
- Bước 4: Ly tâm 3 phút để lắng cặn vi khuẩn, loại bỏ dịch trong để nguyên cặn
trong tube. Dùng pipes hút hết dịch trên tủa. Để tube trên đá khoảng 3 phút.
- Bước 5: Cho 100 μl dung dịch I đã được để lạnh trên đá vào tube. Cho tiếp 2 μl
RNAse A (dung dịch gốc 10 mg/mL). Votex để hòa tan vi khuẩn.
- Bước 6: Cho 200 μl dung dịch II vào tube (cần kiểm tra xem SDS có bị kết tủa
không nếu có cần làm ấm dung dịch để hoà tan SDS). Ở bước này không cần
trộn tube và phải để tube trên đá và không được để dịch tan quá 2 phút vì plasmid https://drivers.vn/
dễ bị biến tính ở nồng độ kiềm cao. Bước này là bước phá huỷ vách tế bào giải
phóng DNA genomvà DNA plasmid nên dịch tan trở nên rất nhầy.
- Bước 7: Cho 150 μl dung dịch III đãđể lạnh trước trên đá vào tube, trộnđều bằng
lắc tube nhiều lần. Đây là bước trung hoà, toàn bộ protein và DNA genom (vì
có kích thước lớn) sẽ bị kết tủa còn DNA plasmid (vì có kích thước nhỏ) nên
vẫn hoà tan trong dung dịch.Để tube trên đá khoảng 3 phút.
- Bước 8: Ly tâm dung dịch 5 phútđể kết tủa prtein và DNA genomic. Chuyển
dịch trên tủa (khoảng 400 μl) có chứa DNA plasmid sang một tube mới, loại bỏ
tube cũ và cặn bên trong tube.
- Bước 9: Cho một thể tích tương đương (khoảng 400 μl) isopropanol vào tube.
Trộnđều bằng đảo tube nhiều lần.Để tube ở nhiệtđộ phòng khoảng 5 phút.Trong
bước nàyisopropanol sẽ làm kết tủa DNA plasmid.
- Bước 10: Ly tâm 5 phútđể kết tủa DNA plasmid. Loại bỏ dịch trong giữ lại cặn
DNA plasmid. Ly tâm nhanh để lắng tất cả dịch bám trên thành tube xuống dưới
và dùng pipes hút hết dịch
- Bước 11: Cho 500 μl cồn 70 % vào tube để rửa cặn, loại bỏ cồn (trong bước này
rửa cồn càng nhiều lần càng tốt). Để loại bỏ hết cồn ra khỏi tube, thì sau khi đổ
hết cồn ra ly tâm ngắn khoảng vài giây để lắng tất cả cồn bám trên thành tube
xuống dưới và dùng pipes hút hết cồn.
- Bước 12: Để khô cặn DNA trong không khí khoảng 30 phút.
- Bước 13: Hoà cặn DNA plasmid với 50 μl dd H2O vô trùng hoặc đệm TE (pH
= 8). Dịch DNA bây giờ có thể được dùng cho các phản ứng enzyme hoặc bảo
quản ở -20
0
C.
3.5.11 Chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens khả biến (competent cells)
Tế bào A. tumefaciens khả biến được chuẩn bị theo Inoue và cộng sự (1990).
Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn trong 5 ml môi trường LB lỏng, để qua đêm ở
nhiệt độ 28
o
C trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm). https://drivers.vn/
phóng DNA genomvà DNA plasmid nên dịch tan trở nên rất nhầy.
- Bước 7: Cho 150 μl dung dịch III đãđể lạnh trước trên đá vào tube, trộnđều bằng
lắc tube nhiều lần. Đây là bước trung hoà, toàn bộ protein và DNA genom (vì
có kích thước lớn) sẽ bị kết tủa còn DNA plasmid (vì có kích thước nhỏ) nên
vẫn hoà tan trong dung dịch.Để tube trên đá khoảng 3 phút.
- Bước 8: Ly tâm dung dịch 5 phútđể kết tủa prtein và DNA genomic. Chuyển
dịch trên tủa (khoảng 400 μl) có chứa DNA plasmid sang một tube mới, loại bỏ
tube cũ và cặn bên trong tube.
- Bước 9: Cho một thể tích tương đương (khoảng 400 μl) isopropanol vào tube.
Trộnđều bằng đảo tube nhiều lần.Để tube ở nhiệtđộ phòng khoảng 5 phút.Trong
bước nàyisopropanol sẽ làm kết tủa DNA plasmid.
- Bước 10: Ly tâm 5 phútđể kết tủa DNA plasmid. Loại bỏ dịch trong giữ lại cặn
DNA plasmid. Ly tâm nhanh để lắng tất cả dịch bám trên thành tube xuống dưới
và dùng pipes hút hết dịch
- Bước 11: Cho 500 μl cồn 70 % vào tube để rửa cặn, loại bỏ cồn (trong bước này
rửa cồn càng nhiều lần càng tốt). Để loại bỏ hết cồn ra khỏi tube, thì sau khi đổ
hết cồn ra ly tâm ngắn khoảng vài giây để lắng tất cả cồn bám trên thành tube
xuống dưới và dùng pipes hút hết cồn.
- Bước 12: Để khô cặn DNA trong không khí khoảng 30 phút.
- Bước 13: Hoà cặn DNA plasmid với 50 μl dd H2O vô trùng hoặc đệm TE (pH
= 8). Dịch DNA bây giờ có thể được dùng cho các phản ứng enzyme hoặc bảo
quản ở -20
0
C.
3.5.11 Chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens khả biến (competent cells)
Tế bào A. tumefaciens khả biến được chuẩn bị theo Inoue và cộng sự (1990).
Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn trong 5 ml môi trường LB lỏng, để qua đêm ở
nhiệt độ 28
o
C trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm). https://drivers.vn/
Bước 2: Chuyển 2 ml dịch vi khuẩn ở bước 1 sang 50 ml môi trường LB
lỏng đựng trong lọ định mức ở 500 ml. Ủ trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm / 28
o
C)
cho tới khi mật độ quang OD600 đạt 0,5 - 1,0.
Bước 3: Làm lạnh vi khuẩn bằng để bình trong đá khoảng 5 phút. Cho toàn
bộ dung dịch chứa vi khuẩn ly tâm với tốc độ 3000 g trong vòng 5 phút ở 4
o
C.
Bước 4: Loại bỏ dịch trên tủa (dùng pipes hút hết dịch trên tủa). Hoà cặn vi
khuẩn với 1 ml dung dịch CaCl2 20 mM đã được làm lạnh trước trong đá. Sau đó
phân phối cứ 0,1 ml dịch vi khuẩn thì cho vào 1 tube Eppendorf loại 1,5 ml được
làm lạnh trước trong đá. Hoá đông vi khuẩn khả biến và bảo quản trong tủ lạnh sâu
– 80
o
C.
3.5.12 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens khả
biến
Các cấu trúc xâm nhiễm vừa được thiết kế được biến nạp vào tế bào vi khuẩn
khả biến theo phương pháp đông tan (Hofgen and Willmitzer, 1988). Trong điều
kiện phòng thí nghiệm, bước đông tan được thưc hiện với tủ lạnh sâu -80
o
C thay
vì bằng nitơ lỏng. Các bước cụ thể là:
- Bước 1: Lấy tế bào A. tumefaciens từ tủ lạnh -80
o
C. Để vi khuẩn tan đông trong
đá.
- Bước 2: Lấy 10 μl dịch DNA của mỗi cấu trúc cho vào tube tế bào vi khuẩn và
trộn đều.
- Bước 3: Để hỗn hợp dịch vi khuẩn và DNA vào tủ lạnh sâu – 80
o
C trong vòng
15 phút.
- Bước 4: Để hỗn hợp dịch vi khuẩn và DNA vào block nhiệt 37
o
C trong vòng 5
phút.
- Bước 5: Cho dịch vi khuẩn đã được transfomation vào ống nghiệm chứa 1 ml
môi trường LB lỏng, ủ ống nghiệm trong tủ ấm có lắc ở 28
o
C trong 1 giờ.
- Bước 6: Chuyển dịch vi khuẩn vào tube 1,5 ml.
- Bước 7: Ly tâm trong 3 phút, lấy phần dịch trên tủa, loại cặn, sau đó cho tiếp
100 μl môi trường LB lỏng. https://drivers.vn/
lỏng đựng trong lọ định mức ở 500 ml. Ủ trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm / 28
o
C)
cho tới khi mật độ quang OD600 đạt 0,5 - 1,0.
Bước 3: Làm lạnh vi khuẩn bằng để bình trong đá khoảng 5 phút. Cho toàn
bộ dung dịch chứa vi khuẩn ly tâm với tốc độ 3000 g trong vòng 5 phút ở 4
o
C.
Bước 4: Loại bỏ dịch trên tủa (dùng pipes hút hết dịch trên tủa). Hoà cặn vi
khuẩn với 1 ml dung dịch CaCl2 20 mM đã được làm lạnh trước trong đá. Sau đó
phân phối cứ 0,1 ml dịch vi khuẩn thì cho vào 1 tube Eppendorf loại 1,5 ml được
làm lạnh trước trong đá. Hoá đông vi khuẩn khả biến và bảo quản trong tủ lạnh sâu
– 80
o
C.
3.5.12 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens khả
biến
Các cấu trúc xâm nhiễm vừa được thiết kế được biến nạp vào tế bào vi khuẩn
khả biến theo phương pháp đông tan (Hofgen and Willmitzer, 1988). Trong điều
kiện phòng thí nghiệm, bước đông tan được thưc hiện với tủ lạnh sâu -80
o
C thay
vì bằng nitơ lỏng. Các bước cụ thể là:
- Bước 1: Lấy tế bào A. tumefaciens từ tủ lạnh -80
o
C. Để vi khuẩn tan đông trong
đá.
- Bước 2: Lấy 10 μl dịch DNA của mỗi cấu trúc cho vào tube tế bào vi khuẩn và
trộn đều.
- Bước 3: Để hỗn hợp dịch vi khuẩn và DNA vào tủ lạnh sâu – 80
o
C trong vòng
15 phút.
- Bước 4: Để hỗn hợp dịch vi khuẩn và DNA vào block nhiệt 37
o
C trong vòng 5
phút.
- Bước 5: Cho dịch vi khuẩn đã được transfomation vào ống nghiệm chứa 1 ml
môi trường LB lỏng, ủ ống nghiệm trong tủ ấm có lắc ở 28
o
C trong 1 giờ.
- Bước 6: Chuyển dịch vi khuẩn vào tube 1,5 ml.
- Bước 7: Ly tâm trong 3 phút, lấy phần dịch trên tủa, loại cặn, sau đó cho tiếp
100 μl môi trường LB lỏng. https://drivers.vn/
- Bước 8: Dịch vi khuẩn ở bước 8 được cấy trên đĩa môi trường LB - agar có 3
loại kháng sinh (Streptomicin 200 μg/mL, rifampicin 34 μg/mL và kanamycin
100 μg/mL).
- Bước 9: Các đĩa petri được ủ ở 28
o
C trong vòng 2 ngày. Kiểm tra sự hình thành
khuẩn lạc
- Bước 10: Dùng tăm nhọn đã được hấp khử trùng lấy một ít vi khuẩn ở mỗi
khuẩn lạc rồi thả vào trong ống nghiệm chứa 4 mL môi trường LB lỏng chứa 3
kháng sinh ở trên.
- Bước 11: Các ống nghiệm được ủ 24 giờ trong tủ ấm có lắc (200 rpm / 28
o
C).
- Bước 12: Kiểm tra đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn trong môi trường LB lỏng
và kiểm tra sự có mặt của cấu trúc xâm nhiễm trong vi khuẩn bằng PCR sau khi
chiết DNA plasmid
3.5.13 Xác định trình tự gen và xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng
Phản ứng sequence được chúng tôi gửi sang Macrogen (Hàn Quốc) để tiến
hành giải trình tự các mẫu.Sử dụng 5µl sản phẩm cộng với 5µl mồi.
Kết quả giải trình tự gen được phân tích trên máy tính bằng các phần mềm:
Chương trình BLAST ( NCBI ), BioEdit 7.0.9, DNAstar 7.1 (Lasergene), Vecter
NTI Advance 11.5 (Invitrogene), ClustalX 2.0 và Mega 4.0., Sequencing Analysis
5.2, Seqscape 2.5 và so sánh với trình tự của đoạn DNA với trình tự chuẩn.
3.5.14 Phản ứng PCR kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc
Nuôi cấy từng khuẩn lạc mọc trong 3 ml môi trường LB lỏng (chứa hai loại
kháng sinh) ở 37
o
C, lắc 250 vòng/ phút qua đêm. Ly tâm dịch vi khuẩn sau đó rửa
cặn vi khuẩn hai lần bằng nước vô trùng. Hút 50 μL nước vô trùng và hòa tan cặn
vi khuẩn và để trong tủ -20
o
C ít nhất 30 phút. Lấy tube ra thả vào nước sôi 10 phút,
đảo đều tube và đem dịch vi khuẩn đi chạy PCR. https://drivers.vn/
loại kháng sinh (Streptomicin 200 μg/mL, rifampicin 34 μg/mL và kanamycin
100 μg/mL).
- Bước 9: Các đĩa petri được ủ ở 28
o
C trong vòng 2 ngày. Kiểm tra sự hình thành
khuẩn lạc
- Bước 10: Dùng tăm nhọn đã được hấp khử trùng lấy một ít vi khuẩn ở mỗi
khuẩn lạc rồi thả vào trong ống nghiệm chứa 4 mL môi trường LB lỏng chứa 3
kháng sinh ở trên.
- Bước 11: Các ống nghiệm được ủ 24 giờ trong tủ ấm có lắc (200 rpm / 28
o
C).
- Bước 12: Kiểm tra đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn trong môi trường LB lỏng
và kiểm tra sự có mặt của cấu trúc xâm nhiễm trong vi khuẩn bằng PCR sau khi
chiết DNA plasmid
3.5.13 Xác định trình tự gen và xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng
Phản ứng sequence được chúng tôi gửi sang Macrogen (Hàn Quốc) để tiến
hành giải trình tự các mẫu.Sử dụng 5µl sản phẩm cộng với 5µl mồi.
Kết quả giải trình tự gen được phân tích trên máy tính bằng các phần mềm:
Chương trình BLAST ( NCBI ), BioEdit 7.0.9, DNAstar 7.1 (Lasergene), Vecter
NTI Advance 11.5 (Invitrogene), ClustalX 2.0 và Mega 4.0., Sequencing Analysis
5.2, Seqscape 2.5 và so sánh với trình tự của đoạn DNA với trình tự chuẩn.
3.5.14 Phản ứng PCR kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc
Nuôi cấy từng khuẩn lạc mọc trong 3 ml môi trường LB lỏng (chứa hai loại
kháng sinh) ở 37
o
C, lắc 250 vòng/ phút qua đêm. Ly tâm dịch vi khuẩn sau đó rửa
cặn vi khuẩn hai lần bằng nước vô trùng. Hút 50 μL nước vô trùng và hòa tan cặn
vi khuẩn và để trong tủ -20
o
C ít nhất 30 phút. Lấy tube ra thả vào nước sôi 10 phút,
đảo đều tube và đem dịch vi khuẩn đi chạy PCR. https://drivers.vn/
3.5.15 Lây nhiễm nhân tạo sử dụng kỹ thuật agroinoculation
Sử dụng kỹ thuật tiêm trực tiếp dịch vi khuẩn vào cây (Kheyr-Pour,
Bendahmane et al., 1991, Navot, Pichersky et al., 1991). Các bước thực hiện như
sau:
Cấy lại 2 dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiễm trên đĩa môi trường LB
agar chứa 3 kháng sinh streptomicin 200 μg/mL, rifampicin 34 μg/mL và
kanamycin 100 μg/mL (cấy ria 1 chiều). Ủ đĩa ở 28°C trong 2 ngày.
Cấy truyền vi khuẩn sang nuôi cấy trên 250 ml môi trường LB lỏng chứa 3
kháng sinh (streptomicin 200 μg/mL, rifampicin 34 μg/mL và kanamycin 100
μg/mL) trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm / 28°C/ 1 ngày). Đảm bảo vi khuẩn ở pha
sinh trưởng mạnh (pha log) bằng đo OD ở 600 nm (=0.6)
Ly tâm dịch vi khuẩn (3000 G/ 5 phút ) rồi hòa cặn vi khuẩn với 5 ml đêm
MgCl2 10 mM.
Sử dụng bơm xylanh Hamilton P600 nối với 1 xylanh y tế loại 1 mL để tiêm
dịch vi khuẩn vào chồi và 3 nách lá tiếp theo. Mỗi vị trí tiêm 10 µl. Trong các công
thức lây nhiễm hỗn hợp, hai dòng vi khuẩn sẽ được trộn với thể tích tương đương.
Điều kiện nhiệt độ trong quá trình chuẩn bị dịch vi khuẩn lây nhiễm, lây
nhiễm và trong vòng 2 ngày sau lây nhiễm phải duy trì <30
o
C.
Cây lây nhiễm là cây con ở giai đoạn 3-4 lá thật, được bảo quản trong điều
kiện cách ly bọ phấn và được chăm sóc trong toàn bộ thời gian thí nghiệm.
Chỉ tiêu đánhh giá từng cây:
+ Triệu chứng biểu hiện sau lây 1, 2, 3, 4 tuần.
+ Kiểm tra PCR phát hiện virus sau lây 4 tuần.
Bảng 3.6. Thí nghiệm lây nhiễm được thực hiện với các công thức
STT CÔNG THỨC ĐỐI TƯỢNG
CT1
Tiêm dòng vi khuẩn có chứa cấu trúc xâm
nhiễm của VNP93-5-4 (DNA-A)
Cà chua
CT2
Tiêm dòng vi khuẩn có chứa cấu trúc xâm
nhiễm của VNP93-5-4 (DNA-A) và
VNP93-5-8 (DNA-B)
Cà chua https://drivers.vn/
Sử dụng kỹ thuật tiêm trực tiếp dịch vi khuẩn vào cây (Kheyr-Pour,
Bendahmane et al., 1991, Navot, Pichersky et al., 1991). Các bước thực hiện như
sau:
Cấy lại 2 dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiễm trên đĩa môi trường LB
agar chứa 3 kháng sinh streptomicin 200 μg/mL, rifampicin 34 μg/mL và
kanamycin 100 μg/mL (cấy ria 1 chiều). Ủ đĩa ở 28°C trong 2 ngày.
Cấy truyền vi khuẩn sang nuôi cấy trên 250 ml môi trường LB lỏng chứa 3
kháng sinh (streptomicin 200 μg/mL, rifampicin 34 μg/mL và kanamycin 100
μg/mL) trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm / 28°C/ 1 ngày). Đảm bảo vi khuẩn ở pha
sinh trưởng mạnh (pha log) bằng đo OD ở 600 nm (=0.6)
Ly tâm dịch vi khuẩn (3000 G/ 5 phút ) rồi hòa cặn vi khuẩn với 5 ml đêm
MgCl2 10 mM.
Sử dụng bơm xylanh Hamilton P600 nối với 1 xylanh y tế loại 1 mL để tiêm
dịch vi khuẩn vào chồi và 3 nách lá tiếp theo. Mỗi vị trí tiêm 10 µl. Trong các công
thức lây nhiễm hỗn hợp, hai dòng vi khuẩn sẽ được trộn với thể tích tương đương.
Điều kiện nhiệt độ trong quá trình chuẩn bị dịch vi khuẩn lây nhiễm, lây
nhiễm và trong vòng 2 ngày sau lây nhiễm phải duy trì <30
o
C.
Cây lây nhiễm là cây con ở giai đoạn 3-4 lá thật, được bảo quản trong điều
kiện cách ly bọ phấn và được chăm sóc trong toàn bộ thời gian thí nghiệm.
Chỉ tiêu đánhh giá từng cây:
+ Triệu chứng biểu hiện sau lây 1, 2, 3, 4 tuần.
+ Kiểm tra PCR phát hiện virus sau lây 4 tuần.
Bảng 3.6. Thí nghiệm lây nhiễm được thực hiện với các công thức
STT CÔNG THỨC ĐỐI TƯỢNG
CT1
Tiêm dòng vi khuẩn có chứa cấu trúc xâm
nhiễm của VNP93-5-4 (DNA-A)
Cà chua
CT2
Tiêm dòng vi khuẩn có chứa cấu trúc xâm
nhiễm của VNP93-5-4 (DNA-A) và
VNP93-5-8 (DNA-B)
Cà chua https://drivers.vn/
CT3
Tiêm dòng vi khuẩn có chứa cấu trúc xâm
nhiễm của VNP93-5-4 (DNA-A)
ớt
CT4
Tiêm dòng vi khuẩn có chứa cấu trúc xâm
nhiễm của VNP93-5-4 (DNA-A) và
VNP93-5-8 (DNA-B)
ớt
CT5
Tiêm dòng vi khuẩn có chứa cấu trúc xâm
nhiễm của VNP93-5-4 (DNA-A)
Cây chỉ thị
CT6
Tiêm dòng vi khuẩn có chứa cấu trúc xâm
nhiễm của VNP93-5-4 (DNA-A) và
VNP93-5-8 (DNA-B)
Cây chỉ thị
CT7 Cây đối chứng không tiêm
Cà chua, ớt,
và cây chỉ thị
3.5.16 Đánh giá tính gây bệnh
- Dựa vào triệu chứng cây bị bệnh có lá cong xuống dưới vào phía bên trong. Về
sau, lá không có hình dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chóp lá lan vào giữa
gân; lá cuốn cong lên phía trên thành hình thuyền; lá non biến vàng mạnh, giòn
và nhỏ hẹp. Cuống lá có thể xoắn vặn. Cây lùn còi cọc, mọc nhiều cành nhánh
nhỏ, đốt thân ngắn.
- Dựa vào phản ứng PCR để phát hiện sự có mặt của virus
Các phản ứng PCR được thực hiện trong tube 0.5 mL với tổng thể tích phản
ứng 15 μL chứa 1.5 μL dung dịch đệm PCR X10 (Roche); 0.3 μL dNTPs (10mM
mỗi loại A, T, G, C, Roche); 0.3 μL mỗi loại mồi đặc hiệu xuôi dòng và ngược
dòng (đều đươc chuẩn bị ở nồng độ 20 μM); 0,2 μL Taq polymerase (Roche) và
0,5 μL khuôn DNA (DNA plasmid hoặc DNA chiết từ cây).
Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc.)
với điều kiện sau: khởi đầu biến tính ở 94
0
C trong 4 phút; tiếp theo là 35 chu trình
PCR (biến tính ở 94
0
C trong 35 giây, gắn mồi ở 52
0
C trong 35 giây và tổng hợp sợi
ở 72
0
C trong 1 phút). Phản ứng được kết thúc với 5 phút ở 72
0
C. Sản phẩm PCR
được điện di trên gel agarose 1% đươc chuẩn bị bằng đệm TAE X 0.5 và chứa 0.5
mg/mL ethidium bromide. Gel được chạy trên thiết bị điện di là Mini-Sub Cell
(Biorad) với đệm TAE 0.5X ở điện thế 100 V trong 25 - 30 phút. Bản gel được https://drivers.vn/
Tiêm dòng vi khuẩn có chứa cấu trúc xâm
nhiễm của VNP93-5-4 (DNA-A)
ớt
CT4
Tiêm dòng vi khuẩn có chứa cấu trúc xâm
nhiễm của VNP93-5-4 (DNA-A) và
VNP93-5-8 (DNA-B)
ớt
CT5
Tiêm dòng vi khuẩn có chứa cấu trúc xâm
nhiễm của VNP93-5-4 (DNA-A)
Cây chỉ thị
CT6
Tiêm dòng vi khuẩn có chứa cấu trúc xâm
nhiễm của VNP93-5-4 (DNA-A) và
VNP93-5-8 (DNA-B)
Cây chỉ thị
CT7 Cây đối chứng không tiêm
Cà chua, ớt,
và cây chỉ thị
3.5.16 Đánh giá tính gây bệnh
- Dựa vào triệu chứng cây bị bệnh có lá cong xuống dưới vào phía bên trong. Về
sau, lá không có hình dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chóp lá lan vào giữa
gân; lá cuốn cong lên phía trên thành hình thuyền; lá non biến vàng mạnh, giòn
và nhỏ hẹp. Cuống lá có thể xoắn vặn. Cây lùn còi cọc, mọc nhiều cành nhánh
nhỏ, đốt thân ngắn.
- Dựa vào phản ứng PCR để phát hiện sự có mặt của virus
Các phản ứng PCR được thực hiện trong tube 0.5 mL với tổng thể tích phản
ứng 15 μL chứa 1.5 μL dung dịch đệm PCR X10 (Roche); 0.3 μL dNTPs (10mM
mỗi loại A, T, G, C, Roche); 0.3 μL mỗi loại mồi đặc hiệu xuôi dòng và ngược
dòng (đều đươc chuẩn bị ở nồng độ 20 μM); 0,2 μL Taq polymerase (Roche) và
0,5 μL khuôn DNA (DNA plasmid hoặc DNA chiết từ cây).
Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc.)
với điều kiện sau: khởi đầu biến tính ở 94
0
C trong 4 phút; tiếp theo là 35 chu trình
PCR (biến tính ở 94
0
C trong 35 giây, gắn mồi ở 52
0
C trong 35 giây và tổng hợp sợi
ở 72
0
C trong 1 phút). Phản ứng được kết thúc với 5 phút ở 72
0
C. Sản phẩm PCR
được điện di trên gel agarose 1% đươc chuẩn bị bằng đệm TAE X 0.5 và chứa 0.5
mg/mL ethidium bromide. Gel được chạy trên thiết bị điện di là Mini-Sub Cell
(Biorad) với đệm TAE 0.5X ở điện thế 100 V trong 25 - 30 phút. Bản gel được https://drivers.vn/
kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại và được chup bằng phim Polaroid với máy ảnh
Polaroid Gel Cam (UK).
3.5.17 Lây nhiễm nhân tạo dùng bọ phấn
Bọ phấn sạch được nuôi trên cây bông trong lồng nuôi bọ phấn cách ly qua
ít nhất 5 thế hệ. Lây nhiễm được thực hiện dùng bọ phấn trưởng thành theo mô tả
của Pico et al (1998).
3.5.17.1 Chuẩn bị cây nguồn bệnh
Cây nguồn bệnh ban đầu là cà chua giống mẫn cảm (AVTO1080 hoặc HT7
hoặc Hồng Lan T20) đã được lây nhiễm bằng agroinoculation.
Cây nguồn bệnh là cà chua giống mẫn cảm (AVTO1080 hoặc HT7 hoặc
Hồng Lan T20) được lây nhiễm bằng bọ phấn từ cây nguồn bệnh cấp 1. Cây nguồn
bệnh được thay mới 3 tuần/lần bằng lây nhiễm bọ phấn. Duy trì 20 cây nguồn bệnh
ở trạng thái triệu chứng điển hình, sinh trưởng tốt. Tất cả cây nguồn bệnh được duy
trì trong lồng nuôi bọ phấn.
3.5.17.2 Chuẩn bị cây thí nghiệm
Hạt cây thí nghiệm được xử lý thuốc trừ bệnh (Daconil hoặc Mancozeb). Sau
khi xử lý, hạt được cho nảy mầm trước trong đĩa petri có lót giấy ẩm. Hạt nảy mầm
được trồng vào chậu nhựa chứa giá thể sạch. Cây lây nhiễm là cây con ở giai đoạn
3-4lá thật. Cây luôn được giữ trong điều kiện cách ly trong toàn bộ thời gian thí
nghiệm.
3.5.17.3 Lây nhiễm bằng bọ phấn
Các cây thí nghiệm được chụp bằng lồng cách ly (chế tạo từ chai coca nhựa
loại 1L).
Bọ phấn trưởng thành nuôi trên cây nguồn bệnh trong lồng cách ly bọ phấn được
chuyển sang cây thí nghiệm. Thả 10 bọ phấn /cây và cho bọ phấn chích hút trong
thời gian 2 ngày.
Sau khi lây nhiễm, tất cả cây thí nghiệm được xử lý bằng thuốc trừ côn trùng chích
hút. https://drivers.vn/
Polaroid Gel Cam (UK).
3.5.17 Lây nhiễm nhân tạo dùng bọ phấn
Bọ phấn sạch được nuôi trên cây bông trong lồng nuôi bọ phấn cách ly qua
ít nhất 5 thế hệ. Lây nhiễm được thực hiện dùng bọ phấn trưởng thành theo mô tả
của Pico et al (1998).
3.5.17.1 Chuẩn bị cây nguồn bệnh
Cây nguồn bệnh ban đầu là cà chua giống mẫn cảm (AVTO1080 hoặc HT7
hoặc Hồng Lan T20) đã được lây nhiễm bằng agroinoculation.
Cây nguồn bệnh là cà chua giống mẫn cảm (AVTO1080 hoặc HT7 hoặc
Hồng Lan T20) được lây nhiễm bằng bọ phấn từ cây nguồn bệnh cấp 1. Cây nguồn
bệnh được thay mới 3 tuần/lần bằng lây nhiễm bọ phấn. Duy trì 20 cây nguồn bệnh
ở trạng thái triệu chứng điển hình, sinh trưởng tốt. Tất cả cây nguồn bệnh được duy
trì trong lồng nuôi bọ phấn.
3.5.17.2 Chuẩn bị cây thí nghiệm
Hạt cây thí nghiệm được xử lý thuốc trừ bệnh (Daconil hoặc Mancozeb). Sau
khi xử lý, hạt được cho nảy mầm trước trong đĩa petri có lót giấy ẩm. Hạt nảy mầm
được trồng vào chậu nhựa chứa giá thể sạch. Cây lây nhiễm là cây con ở giai đoạn
3-4lá thật. Cây luôn được giữ trong điều kiện cách ly trong toàn bộ thời gian thí
nghiệm.
3.5.17.3 Lây nhiễm bằng bọ phấn
Các cây thí nghiệm được chụp bằng lồng cách ly (chế tạo từ chai coca nhựa
loại 1L).
Bọ phấn trưởng thành nuôi trên cây nguồn bệnh trong lồng cách ly bọ phấn được
chuyển sang cây thí nghiệm. Thả 10 bọ phấn /cây và cho bọ phấn chích hút trong
thời gian 2 ngày.
Sau khi lây nhiễm, tất cả cây thí nghiệm được xử lý bằng thuốc trừ côn trùng chích
hút. https://drivers.vn/
Cây lây nhiễm được để trong điều kiện cách ly, phun thuốc trừ côn trùng định kỳ 7
ngày/lần.
- Chỉ tiêu đánh giá cho từng cây thí nghiệm:
+ Số bọ phấn sống trên cây sau khi thả 1 ngày và 2 ngày (trước khi xử lý
thuốc).
+ Triệu chứng biểu hiện sau 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần và 4 tuần.
+ Phản ứng PCR (cho cả DNA-A và DNA-B) trên tất cả cây thí nghiệm.
3.5.18 Kiểm tra các mẫu bằng phản ứng ELISA
Việc áp dụng những thành tựu khoa học kĩ thuật hiện đại đã trở nên cần thiết
và hữu hiệu trong việc chuẩn đoán các bệnh nguy hiểm trên cây trồng. Một trong
những phương pháp hiệu quả, chính xác được áp dụng phổ biến trên thế giới là
phương pháp Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Ngày nay, nhiều
dạng khác nhau của ELISA đang được sử dụng thường xuyên. Trong điều kiện Việt
Nam hiện nay, phương pháp ELISA đặc biệt có ý nghĩa trong chuẩn đoán bệnh hại
cây trồng do vi sinh vật gây ra.
Năm 1969, khi Arrameas liên kết một kháng thể IgG với một Enzyme và
chứng minh rằng, kháng thể liên kết Enzyme này vừa duy trì tính đặc hiệu miễn
dịch của kháng thể vừa duy trì tính hoạt động của Enzyme.
Năm 1977, Clarck và Adams lần đầu tiên ứng dụng phương pháp ELISA để
chuẩn đoán các cây nhiễm bệnh virus thực vật.
Thông thường sự kết hợp giữa kháng nguyên kháng thể không thể nhận biết
được bằng mắt thường, kỹ thuật ELISA đã lợi dụng các đặc tính hấp phụ tự nhiên
của protein lên polyetylen để gắn kháng nguyên hoặc kháng thể lên giá rồi cho
kháng nguyên hoặc kháng thể tương ứng có đánh dấu enzyme vào tạo phản ứng.
Sau khi loại bỏ chất đánh dấu không kết hợp, cho thêm vào hỗn dịch chất đệm màu.
Nhờ hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng ôxy nguyên tử (O) từ H2O2 để
ôxy hóa chất hiện màu làm thay đổi màu của hỗn dịch. Như vậy kỹ thuật ELISA
gồm 3 thành phần tham gia phản ứng: kháng nguyên, kháng thể và chất hiện màu
qua hai bước: https://drivers.vn/
ngày/lần.
- Chỉ tiêu đánh giá cho từng cây thí nghiệm:
+ Số bọ phấn sống trên cây sau khi thả 1 ngày và 2 ngày (trước khi xử lý
thuốc).
+ Triệu chứng biểu hiện sau 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần và 4 tuần.
+ Phản ứng PCR (cho cả DNA-A và DNA-B) trên tất cả cây thí nghiệm.
3.5.18 Kiểm tra các mẫu bằng phản ứng ELISA
Việc áp dụng những thành tựu khoa học kĩ thuật hiện đại đã trở nên cần thiết
và hữu hiệu trong việc chuẩn đoán các bệnh nguy hiểm trên cây trồng. Một trong
những phương pháp hiệu quả, chính xác được áp dụng phổ biến trên thế giới là
phương pháp Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Ngày nay, nhiều
dạng khác nhau của ELISA đang được sử dụng thường xuyên. Trong điều kiện Việt
Nam hiện nay, phương pháp ELISA đặc biệt có ý nghĩa trong chuẩn đoán bệnh hại
cây trồng do vi sinh vật gây ra.
Năm 1969, khi Arrameas liên kết một kháng thể IgG với một Enzyme và
chứng minh rằng, kháng thể liên kết Enzyme này vừa duy trì tính đặc hiệu miễn
dịch của kháng thể vừa duy trì tính hoạt động của Enzyme.
Năm 1977, Clarck và Adams lần đầu tiên ứng dụng phương pháp ELISA để
chuẩn đoán các cây nhiễm bệnh virus thực vật.
Thông thường sự kết hợp giữa kháng nguyên kháng thể không thể nhận biết
được bằng mắt thường, kỹ thuật ELISA đã lợi dụng các đặc tính hấp phụ tự nhiên
của protein lên polyetylen để gắn kháng nguyên hoặc kháng thể lên giá rồi cho
kháng nguyên hoặc kháng thể tương ứng có đánh dấu enzyme vào tạo phản ứng.
Sau khi loại bỏ chất đánh dấu không kết hợp, cho thêm vào hỗn dịch chất đệm màu.
Nhờ hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng ôxy nguyên tử (O) từ H2O2 để
ôxy hóa chất hiện màu làm thay đổi màu của hỗn dịch. Như vậy kỹ thuật ELISA
gồm 3 thành phần tham gia phản ứng: kháng nguyên, kháng thể và chất hiện màu
qua hai bước: https://drivers.vn/
+ Phản ứng miễn dịch học: Sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể.
+ Phản ứng hóa học: Nhờ hoạt tính của enzyme để giải phóng ôxy nguyên
tử (O) và chính ôxy nguyên tử này (O) đã ôxy hóa chất chỉ thị màu. Chất chỉ thị
thay đổi màu đã chứng minh sự hiện diện của enzyme và đồng thời có sự kết hợp
giữa kháng nguyên và kháng thể.
Hiện nay, có hai phương pháp ELISA đang được ứng dụng rộng dãi là
phương pháp Double Antibody Sandwich (DAS – ELISA), phương pháp này gọi
là phương pháp ELISA trực tiếp. Phương pháp thứ hai là Indirect ELISA gọi là
phương pháp ELISA gián tiếp. Nhược điểm cơ bản của ELISA gián tiếp là bước
cố định kháng nguyên không có tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng gắn với
bề mặt đĩa, vì vậy trường hợp kháng thể (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các
protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của đĩa. DAS ELISA đã hạn
chế được nhược điểm trên. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp
DAS – ELISA.
Phương pháp DAS – ELISA được sử dụng dưới dạng kĩ thuật ELISA kẹp
kép kháng thể. DAS – ELISA được Clarck và Adams mô tả vào năm 1977, DAS –
ELISA trực tiếp sử dụng kháng thể đặc hiệu virus để vừa bẫy virus vừa phát hiện
virus đã bẫy được (kháng thể liên kết men sẽ tập hợp đặc hiệu với virus được bẫy).
Có các bước sau:
Phương pháp kiểm tra virus bằng ELISA trực tiếp dựa theo tài liệu mô tả của
(Green, 1991) và Vũ Triệu Mân (2003), có các bước sau:
Bước 1: Cố định IgG đặc hiệu virus vào bản Elisa (Ủ kháng thể)
- Hòa tan IgG vào dung dịch Coating buffer với tỷ lệ 1µl/ 1ml dung dịch Coating
buffer.
- Cho 100 µl dung dịch IgG hòa tan ở trên vào mỗi giếng của bản Elisa và đậy
nắp lại.
- Gói bản Elisa trong tờ khăn giấy có thấm nước để giữ ẩm, gói kín lại trong túi
nilon và ủ ở 37
o
C trong 4 giờ hoặc ủ ở 4
o
C qua một đêm. https://drivers.vn/
+ Phản ứng hóa học: Nhờ hoạt tính của enzyme để giải phóng ôxy nguyên
tử (O) và chính ôxy nguyên tử này (O) đã ôxy hóa chất chỉ thị màu. Chất chỉ thị
thay đổi màu đã chứng minh sự hiện diện của enzyme và đồng thời có sự kết hợp
giữa kháng nguyên và kháng thể.
Hiện nay, có hai phương pháp ELISA đang được ứng dụng rộng dãi là
phương pháp Double Antibody Sandwich (DAS – ELISA), phương pháp này gọi
là phương pháp ELISA trực tiếp. Phương pháp thứ hai là Indirect ELISA gọi là
phương pháp ELISA gián tiếp. Nhược điểm cơ bản của ELISA gián tiếp là bước
cố định kháng nguyên không có tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng gắn với
bề mặt đĩa, vì vậy trường hợp kháng thể (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các
protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của đĩa. DAS ELISA đã hạn
chế được nhược điểm trên. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp
DAS – ELISA.
Phương pháp DAS – ELISA được sử dụng dưới dạng kĩ thuật ELISA kẹp
kép kháng thể. DAS – ELISA được Clarck và Adams mô tả vào năm 1977, DAS –
ELISA trực tiếp sử dụng kháng thể đặc hiệu virus để vừa bẫy virus vừa phát hiện
virus đã bẫy được (kháng thể liên kết men sẽ tập hợp đặc hiệu với virus được bẫy).
Có các bước sau:
Phương pháp kiểm tra virus bằng ELISA trực tiếp dựa theo tài liệu mô tả của
(Green, 1991) và Vũ Triệu Mân (2003), có các bước sau:
Bước 1: Cố định IgG đặc hiệu virus vào bản Elisa (Ủ kháng thể)
- Hòa tan IgG vào dung dịch Coating buffer với tỷ lệ 1µl/ 1ml dung dịch Coating
buffer.
- Cho 100 µl dung dịch IgG hòa tan ở trên vào mỗi giếng của bản Elisa và đậy
nắp lại.
- Gói bản Elisa trong tờ khăn giấy có thấm nước để giữ ẩm, gói kín lại trong túi
nilon và ủ ở 37
o
C trong 4 giờ hoặc ủ ở 4
o
C qua một đêm. https://drivers.vn/
- Sau khi ủ, đem bản ELISA đi rửa (trước khi rửa vảy mạnh bản ELISA để loại
hết nước ở trong bản ELISA) 3 lần bằng đệm PBS – T (Phosphate buffer saline-
Tween), mỗi lần cách nhau 3 – 4 phút. Mỗi lần rửa bản ELISA đều vảy mạnh
để loại hết đệm PBS – T ra khỏi các giếng và úp ngược trên khăn thấm, sau đó
mới tiến hành nhỏ đệm PBS – T mới vào để rửa tiếp.
Bước 2: Tạo dung dịch mẫu và Cố định dịch cây vào bản Elisa
Dùng kéo cắt nhuyễn khoảng 0.1g mẫu lá cho vào cối sứ (hoặc ống
eppendorf) nghiền thật nhuyễn trong dung dịch nitơ lỏng, thêm vào 1000 µl dung
dịch 1X PBS-T. Dịch mẫu được cho vào mỗi giếng là 100 µl/giếng.
- Gói bản Elisa trong tờ khăn giấy có thấm nước để giữ ẩm, và bọc kín lại trong
túi nilon. Sau đó ủ ở 37
o
C trong 4 giờ hoặc ủ ở 4
o
C qua một đêm.
- Sau khi ủ, bản Elisa được tiếp tục rửa bằng dung dịch đệm rửa 1X PBS-T như
ở bước 1.
Bước 3: Cố định IgG liên kết enzyme vào bản Elisa
- Hòa tan IgG liên kết Biotin và Avidin liên kết alkaline phosphatase trong dung
dịch 1X PBS-T với tỷ lệ: 1µl IgG-Biotin /1µl avidin-alkaline phosphatase/1ml
PBS –T.
- Cho dung dịch vừa hòa tan vào các giếng của bản Elisa với lượng 100 µl/giếng.
Gói bản Elisa trong tờ khăn giấy có thấm nước để giữ ẩm, gói kín lại trong túi
nilon, tiếp tục ủ ở 37
o
C trong 4 giờ hoặc ủ ở 4
o
C qua một đêm và rửa bản Elisa
bằng dung dịch đệm rửa 1X PBS-T như ở bước 1.
Bước 4: Cố định chất nền và đánh giá kết quả
- Hòa tan chất nền (Phosphate substrate) với dung dịch đệm Diethanolamine (
Subtrate buffer) theo tỷ lệ 1mg/ 1ml (tương ứng : 4 viên Phosphatase subtrate +
20 ml dung dịch S. buffer). Cho vào mỗi giếng của bản Elisa 100 µl dung dịch
vừa hoà tan.
- Ủ bản Elisa ở nhiệt độ phòng sau 20 phút, sau đó đọc kết quả bằng máy đọc
Elisa ở bước sóng 405 nm. https://drivers.vn/
hết nước ở trong bản ELISA) 3 lần bằng đệm PBS – T (Phosphate buffer saline-
Tween), mỗi lần cách nhau 3 – 4 phút. Mỗi lần rửa bản ELISA đều vảy mạnh
để loại hết đệm PBS – T ra khỏi các giếng và úp ngược trên khăn thấm, sau đó
mới tiến hành nhỏ đệm PBS – T mới vào để rửa tiếp.
Bước 2: Tạo dung dịch mẫu và Cố định dịch cây vào bản Elisa
Dùng kéo cắt nhuyễn khoảng 0.1g mẫu lá cho vào cối sứ (hoặc ống
eppendorf) nghiền thật nhuyễn trong dung dịch nitơ lỏng, thêm vào 1000 µl dung
dịch 1X PBS-T. Dịch mẫu được cho vào mỗi giếng là 100 µl/giếng.
- Gói bản Elisa trong tờ khăn giấy có thấm nước để giữ ẩm, và bọc kín lại trong
túi nilon. Sau đó ủ ở 37
o
C trong 4 giờ hoặc ủ ở 4
o
C qua một đêm.
- Sau khi ủ, bản Elisa được tiếp tục rửa bằng dung dịch đệm rửa 1X PBS-T như
ở bước 1.
Bước 3: Cố định IgG liên kết enzyme vào bản Elisa
- Hòa tan IgG liên kết Biotin và Avidin liên kết alkaline phosphatase trong dung
dịch 1X PBS-T với tỷ lệ: 1µl IgG-Biotin /1µl avidin-alkaline phosphatase/1ml
PBS –T.
- Cho dung dịch vừa hòa tan vào các giếng của bản Elisa với lượng 100 µl/giếng.
Gói bản Elisa trong tờ khăn giấy có thấm nước để giữ ẩm, gói kín lại trong túi
nilon, tiếp tục ủ ở 37
o
C trong 4 giờ hoặc ủ ở 4
o
C qua một đêm và rửa bản Elisa
bằng dung dịch đệm rửa 1X PBS-T như ở bước 1.
Bước 4: Cố định chất nền và đánh giá kết quả
- Hòa tan chất nền (Phosphate substrate) với dung dịch đệm Diethanolamine (
Subtrate buffer) theo tỷ lệ 1mg/ 1ml (tương ứng : 4 viên Phosphatase subtrate +
20 ml dung dịch S. buffer). Cho vào mỗi giếng của bản Elisa 100 µl dung dịch
vừa hoà tan.
- Ủ bản Elisa ở nhiệt độ phòng sau 20 phút, sau đó đọc kết quả bằng máy đọc
Elisa ở bước sóng 405 nm. https://drivers.vn/
Sau đó đánh giá kết quả bằng mắt thường và đo trị số ELISA (OD) ở bước
sóng 405 nm.
+ Mẫu dương tính với bệnh nếu: (Giá trị Blank data đọc được qua máy của
mỗi giếng) – (2 × trị số trung bình giá trị ở giếng đối chứng âm + độ lệch chuẩn)
≥ 0,1
+ Mẫu âm tính với bệnh nếu: (Giá trị Blank data đọc được qua máy của
mỗi giếng) – ( 2 × trị số trung bình giá trị ở giếng đối chứng âm + độ lệch chuẩn)
< 0,1
https://drivers.vn/
sóng 405 nm.
+ Mẫu dương tính với bệnh nếu: (Giá trị Blank data đọc được qua máy của
mỗi giếng) – (2 × trị số trung bình giá trị ở giếng đối chứng âm + độ lệch chuẩn)
≥ 0,1
+ Mẫu âm tính với bệnh nếu: (Giá trị Blank data đọc được qua máy của
mỗi giếng) – ( 2 × trị số trung bình giá trị ở giếng đối chứng âm + độ lệch chuẩn)
< 0,1
https://drivers.vn/
4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo
dùng kĩ thuật agroinoculation sử dụng cấu trúc xâm nhiễm VNP93
Cà chua và ớt là những cây trồng quan trọng trong nền nông nghiệp hiện nay
của nước ta. Trong đó, cây ớt được coi là một trong năm loại cây trồng chủ lực
trong chương trình chọn tạo giống rau của Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn
trong giai đoạn 2006 – 2010. Vì vậy việc phát hiện virus PepYLCVNV gây hại trên
cà chua và cây ớt rất có ý nghĩa trong thực tiễn cũng như nghiên cứu khoa học. Đây
là loài virus mới được phát hiện tại Việt Nam nên trên thế giới cũng như ở Việt
Nam chưa có nhiều tài liệu cũng như công trình nghiên cứu về loài virus
PepYLCVNV này.
Mục tiêu của phần nghiên cứu này là tìm ra phương pháp lây nhiễm nhân tạo
PepYLCVNV nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation) có
hiệu quả nhất. Dựa trên phương pháp lây nhiễm hiệu quả, tính gây bệnh của virus,
đặc điểm sinh học của virus có thể được đánh giá dễ dàng, từ đó đưa ra các biện
pháp phòng trừ loài virus này đạt hiệu quả cao.
Chúng tôi sử dụng phương pháp tiêm trực tiếp vi khuẩn vào mô cây (Kheyr-
Pour, Bendahmane et al., 1991) để thực hiện kĩ thuật lây nhiễm này. Đây là phương
pháp tiêm trực tiếp dung dịch vi khuẩn chứa các cấu trúc xâm nhiễm của
PepYLCVNV vào mô lá và chồi nách của cây, cây ở giai đoạn 3-4 lá thật.
4.1.1 Chuẩn bị nguồn vi khuẩn A. tumerfaciens mang cấu trúc xâm nhiễm
của PepYLCVNV
4.1.1.1 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm của DNA-B vào tế bào khả biến A.
Tumerfaciens
Cấu trúc xâm nhiễm của cả thành phần, DNA-A và DNA-B, của
PepYLCVNV đã được xây dựng từ trước trên vector chuyển gen thực vật là
pCAMBIA2300. Cả 2 cấu trúc xâm nhiễm này đã được biến nạp vào tế bào vi
khuẩn A. tumefaciens từ 2013. Tuy nhiên, trong quá trình bảo quản, nguồn AT-https://drivers.vn/
4.1 Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo
dùng kĩ thuật agroinoculation sử dụng cấu trúc xâm nhiễm VNP93
Cà chua và ớt là những cây trồng quan trọng trong nền nông nghiệp hiện nay
của nước ta. Trong đó, cây ớt được coi là một trong năm loại cây trồng chủ lực
trong chương trình chọn tạo giống rau của Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn
trong giai đoạn 2006 – 2010. Vì vậy việc phát hiện virus PepYLCVNV gây hại trên
cà chua và cây ớt rất có ý nghĩa trong thực tiễn cũng như nghiên cứu khoa học. Đây
là loài virus mới được phát hiện tại Việt Nam nên trên thế giới cũng như ở Việt
Nam chưa có nhiều tài liệu cũng như công trình nghiên cứu về loài virus
PepYLCVNV này.
Mục tiêu của phần nghiên cứu này là tìm ra phương pháp lây nhiễm nhân tạo
PepYLCVNV nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation) có
hiệu quả nhất. Dựa trên phương pháp lây nhiễm hiệu quả, tính gây bệnh của virus,
đặc điểm sinh học của virus có thể được đánh giá dễ dàng, từ đó đưa ra các biện
pháp phòng trừ loài virus này đạt hiệu quả cao.
Chúng tôi sử dụng phương pháp tiêm trực tiếp vi khuẩn vào mô cây (Kheyr-
Pour, Bendahmane et al., 1991) để thực hiện kĩ thuật lây nhiễm này. Đây là phương
pháp tiêm trực tiếp dung dịch vi khuẩn chứa các cấu trúc xâm nhiễm của
PepYLCVNV vào mô lá và chồi nách của cây, cây ở giai đoạn 3-4 lá thật.
4.1.1 Chuẩn bị nguồn vi khuẩn A. tumerfaciens mang cấu trúc xâm nhiễm
của PepYLCVNV
4.1.1.1 Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm của DNA-B vào tế bào khả biến A.
Tumerfaciens
Cấu trúc xâm nhiễm của cả thành phần, DNA-A và DNA-B, của
PepYLCVNV đã được xây dựng từ trước trên vector chuyển gen thực vật là
pCAMBIA2300. Cả 2 cấu trúc xâm nhiễm này đã được biến nạp vào tế bào vi
khuẩn A. tumefaciens từ 2013. Tuy nhiên, trong quá trình bảo quản, nguồn AT-https://drivers.vn/
VNP93-5-8-1 (DNA-B) có lẫn AT-VNP93-5-4-11 (DNA-A). Do vậy, chúng tôi đã
chuẩn bị dòng vi khuẩn mới bằng cách biến nạp lại cấu trúc xâm nhiễm của DNA-
A và DNA-B vào tế bào A. tumerfaciens khả biến.
Dòng plasmid mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-A (VNP93-5-4) và DNA-
B (VNP93-5-8) được biến nạp vào tế bào khả biến A. tumefaciens theo phương
pháp đông – tan như mô tả trong phần vật liệu và phương pháp. Vi khuẩn biến nạp
được cấy trải riêng rẽ từng cấu trúc xâm nhiễm trên 2 đĩa môi trường LB agar chứa
3 kháng sinh (rifampycin, kanamycin và streptomycin) ủ ở 28
o
C. Quan sat sau 2
ngày ủ thấy số lượng khuẩn lạc nhiều, có đặc điểm hình thái giống A.tumerfaciens.
Chúng tôi chọn mỗi đĩa 5 khuẩn lạc đem nuôi trong môi trường LB lỏng chứ 3
kháng sinh (rifampycin, kanamycin và streptomycin). Vi khuẩn nuôi qua đêm ở
điều kiện lắc 20 rmp và nhiệt độ dưới 28
0
C. Dịch vi khuẩn được kiểm tra Multiplex
– PCR với các cặp mồi đặc hiệu VNP93-A-F1/B-F1 và VNP93-A-F1/B-F1. Chu
trình và phương pháp kiểm tra Multiplex – PCR đã trình bày trên phần phương
pháp.
Kết quả kiểm tra PCR (Bảng 4.1 và Hình 4.1) cho thấy trong 10 dòng vì
khuẩn được kiểm tra PCR thấy có 5 dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiễm của
DNA-A và 5 dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-B.
Vì 5 dòng vi khuẩn được biến nạp từ cấu trúc VNP93-5-4 và 5 dòng vi khuẩn
được biến nạp từ cấu trúc VNP93-5-8 nên chúng được trộn lẫn 5 dòng vi khuẩn của
từng cấu trúc vào nhau và được ký hiệu là AT-VNP93-5-4 và AT-VNP93-5-8.
Hai dòng này được bảo quản ở -80
o
C trong glycerol 15% và được dùng cho các
nghiên cứu tiếp theo.
https://drivers.vn/
chuẩn bị dòng vi khuẩn mới bằng cách biến nạp lại cấu trúc xâm nhiễm của DNA-
A và DNA-B vào tế bào A. tumerfaciens khả biến.
Dòng plasmid mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-A (VNP93-5-4) và DNA-
B (VNP93-5-8) được biến nạp vào tế bào khả biến A. tumefaciens theo phương
pháp đông – tan như mô tả trong phần vật liệu và phương pháp. Vi khuẩn biến nạp
được cấy trải riêng rẽ từng cấu trúc xâm nhiễm trên 2 đĩa môi trường LB agar chứa
3 kháng sinh (rifampycin, kanamycin và streptomycin) ủ ở 28
o
C. Quan sat sau 2
ngày ủ thấy số lượng khuẩn lạc nhiều, có đặc điểm hình thái giống A.tumerfaciens.
Chúng tôi chọn mỗi đĩa 5 khuẩn lạc đem nuôi trong môi trường LB lỏng chứ 3
kháng sinh (rifampycin, kanamycin và streptomycin). Vi khuẩn nuôi qua đêm ở
điều kiện lắc 20 rmp và nhiệt độ dưới 28
0
C. Dịch vi khuẩn được kiểm tra Multiplex
– PCR với các cặp mồi đặc hiệu VNP93-A-F1/B-F1 và VNP93-A-F1/B-F1. Chu
trình và phương pháp kiểm tra Multiplex – PCR đã trình bày trên phần phương
pháp.
Kết quả kiểm tra PCR (Bảng 4.1 và Hình 4.1) cho thấy trong 10 dòng vì
khuẩn được kiểm tra PCR thấy có 5 dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiễm của
DNA-A và 5 dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-B.
Vì 5 dòng vi khuẩn được biến nạp từ cấu trúc VNP93-5-4 và 5 dòng vi khuẩn
được biến nạp từ cấu trúc VNP93-5-8 nên chúng được trộn lẫn 5 dòng vi khuẩn của
từng cấu trúc vào nhau và được ký hiệu là AT-VNP93-5-4 và AT-VNP93-5-8.
Hai dòng này được bảo quản ở -80
o
C trong glycerol 15% và được dùng cho các
nghiên cứu tiếp theo.
https://drivers.vn/
Bảng 4.1: Kết quả PCR 10 dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiêm của
PepYLCVNV
STT DNA Dòng A.Tumefaciens biến nạp
PCR
DNA-A DNA-B
1 DNA-A AT-VNP93-5-4-1 + –
2 DNA-A AT-VNP93-5-4-2 + –
3 DNA-A AT-VNP93-5-4-3 + –
4 DNA-A AT-VNP93-5-4-4 + –
5 DNA-A AT-VNP93-5-4-5 + –
6 DNA-B AT-VNP93-5-8-1 – +
7 DNA-B AT-VNP93-5-8-2 – +
8 DNA-B AT-VNP93-5-8-3 – +
9 DNA-B AT-VNP93-5-8-4 – +
10 DNA-B AT-VNP93-5-8-5 – +
Hình 4.1. Kiểm tra PCR các dòng A.Tumefaciens được biến nạp với cấu
trúc xâm nhiễm DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV
M→VNP93-5-4-1→ VNP93-5-4-2→ VNP93-5-4-3→ VNP93-5-4-4→
VNP93-5-4-5→ VNP93-5-8-1→ VNP93-5-8-2→ VNP93-5-8-3→ VNP93-5-
8-4→ VNP93-5-8-5 (ladder 100bp) https://drivers.vn/
PepYLCVNV
STT DNA Dòng A.Tumefaciens biến nạp
PCR
DNA-A DNA-B
1 DNA-A AT-VNP93-5-4-1 + –
2 DNA-A AT-VNP93-5-4-2 + –
3 DNA-A AT-VNP93-5-4-3 + –
4 DNA-A AT-VNP93-5-4-4 + –
5 DNA-A AT-VNP93-5-4-5 + –
6 DNA-B AT-VNP93-5-8-1 – +
7 DNA-B AT-VNP93-5-8-2 – +
8 DNA-B AT-VNP93-5-8-3 – +
9 DNA-B AT-VNP93-5-8-4 – +
10 DNA-B AT-VNP93-5-8-5 – +
Hình 4.1. Kiểm tra PCR các dòng A.Tumefaciens được biến nạp với cấu
trúc xâm nhiễm DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV
M→VNP93-5-4-1→ VNP93-5-4-2→ VNP93-5-4-3→ VNP93-5-4-4→
VNP93-5-4-5→ VNP93-5-8-1→ VNP93-5-8-2→ VNP93-5-8-3→ VNP93-5-
8-4→ VNP93-5-8-5 (ladder 100bp) https://drivers.vn/
4.1.1.2 Phục hồi các dòng vi khuẩn A. tumefaciens mang 2 cấu trúc xâm nhiễm
của PepYLCVNV
Lấy cặp dòng vi khuẩn AT-VNP93-5-4 (mang cấu trúc xâm nhiễm của
DNA-A) và AT-VNP93-5-4 (mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-B) bảo quản ở -
80
o
C để làm nguồn lây nhiễm. Hai dòng này sau khi phục hồi được bảo quản ngắn
hạn trong nước cất vô trùng ở điều kiện 4
o
C cho các nghiên cứu lây nhiễm trong
quá trình thực tập.
Hai dòng vi khuẩn trên được cấy zic zắc trên môi trường LB – agar có bổ
sung thêm ba loại kháng sinh Streptomycin, Rifamycin, Kanamycin. Nuôi vi khuẩn
trong điều kiện nhiệt độ dưới 28
0
C và đánh giá kết quả sau 2 - 3 ngày.
Sau 2 ngày thì vi khuẩn bắt đầu mọc, đến ngày thứ 3 nhìn chung các dòng vi
khuẩn nuôi cấy trên môi trường LB – agar, có khuẩn lạc mọc đều và đẹp, khuẩn lạc
hình tròn, màu trắng sữa, rìa nhẵn, bề mặt khuẩn lạc ướt (Hình ảnh 4.2). Khuẩn lạc
đặc trưng cho dòng vi khuẩn Agrobacterium. Tổng số 2/2 dòng vi khuẩn đã được
phục hồi (Bảng 4.2).
Bảng 4.2. Kết quả phục hồi 2 dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiêm
của PepYLCVNV
STT DNA Dòng vi khuẩn
Số khuẩn lạc mọc trên
LB- agar
1 DNA-A AT-VNP93-5-4-11 ~200
2 DNA-B AT-VNP93-5-8-1 ~150
https://drivers.vn/
của PepYLCVNV
Lấy cặp dòng vi khuẩn AT-VNP93-5-4 (mang cấu trúc xâm nhiễm của
DNA-A) và AT-VNP93-5-4 (mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-B) bảo quản ở -
80
o
C để làm nguồn lây nhiễm. Hai dòng này sau khi phục hồi được bảo quản ngắn
hạn trong nước cất vô trùng ở điều kiện 4
o
C cho các nghiên cứu lây nhiễm trong
quá trình thực tập.
Hai dòng vi khuẩn trên được cấy zic zắc trên môi trường LB – agar có bổ
sung thêm ba loại kháng sinh Streptomycin, Rifamycin, Kanamycin. Nuôi vi khuẩn
trong điều kiện nhiệt độ dưới 28
0
C và đánh giá kết quả sau 2 - 3 ngày.
Sau 2 ngày thì vi khuẩn bắt đầu mọc, đến ngày thứ 3 nhìn chung các dòng vi
khuẩn nuôi cấy trên môi trường LB – agar, có khuẩn lạc mọc đều và đẹp, khuẩn lạc
hình tròn, màu trắng sữa, rìa nhẵn, bề mặt khuẩn lạc ướt (Hình ảnh 4.2). Khuẩn lạc
đặc trưng cho dòng vi khuẩn Agrobacterium. Tổng số 2/2 dòng vi khuẩn đã được
phục hồi (Bảng 4.2).
Bảng 4.2. Kết quả phục hồi 2 dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiêm
của PepYLCVNV
STT DNA Dòng vi khuẩn
Số khuẩn lạc mọc trên
LB- agar
1 DNA-A AT-VNP93-5-4-11 ~200
2 DNA-B AT-VNP93-5-8-1 ~150
https://drivers.vn/
Hình 4.2. Hình ảnh khuẩn lạc trên môi trường LB–Agar sau 3 ngày nuôi
cấy
4.1.2 Nhân sinh khối dòng vi khuẩn A.Tumerfaciens trong môi trường LB-
lỏng
Chọn cặp dòng vi khuẩn VNP93-5-4 và VNP-5-8 nuôi nhân sinh khối để tiến
hành lây nhiễm. Sau khi đã phục hồi các dòng vi khuẩn A.tumerfacins chứa cấu
trúc xâm nhiễm, các khuẩn lạc được đem nuôi lắc trong môi trường LB – lỏng có
chứa 3 loại kháng sinh (Streptomycin, Rifamycin, Kanamycin), với mục đích nhân
sinh khối các dòng vi khuẩn cho lây nhiễm. Vi khuẩn nuôi qua đêm ở điều kiện lắc
250 rmp và nhiệt độ dưới 28
0
C. Kết quả cho thấy tất cả các khuẩn lạc đều phát triển
tốt trong môi trường LB – lỏng, các lọ dung dịch vi khuẩn có vẩn đục ( Hình ảnh
4.2).
Hình 4.2: Dòng vi khuẩn A.tumerfaciens chứa cấu trúc xâm nhiễm
PepYLCVNV nuôi trong LB – lỏng
4.1.3 Kết quả đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng phương pháp
Agroinoculation
Các dòng vi khuẩn A.tumerfaciens có chứa cấu trúc xâm nhiễm của
PepYLCVNV chứa bộ gen (DNA-A và DNA-B ) riêng rẽ, đã được nuôi trong môi
trường LB – lỏng. Dịch vi khuẩn thu được sau khi nuôi lỏng, lắc được mang đi li
tâm lấy cặn vi khuẩn và hòa tan cặn vi khuẩn bằng đệm MgCl2 cùng với 1 µl/ml https://drivers.vn/
cấy
4.1.2 Nhân sinh khối dòng vi khuẩn A.Tumerfaciens trong môi trường LB-
lỏng
Chọn cặp dòng vi khuẩn VNP93-5-4 và VNP-5-8 nuôi nhân sinh khối để tiến
hành lây nhiễm. Sau khi đã phục hồi các dòng vi khuẩn A.tumerfacins chứa cấu
trúc xâm nhiễm, các khuẩn lạc được đem nuôi lắc trong môi trường LB – lỏng có
chứa 3 loại kháng sinh (Streptomycin, Rifamycin, Kanamycin), với mục đích nhân
sinh khối các dòng vi khuẩn cho lây nhiễm. Vi khuẩn nuôi qua đêm ở điều kiện lắc
250 rmp và nhiệt độ dưới 28
0
C. Kết quả cho thấy tất cả các khuẩn lạc đều phát triển
tốt trong môi trường LB – lỏng, các lọ dung dịch vi khuẩn có vẩn đục ( Hình ảnh
4.2).
Hình 4.2: Dòng vi khuẩn A.tumerfaciens chứa cấu trúc xâm nhiễm
PepYLCVNV nuôi trong LB – lỏng
4.1.3 Kết quả đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng phương pháp
Agroinoculation
Các dòng vi khuẩn A.tumerfaciens có chứa cấu trúc xâm nhiễm của
PepYLCVNV chứa bộ gen (DNA-A và DNA-B ) riêng rẽ, đã được nuôi trong môi
trường LB – lỏng. Dịch vi khuẩn thu được sau khi nuôi lỏng, lắc được mang đi li
tâm lấy cặn vi khuẩn và hòa tan cặn vi khuẩn bằng đệm MgCl2 cùng với 1 µl/ml https://drivers.vn/
acetonringone 0.1M giúp kích thích sự phát triển của vi khuẩn trong tế bào ký chủ.
Sau đó dịch vi khuẩn được sử dụng để lây nhiễm bằng cách tiêm trực tiếp vào mô
lá khi cây ở giai đoạn có 3-4 lá thật. Cây thí nghiệm là cà chua mẫn cảm giống
Hồng Lan T20, ớt Hiểm Lai F1-207, và các giống chỉ thị: thuốc lào (N. glutinosa),
thuốc lá (N. tabacum) cv. K326, thuốc lá (N. tabacum) cv. Samsum, thuốc lá cảnh
(Nicotiana benthamiana), hoa ngũ sắc (Ageratum conyzoides).
Trên cùng 1 cây thí nghiệm, chúng tôi đã sử dụng 2 phương pháp để đưa vi
khuẩn vào trong cây. Các phương pháp lây nhiễm được trình bày ở bảng 4.2.3.
Bảng 4.3. Các phương pháp lây nhiễm nhân tạo sử dụng A. tumerfaciens
(Agroinoculation)
STT Tên phương pháp Mô tả phương pháp
1
Tiêm trực tiếp dịch
khuẩn vào nách lá
Là phương pháp lây nhiễm khi cây được 3-4 lá
mầm, dịch vi khuẩn được tiêm trực tiếp nách lá
bằng xi lanh y tế loại 1 mL nhỏ.
2
Tiêm trực tiếp dịch
khuẩn vào mô lá
Là phương pháp lây nhiễm khi cây được 3-4 lá
mầm, dùng xy lanh y tế loại 1 mL nhỏ nhưng
tháo kim và bơm dịch vi khuẩn vào mặt dưới của
lá để vi khuẩn có thể xâm nhập vào mô qua khí
khổng.
- Các công thức thí nghiệm bao gồm:
1. Chỉ lây nhiễm một mình dòng VNP93-A
2. Lây nhiễm hỗn hợp 2 dòng vi khuẩn: VNP93-A và VNP93-B
3. Đối chứng: tiêm acetosyrigone 10 mM
Một công thức thực hiện trên 5 cây, mỗi cây được tiêm trực tiếp 3 mũi tại 3
nách lá tính từ ngọn xuống, tiếp theo được bơm 3 vết trên 3 lá khác với ba lá đã
được tiêm vào nách.
Vì nhiệt độ tối thích cho vi khuẩn A. tumefeciens chuyển gien là 28
o
C – 30
o
C
nên cây thí nghiệm được chuyển vào phòng điều hòa nhiệt độ ở 28
o
C trước, sau và https://drivers.vn/
Sau đó dịch vi khuẩn được sử dụng để lây nhiễm bằng cách tiêm trực tiếp vào mô
lá khi cây ở giai đoạn có 3-4 lá thật. Cây thí nghiệm là cà chua mẫn cảm giống
Hồng Lan T20, ớt Hiểm Lai F1-207, và các giống chỉ thị: thuốc lào (N. glutinosa),
thuốc lá (N. tabacum) cv. K326, thuốc lá (N. tabacum) cv. Samsum, thuốc lá cảnh
(Nicotiana benthamiana), hoa ngũ sắc (Ageratum conyzoides).
Trên cùng 1 cây thí nghiệm, chúng tôi đã sử dụng 2 phương pháp để đưa vi
khuẩn vào trong cây. Các phương pháp lây nhiễm được trình bày ở bảng 4.2.3.
Bảng 4.3. Các phương pháp lây nhiễm nhân tạo sử dụng A. tumerfaciens
(Agroinoculation)
STT Tên phương pháp Mô tả phương pháp
1
Tiêm trực tiếp dịch
khuẩn vào nách lá
Là phương pháp lây nhiễm khi cây được 3-4 lá
mầm, dịch vi khuẩn được tiêm trực tiếp nách lá
bằng xi lanh y tế loại 1 mL nhỏ.
2
Tiêm trực tiếp dịch
khuẩn vào mô lá
Là phương pháp lây nhiễm khi cây được 3-4 lá
mầm, dùng xy lanh y tế loại 1 mL nhỏ nhưng
tháo kim và bơm dịch vi khuẩn vào mặt dưới của
lá để vi khuẩn có thể xâm nhập vào mô qua khí
khổng.
- Các công thức thí nghiệm bao gồm:
1. Chỉ lây nhiễm một mình dòng VNP93-A
2. Lây nhiễm hỗn hợp 2 dòng vi khuẩn: VNP93-A và VNP93-B
3. Đối chứng: tiêm acetosyrigone 10 mM
Một công thức thực hiện trên 5 cây, mỗi cây được tiêm trực tiếp 3 mũi tại 3
nách lá tính từ ngọn xuống, tiếp theo được bơm 3 vết trên 3 lá khác với ba lá đã
được tiêm vào nách.
Vì nhiệt độ tối thích cho vi khuẩn A. tumefeciens chuyển gien là 28
o
C – 30
o
C
nên cây thí nghiệm được chuyển vào phòng điều hòa nhiệt độ ở 28
o
C trước, sau và https://drivers.vn/
trong suốt quá trình lây nhiễm nhân tạo để tạo điệu kiện cho vi khuẩn hoạt động
thuận lợi.
Sau đó cây thí nghiệm được chuyển ra nhà lưới và đề đảm bảo cho cây sạch
bọ phấn (môi giới truyền Begomovirus) tất cả cây thí nghiệm được xử lý bằng
thuốc trừ côn trùng chích hút với mật độ phun 2 tuần/lần. Thí nghiệm lây nhiễm
agroinoculation được minh họa ở Hình 4.6.
Hình4.3. Phương pháp tiêm trực tiếp dịch vi khuẩn vào mô lá
4.1.4 Tính gây bệnh của DNA-A (lây nhiễm bằng agroinoculation)
PepYLCVNV là một begomovirus có bộ gen kép (có cả DNA-A và DNA-
B). Tuy nhiên, nhiều begomovirus có bộ gien đơn đã được chứng minh là có thể
tạo ra triệu chứng điển hình mà không cần sự có mặt của DNA-B chẳng hạn như
đối với TYLCSV (Kheyr-Pour et al., 1991) và Tobacco yellow leaf curl Yunnan
virus (TYLCYNV) (Xie et al., 2006) trên cà chua. Mặt khác, một số nghiên cứu tại
TTBCND (Chi, 2013) đã kết luận chỉ cần DNA-A cũng có có thể gây bệnh trên cà
chua.
Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành lặp lại các thí nghiệm nhằm nghiên cứu
chính xác tính gây bệnh của chỉ DNA-A của PepYLCVNV trên cà chua bởi vì
DNA-A của virus này đã được phát hiện trên ruộng trồng cà chua ở gần ruộng trồng https://drivers.vn/
thuận lợi.
Sau đó cây thí nghiệm được chuyển ra nhà lưới và đề đảm bảo cho cây sạch
bọ phấn (môi giới truyền Begomovirus) tất cả cây thí nghiệm được xử lý bằng
thuốc trừ côn trùng chích hút với mật độ phun 2 tuần/lần. Thí nghiệm lây nhiễm
agroinoculation được minh họa ở Hình 4.6.
Hình4.3. Phương pháp tiêm trực tiếp dịch vi khuẩn vào mô lá
4.1.4 Tính gây bệnh của DNA-A (lây nhiễm bằng agroinoculation)
PepYLCVNV là một begomovirus có bộ gen kép (có cả DNA-A và DNA-
B). Tuy nhiên, nhiều begomovirus có bộ gien đơn đã được chứng minh là có thể
tạo ra triệu chứng điển hình mà không cần sự có mặt của DNA-B chẳng hạn như
đối với TYLCSV (Kheyr-Pour et al., 1991) và Tobacco yellow leaf curl Yunnan
virus (TYLCYNV) (Xie et al., 2006) trên cà chua. Mặt khác, một số nghiên cứu tại
TTBCND (Chi, 2013) đã kết luận chỉ cần DNA-A cũng có có thể gây bệnh trên cà
chua.
Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành lặp lại các thí nghiệm nhằm nghiên cứu
chính xác tính gây bệnh của chỉ DNA-A của PepYLCVNV trên cà chua bởi vì
DNA-A của virus này đã được phát hiện trên ruộng trồng cà chua ở gần ruộng trồng https://drivers.vn/
ớt đã, nơi đã phát hiện ra virus này. Ngoài ra, chúng tôi cũng nghiên cứu tính gây
bệnh này trên cây ớt, thuốc lá và trên cây họ ageratum (một loài cây ký chủ phụ
phổ biến đối với begomovirus ngoài tự nhiên).
Thí nghiệm 1: Lây nhiễm trên dòng cà chua Hồng Lan (T20). Chúng tôi tiến
hành lặp lại 4 lần, triệu chứng mỗi lần lây được theo dõi sau 1, 2, 3, 4 tuần sau khi
lây. Sau một tháng lây nhiễm, trong cả 4 lần thực hiện lây không có cây nào biểu
hiện triệu chứng nhiễm bệnh. Để kiểm tra khả năng nhiễm ẩn (cây nhiễm virus
nhưng không biểu hiện triệu chứng), sau 50 ngày lây nhiễm chúng tôi tiến hành
PCR để kiểm tra sự có mặt DNA-A của PepYLCVNV trên các cây lây sử dụng
mồi đặc hiệu VNP93-A-F1/R1.
Bảng 4.4. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A giống cà
chua Hồng Lan (T20)
STT
Ngày lây
nhiễm
Số cây lây
Số cây có triệu
chứng
Số cây PCR dương/
số cây kiểm tra
1 8/3/2014 15 0 3/5
2 12/4/2014 15 0 5/5
3 24/4/2014 12 0 2/5
4 10/5/2014 12 0 4/5
Hình 4.4. PCR phát hiện DNA-A của PepYLCVNV trên cà chua Hồng
Lan (T20). Từ trái qua phải tương ứng.
Kết quả cho thấy rằng qua 4 lần thí nghiệm chúng tôi không nhận thấy triệu
chứng trên các cây lây nhiễm tuy nhiên khi kiểm tra bằng PCR thì vẫn thấy sự có https://drivers.vn/
bệnh này trên cây ớt, thuốc lá và trên cây họ ageratum (một loài cây ký chủ phụ
phổ biến đối với begomovirus ngoài tự nhiên).
Thí nghiệm 1: Lây nhiễm trên dòng cà chua Hồng Lan (T20). Chúng tôi tiến
hành lặp lại 4 lần, triệu chứng mỗi lần lây được theo dõi sau 1, 2, 3, 4 tuần sau khi
lây. Sau một tháng lây nhiễm, trong cả 4 lần thực hiện lây không có cây nào biểu
hiện triệu chứng nhiễm bệnh. Để kiểm tra khả năng nhiễm ẩn (cây nhiễm virus
nhưng không biểu hiện triệu chứng), sau 50 ngày lây nhiễm chúng tôi tiến hành
PCR để kiểm tra sự có mặt DNA-A của PepYLCVNV trên các cây lây sử dụng
mồi đặc hiệu VNP93-A-F1/R1.
Bảng 4.4. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A giống cà
chua Hồng Lan (T20)
STT
Ngày lây
nhiễm
Số cây lây
Số cây có triệu
chứng
Số cây PCR dương/
số cây kiểm tra
1 8/3/2014 15 0 3/5
2 12/4/2014 15 0 5/5
3 24/4/2014 12 0 2/5
4 10/5/2014 12 0 4/5
Hình 4.4. PCR phát hiện DNA-A của PepYLCVNV trên cà chua Hồng
Lan (T20). Từ trái qua phải tương ứng.
Kết quả cho thấy rằng qua 4 lần thí nghiệm chúng tôi không nhận thấy triệu
chứng trên các cây lây nhiễm tuy nhiên khi kiểm tra bằng PCR thì vẫn thấy sự có https://drivers.vn/
mặt của virus chứng tỏ được tính hiệu quả của cấu trúc xâm nhiễm=> câu hỏi vì
sao.
Thí nghiệm 2: Lây nhiễm trên ớt: Chúng tôi tiến hành thí nghiệm này trên
giống ớt mẫn cảm Hiểm Lai F1-207. Tiến hành lặp lại 3 lần, theo dõi tuần 1, 2, 3,
4 sau lây. Quan sát tại tuần 4 sau khi tiêm cho thấy, cả 3 lần tiêm không có cây nào
biêu hiện triệu chứng, sau 4 tuần lây nhiễm, chúng tôi tiến hành PCR để kiểm tra
sự có mặt DNA-A của PepYLCVNV trên các cây lây sử dụng mồi đặc hiệu
VNP93-A-F1/R1 (Bảng 5, hình 4.5).
Bảng 4.5. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A giống ớt
Hiểm Lai F1-207
STT
Ngày lây
nhiễm
Số cây lây
Số cây có triệu
chứng
Số cây PCR dương/
số cây kiểm tra
1 12/4/2014 15 0
2 24/4/2014 12 0
3 10/5/2014 12 0
Ghi chú: Phản ứng PCR dương (+); Phản ứng PCR âm (-); ĐC: Đối chứng
Hình 4.5. PCR phát hiện DNA-A của PepYLCVNV trên ớt Hiểm Lai
F1-207. Từ trái qua phải tương ứng.
Thí nghiệm 3: Lây nhiễn trên cây chỉ thị: Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành
lây nhiễn trên 3 giống thuốc lá (N. benthamaiana, N. tabacum cv. Samsun, N.
tabacum cv. K326), thuốc lào N.Glutinosa và hoa ngủ sắc (Ageratum conyzoides).
Tiến hành lặp lại 3 lần, triệu chứng được theo dõi sau 1, 2, 3, 4 tuần sau lây đồng https://drivers.vn/
sao.
Thí nghiệm 2: Lây nhiễm trên ớt: Chúng tôi tiến hành thí nghiệm này trên
giống ớt mẫn cảm Hiểm Lai F1-207. Tiến hành lặp lại 3 lần, theo dõi tuần 1, 2, 3,
4 sau lây. Quan sát tại tuần 4 sau khi tiêm cho thấy, cả 3 lần tiêm không có cây nào
biêu hiện triệu chứng, sau 4 tuần lây nhiễm, chúng tôi tiến hành PCR để kiểm tra
sự có mặt DNA-A của PepYLCVNV trên các cây lây sử dụng mồi đặc hiệu
VNP93-A-F1/R1 (Bảng 5, hình 4.5).
Bảng 4.5. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A giống ớt
Hiểm Lai F1-207
STT
Ngày lây
nhiễm
Số cây lây
Số cây có triệu
chứng
Số cây PCR dương/
số cây kiểm tra
1 12/4/2014 15 0
2 24/4/2014 12 0
3 10/5/2014 12 0
Ghi chú: Phản ứng PCR dương (+); Phản ứng PCR âm (-); ĐC: Đối chứng
Hình 4.5. PCR phát hiện DNA-A của PepYLCVNV trên ớt Hiểm Lai
F1-207. Từ trái qua phải tương ứng.
Thí nghiệm 3: Lây nhiễn trên cây chỉ thị: Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành
lây nhiễn trên 3 giống thuốc lá (N. benthamaiana, N. tabacum cv. Samsun, N.
tabacum cv. K326), thuốc lào N.Glutinosa và hoa ngủ sắc (Ageratum conyzoides).
Tiến hành lặp lại 3 lần, triệu chứng được theo dõi sau 1, 2, 3, 4 tuần sau lây đồng https://drivers.vn/
thời các cây lây nhiễm được kiểm tra lại bằng PCR sau 4 tuần lây nhiễm. Kết quả
được trình bày ở bảng 4.6 và hình 4.6
Bảng 4.6. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A trên cây
chỉ thị.
Cây
Lần lây nhiễn
thứ 1
Lần lây nhiễn
thứ 2
Lần lây nhiễn
thứ 3
Triệu
chứng
PCR
(+)
Triệu
chứng
PCR
(+)
Triệu
chứng
PCR
(+)
Nicotiana
benthamiana
0/6 6/6 0/6 3/6 0/6 4/6
N. tabacum cv. K326 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
N. tabacum cv.
Samsun
0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
N. glutinosa 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
Ageratum conyzoides 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
Ghi chú: Phản ứng PCR dương (+); Phản ứng PCR âm (-); ĐC: Đối chứng
Hình 4.6. PCR phát hiện DNA-A của PepYLCVNV trên cây Nicotiana
benthamiana (lây nhiễm lần 1)
M→ Cây 1→ Cây 2→ Cây 3→ Cây 4→ Cây 5→ Cây 6(ladder 1kb) https://drivers.vn/
được trình bày ở bảng 4.6 và hình 4.6
Bảng 4.6. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A trên cây
chỉ thị.
Cây
Lần lây nhiễn
thứ 1
Lần lây nhiễn
thứ 2
Lần lây nhiễn
thứ 3
Triệu
chứng
PCR
(+)
Triệu
chứng
PCR
(+)
Triệu
chứng
PCR
(+)
Nicotiana
benthamiana
0/6 6/6 0/6 3/6 0/6 4/6
N. tabacum cv. K326 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
N. tabacum cv.
Samsun
0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
N. glutinosa 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
Ageratum conyzoides 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
Ghi chú: Phản ứng PCR dương (+); Phản ứng PCR âm (-); ĐC: Đối chứng
Hình 4.6. PCR phát hiện DNA-A của PepYLCVNV trên cây Nicotiana
benthamiana (lây nhiễm lần 1)
M→ Cây 1→ Cây 2→ Cây 3→ Cây 4→ Cây 5→ Cây 6(ladder 1kb) https://drivers.vn/
Kết quả: ????
Kết luận chung:
Qua 3 thí nghiệm lây nhiễm phân tử DNA-A trên ớt, cà chua và cây chỉ thị,
chúng tôi không nhận thấy triệu chứng trên các cây lây nhiễm tuy nhiên khi kiểm
tra bằng PCR thì vẫn thấy sự có mặt của virus. Điều đó chứng tỏ tính hiệu quả của
cấu trúc xâm nhiễm. Giả thuyết, một mình phân tử DNA-A không thể gây bệnh
được mặc dù vẫn có quá trình tái sinh của phân tử DNA-A trong cây, có thể đối với
virus này thì cần sự có mặt của cả 2 phân tử DNA-A và DNA-B mới có thể hình
thành được triệu chứng. Chính vì thế mà chúng tối tiến hành thí nghiệm tiếp theo
liên quan đến tính gây bệnh của PepYLCVV bằng cách lây nhiễm đồng thời DNA-
A và DNA-B.
4.1.5 Tính gây bệnh của cả DNA-A & DNA-B (lây nhiễm bằng
agroinoculation)
Giống như kiểm tra tính gây bệnh trên phân tử DNA-A, chúng tôi tiến hành
kiểm tra tính gây bệnh của cả DNA-A và DNA-B với 3 thí nghiệm 1, 2, 3 lần lượt
trên cây cà chua, cây ớt và cây chỉ thị, chỉ khác khi kiểm tra PCR ngoài sử dụng
mồi đặc hiệu VNP93-A-F1/A-R1, chúng tôi còn sử dụng thêm mồi VNP93-B-
F1/B-R1.
Thí nghiệm 1: Lây nhiễm trên dòng cà chua Hồng Lan (T20). Tiến hành lặp
lại 4 lần, triệu chứng mỗi lần lây được theo dõi sau 1, 2, 3, 4 tuần sau khi lây lây
đồng thời các cây lây nhiễm sau 4 tuần lây được kiểm tra lại bằng PCR. Kết quả
được trình bày ở bảng 4.7 và hình 4.7.
Bảng 4.7. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và
DNA-B trên giống cà chua Hồng Lan (T20)
STT
Ngày lây
nhiễm
Số cây lây
Số cây có triệu
chứng
Số cây PCR dương/
số cây kiểm tra
DNA-A DNA-B
1 8/3/2014 15 0
2 12/4/2014 15 0 https://drivers.vn/
Kết luận chung:
Qua 3 thí nghiệm lây nhiễm phân tử DNA-A trên ớt, cà chua và cây chỉ thị,
chúng tôi không nhận thấy triệu chứng trên các cây lây nhiễm tuy nhiên khi kiểm
tra bằng PCR thì vẫn thấy sự có mặt của virus. Điều đó chứng tỏ tính hiệu quả của
cấu trúc xâm nhiễm. Giả thuyết, một mình phân tử DNA-A không thể gây bệnh
được mặc dù vẫn có quá trình tái sinh của phân tử DNA-A trong cây, có thể đối với
virus này thì cần sự có mặt của cả 2 phân tử DNA-A và DNA-B mới có thể hình
thành được triệu chứng. Chính vì thế mà chúng tối tiến hành thí nghiệm tiếp theo
liên quan đến tính gây bệnh của PepYLCVV bằng cách lây nhiễm đồng thời DNA-
A và DNA-B.
4.1.5 Tính gây bệnh của cả DNA-A & DNA-B (lây nhiễm bằng
agroinoculation)
Giống như kiểm tra tính gây bệnh trên phân tử DNA-A, chúng tôi tiến hành
kiểm tra tính gây bệnh của cả DNA-A và DNA-B với 3 thí nghiệm 1, 2, 3 lần lượt
trên cây cà chua, cây ớt và cây chỉ thị, chỉ khác khi kiểm tra PCR ngoài sử dụng
mồi đặc hiệu VNP93-A-F1/A-R1, chúng tôi còn sử dụng thêm mồi VNP93-B-
F1/B-R1.
Thí nghiệm 1: Lây nhiễm trên dòng cà chua Hồng Lan (T20). Tiến hành lặp
lại 4 lần, triệu chứng mỗi lần lây được theo dõi sau 1, 2, 3, 4 tuần sau khi lây lây
đồng thời các cây lây nhiễm sau 4 tuần lây được kiểm tra lại bằng PCR. Kết quả
được trình bày ở bảng 4.7 và hình 4.7.
Bảng 4.7. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và
DNA-B trên giống cà chua Hồng Lan (T20)
STT
Ngày lây
nhiễm
Số cây lây
Số cây có triệu
chứng
Số cây PCR dương/
số cây kiểm tra
DNA-A DNA-B
1 8/3/2014 15 0
2 12/4/2014 15 0 https://drivers.vn/
3 24/4/2014 12 0
4 10/5/2014 12 0
Ghi chú: Phản ứng PCR dương (+); Phản ứng PCR âm (-); ĐC: Đối chứng
Hình 4.7. PCR phát hiện DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV trên cà chua
Hồng Lan (T20) . Từ trái qua phải tương ứng.
Thí nghiệm 2: Lây nhiễm trên ớt: Lây trên giống ớt mẫn cảm Hiểm Lai F1-
207. Tiến hành lặp lại 3 lần, theo dõi tuần 1, 2, 3, 4 sau lây lây đồng thời các cây
lây nhiễm được kiểm tra lại bằng PCR sau 4 tuần lây nhiễm. Kết quả được trình
bày ở bảng 5.
Bảng 4.8. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và
DNA-B trên giống ớt Hiểm Lai F1-207
STT
Ngày lây
nhiễm
Số cây lây
Số cây có triệu
chứng
Số cây PCR dương/
số cây kiểm tra
DNA-A DNA-B
1 12/4/2014 15 0
2 24/4/2014 12 0
3 10/5/2014 12 0
Ghi chú: PCR (+): Phản ứng PCR dương.
Hình 4.8. PCR phát hiện DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV trên ớt Hiểm Lai
F1-207 . Từ trái qua phải tương ứng.
https://drivers.vn/
4 10/5/2014 12 0
Ghi chú: Phản ứng PCR dương (+); Phản ứng PCR âm (-); ĐC: Đối chứng
Hình 4.7. PCR phát hiện DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV trên cà chua
Hồng Lan (T20) . Từ trái qua phải tương ứng.
Thí nghiệm 2: Lây nhiễm trên ớt: Lây trên giống ớt mẫn cảm Hiểm Lai F1-
207. Tiến hành lặp lại 3 lần, theo dõi tuần 1, 2, 3, 4 sau lây lây đồng thời các cây
lây nhiễm được kiểm tra lại bằng PCR sau 4 tuần lây nhiễm. Kết quả được trình
bày ở bảng 5.
Bảng 4.8. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và
DNA-B trên giống ớt Hiểm Lai F1-207
STT
Ngày lây
nhiễm
Số cây lây
Số cây có triệu
chứng
Số cây PCR dương/
số cây kiểm tra
DNA-A DNA-B
1 12/4/2014 15 0
2 24/4/2014 12 0
3 10/5/2014 12 0
Ghi chú: PCR (+): Phản ứng PCR dương.
Hình 4.8. PCR phát hiện DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV trên ớt Hiểm Lai
F1-207 . Từ trái qua phải tương ứng.
https://drivers.vn/
Thí nghiệm 3: Lây nhiễm trên cây 3 giống thuốc lá (N. benthamaiana, N.
tabacum cv. Samsun, N. tabacum cv. K326), thuốc lào N.Glutinosa và hoa ngủ sắc
(Ageratum conyzoides). Tiến hành lặp lại 3 lần, triệu chứng được theo dõi sau 1,
2, 3, 4 tuần sau lây đồng thời sau 4 tuần lây nhiễm, chúng tôi tiến hành PCR để
kiểm tra sự có mặt DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV trên các cây lây sử dụng
cặp mồi VNP93-A-F1/R1, VNP93-B-F1/R1. Kết quả được trình bày ở bảng 4.9,
hình 4.9
Bảng 4.9. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và
DNA-B trên cây chỉ thị.
Cây
Lần lây nhiễn thứ 1 Lần lây nhiễn thứ 2 Lần lây nhiễn thứ 3
Triệu
chứng
PCR (+)
Triệu
chứng
PCR
(+)
Triệu
chứng
PCR
(+)
DNA-
A
DNA-
B
DNA-
A
DNA-
B
DNA-
A
DNA-
B
Nicotiana
benthamiana
0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
N. tabacum
cv. K326
0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
N. tabacum
cv. Samsun
0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
N. glutinosa 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
Ageratum
conyzoides
0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
Ghi chú: Phản ứng PCR dương (+); Phản ứng PCR âm (-); ĐC: Đối chứng
Hình 4.9. PCR phát hiện DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV trên các cây chỉ
thị . Từ trái qua phải tương ứng.
https://drivers.vn/
tabacum cv. Samsun, N. tabacum cv. K326), thuốc lào N.Glutinosa và hoa ngủ sắc
(Ageratum conyzoides). Tiến hành lặp lại 3 lần, triệu chứng được theo dõi sau 1,
2, 3, 4 tuần sau lây đồng thời sau 4 tuần lây nhiễm, chúng tôi tiến hành PCR để
kiểm tra sự có mặt DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV trên các cây lây sử dụng
cặp mồi VNP93-A-F1/R1, VNP93-B-F1/R1. Kết quả được trình bày ở bảng 4.9,
hình 4.9
Bảng 4.9. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và
DNA-B trên cây chỉ thị.
Cây
Lần lây nhiễn thứ 1 Lần lây nhiễn thứ 2 Lần lây nhiễn thứ 3
Triệu
chứng
PCR (+)
Triệu
chứng
PCR
(+)
Triệu
chứng
PCR
(+)
DNA-
A
DNA-
B
DNA-
A
DNA-
B
DNA-
A
DNA-
B
Nicotiana
benthamiana
0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
N. tabacum
cv. K326
0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
N. tabacum
cv. Samsun
0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
N. glutinosa 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
Ageratum
conyzoides
0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
Ghi chú: Phản ứng PCR dương (+); Phản ứng PCR âm (-); ĐC: Đối chứng
Hình 4.9. PCR phát hiện DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV trên các cây chỉ
thị . Từ trái qua phải tương ứng.
https://drivers.vn/
Kết quả lây nhiễm trên cũng gợi ý là agroinoculation có thể phù hợp để đánh
giá tính gây bệnh nhưng không phù hợp để đánh giá tính kháng khi tỷ lệ nhiễm cao
là yêu cầu bắt buộc.
Kết luận
Như vậy, từ 2 thí nghiệm đánh giá tính gây bệnh của chỉ phân tử DNA-A và
của cả phân tử DNA-A và DNA-B. Chúng tôi nhận thấy rằng, việc đánh giá tính
gây bệnh trên ớt bằng agroinoculation chưa đem lại hiệu quả do không quan sát
thấy triệu chứng nhưng khi chúng tôi tiến hành kiểm tra PCR thì đều phản ứng (+)
chứng tỏ sự tái sinh của virus vẫn xảy ra. Nguyên nhân của việc không hình thành
triệu chứng có thể do:
- Thí nghiệm tiến hành trong môi trường không thích hợp.
- Giống cây có khả năng kháng bệnh.
- Clone có thể vỡ khung dẫn đến không tương tác nên cây không biểu hiện
triệu chứng mặc dù trong cây virus vẫn tái sinh.
4.2 Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo
dùng bọ phấn
Do PeYLCVV được phát hiện đầu tiên ở cây cà chua và ớt tại Đà Nẵng, đồng
thời gần đây chúng tôi phát hiện thấy virus này trên ruộng ớt và cà tím tại Đồng
Tháp. Vậy một câu hỏi đặt ra là liệu nguồn bệnh PepYLCVNV từ trên cà chua có
lây sang được cây ớt hay không và ngược lại, và liệu PepYLCVNV có lan truyền
nhờ bọ phấn nhờ các begomovirus khác.
Với những mục đích đó, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm thử khả năng lan
truyền của PepYLCVNV trên cây ớt và cà tím bằng côn trùng môi giới là bọ phấn
(B. tabaci) trên hai nguồn bệnh khác nhau trên cây cà tím và cây ớt, sau khi lây 2
ngày tất cả cây thí nghiệm được xử lý bằng thuốc trừ côn trùng chích hút và 20
ngày sau lây tiến hành thu mẫu lá đem kiểm tra bằng phản ứng PCR. Nguồn bệnh
chúng tôi sử dụng trong thí nghiệm là cây cà tím và cây ớt nhiễm PepYLCVNV,
được chạy PCR trước khi lây nhiễm, để đảm bảo rằng cây cà tím và cây ớt dây https://drivers.vn/
giá tính gây bệnh nhưng không phù hợp để đánh giá tính kháng khi tỷ lệ nhiễm cao
là yêu cầu bắt buộc.
Kết luận
Như vậy, từ 2 thí nghiệm đánh giá tính gây bệnh của chỉ phân tử DNA-A và
của cả phân tử DNA-A và DNA-B. Chúng tôi nhận thấy rằng, việc đánh giá tính
gây bệnh trên ớt bằng agroinoculation chưa đem lại hiệu quả do không quan sát
thấy triệu chứng nhưng khi chúng tôi tiến hành kiểm tra PCR thì đều phản ứng (+)
chứng tỏ sự tái sinh của virus vẫn xảy ra. Nguyên nhân của việc không hình thành
triệu chứng có thể do:
- Thí nghiệm tiến hành trong môi trường không thích hợp.
- Giống cây có khả năng kháng bệnh.
- Clone có thể vỡ khung dẫn đến không tương tác nên cây không biểu hiện
triệu chứng mặc dù trong cây virus vẫn tái sinh.
4.2 Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo
dùng bọ phấn
Do PeYLCVV được phát hiện đầu tiên ở cây cà chua và ớt tại Đà Nẵng, đồng
thời gần đây chúng tôi phát hiện thấy virus này trên ruộng ớt và cà tím tại Đồng
Tháp. Vậy một câu hỏi đặt ra là liệu nguồn bệnh PepYLCVNV từ trên cà chua có
lây sang được cây ớt hay không và ngược lại, và liệu PepYLCVNV có lan truyền
nhờ bọ phấn nhờ các begomovirus khác.
Với những mục đích đó, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm thử khả năng lan
truyền của PepYLCVNV trên cây ớt và cà tím bằng côn trùng môi giới là bọ phấn
(B. tabaci) trên hai nguồn bệnh khác nhau trên cây cà tím và cây ớt, sau khi lây 2
ngày tất cả cây thí nghiệm được xử lý bằng thuốc trừ côn trùng chích hút và 20
ngày sau lây tiến hành thu mẫu lá đem kiểm tra bằng phản ứng PCR. Nguồn bệnh
chúng tôi sử dụng trong thí nghiệm là cây cà tím và cây ớt nhiễm PepYLCVNV,
được chạy PCR trước khi lây nhiễm, để đảm bảo rằng cây cà tím và cây ớt dây https://drivers.vn/
nguồn chắc chắn nhiễm PepYLCVNV. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 4.10 và
4.11.
Hình 4.10. Kết quả điện di chạy PCR trên cà tím với mồi VNP93-A-F1/R1,
VNP93-B-F1/R1
M → VNP1500 → VNP1501 đối chứng âm → VNP1500-1 → VNP1500-2
→ VNP1500-3 → VNP1500
Hình 4.11. Kết quả điện di chạy PCR trên ớt với mồi VNP93-A-F1/R1, VNP93-
B-F1/R1
M → VNP1500 → VNP1500 → VNP1500 → VNP1500
https://drivers.vn/
4.11.
Hình 4.10. Kết quả điện di chạy PCR trên cà tím với mồi VNP93-A-F1/R1,
VNP93-B-F1/R1
M → VNP1500 → VNP1501 đối chứng âm → VNP1500-1 → VNP1500-2
→ VNP1500-3 → VNP1500
Hình 4.11. Kết quả điện di chạy PCR trên ớt với mồi VNP93-A-F1/R1, VNP93-
B-F1/R1
M → VNP1500 → VNP1500 → VNP1500 → VNP1500
https://drivers.vn/
4.2.1 Lây nhiễm PepYLCVNV bằng cây cà tím nguồn bệnh
Bảng 4.10. Kết quả lây nhiễm PepYLCV bằng bọ phấn trên cây cà tím
nguồn bệnh
STT
Cây thí
nghiệm
Số
cây
lây
Số cây
có triệu
chứng
Tỷ lệ
bệnh
(%)
Triệu chứng
sau lây
(4 tuần)
PCR
DNA-
A
DNA-
B
1
Cà chua
T20
10 10 100
Xoăn vàng
ngọn
+ +
2 Cà tím 10 10 100 Khảm vàng + +
3
Ớt (hiểm
lai F1)
10 10 100 Khảm nhăn + +
Ghi chú: Phản ứng PCR dương (+); Phản ứng PCR âm (-); ĐC: Đối chứng https://drivers.vn/
Bảng 4.10. Kết quả lây nhiễm PepYLCV bằng bọ phấn trên cây cà tím
nguồn bệnh
STT
Cây thí
nghiệm
Số
cây
lây
Số cây
có triệu
chứng
Tỷ lệ
bệnh
(%)
Triệu chứng
sau lây
(4 tuần)
PCR
DNA-
A
DNA-
B
1
Cà chua
T20
10 10 100
Xoăn vàng
ngọn
+ +
2 Cà tím 10 10 100 Khảm vàng + +
3
Ớt (hiểm
lai F1)
10 10 100 Khảm nhăn + +
Ghi chú: Phản ứng PCR dương (+); Phản ứng PCR âm (-); ĐC: Đối chứng https://drivers.vn/
4.2.2 Lây nhiễm PepYLCVNV bằng cây ớt nguồn bệnh
Bảng 4.11. Kết quả lây nhiễm PepYLCV bằng bọ phấn trên cây ớt nguồn
bệnh
STT
Cây thí
nghiệm
Số
cây
lây
Số cây
có
triệu
chứng
Tỷ lệ
bệnh
(%)
Triệu chứng sau
lây (4 tuần)
PCR
DNA-
A
DNA-
B
1
Cà chua
T20
10
10
100
Xoăn vàng ngọn + -
2 Cà tím 10 0 0
Không có triệu
chứng
- -
3
Ớt (hiểm
lai F1)
10 10 100 Khảm nhăn + -
Ghi chú : Phản ứng PCR dương (+) ; Phản ứng PCR âm (-) ; ĐC : Đối
chứng
Như vậy, qua 2 thí nghiệm trên chúng tôi nhận thấy rằng đối với
virus trên cây ớt ở Cao Lãnh-Đồng Tháp có khả năng lây nhiễm trên cà
chua nhưng không có khả năng gây bệnh trên cà tím, ngược lại đối với
begomovirus gây bệnh trên cà tím ở Thanh Bình-Đồng Tháp (triệu chứng
khảm vàng điển hình) lại hoàn toàn có thể lây nhiễm sang ớt và cà chua. https://drivers.vn/
Bảng 4.11. Kết quả lây nhiễm PepYLCV bằng bọ phấn trên cây ớt nguồn
bệnh
STT
Cây thí
nghiệm
Số
cây
lây
Số cây
có
triệu
chứng
Tỷ lệ
bệnh
(%)
Triệu chứng sau
lây (4 tuần)
PCR
DNA-
A
DNA-
B
1
Cà chua
T20
10
10
100
Xoăn vàng ngọn + -
2 Cà tím 10 0 0
Không có triệu
chứng
- -
3
Ớt (hiểm
lai F1)
10 10 100 Khảm nhăn + -
Ghi chú : Phản ứng PCR dương (+) ; Phản ứng PCR âm (-) ; ĐC : Đối
chứng
Như vậy, qua 2 thí nghiệm trên chúng tôi nhận thấy rằng đối với
virus trên cây ớt ở Cao Lãnh-Đồng Tháp có khả năng lây nhiễm trên cà
chua nhưng không có khả năng gây bệnh trên cà tím, ngược lại đối với
begomovirus gây bệnh trên cà tím ở Thanh Bình-Đồng Tháp (triệu chứng
khảm vàng điển hình) lại hoàn toàn có thể lây nhiễm sang ớt và cà chua. https://drivers.vn/
Dường như, 2 begomovirus gây bệnh trên cà tím và ớt thu được tại Đồng
Tháp là 2 loài khác nhau.
4.3 Đánh giá tính kháng của PepYLCVNV trên tập đoàn giống ớt của
AVRDC
Đánh giá dựa vào cấp bệnh
Mức độ biểu hiện triệu chứng cũng là tiêu chí quan trọng đánh giá tính kháng.
Chúng tôi đánh giá dựa trên số liệu đánh giá được từ 2 lần điều tra ngày 6/5 và 11/6
năm 2014. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.10 và Hình 4.13.
Bảng 4.12. Cấp bệnh xoăn vàng lá của các giống ớt AVRDC
STT Giống
Ngày 6/5/2014 Ngày 21/5/2014
n
Số cây
bị bệnh
Cấp
bệnh
(TB)
Cấp
bệnh
(SE)
n
Số cây
bị
bệnh
Cấp
bệnh
(TB)
Cấp
bệnh
(SE)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
https://drivers.vn/
Tháp là 2 loài khác nhau.
4.3 Đánh giá tính kháng của PepYLCVNV trên tập đoàn giống ớt của
AVRDC
Đánh giá dựa vào cấp bệnh
Mức độ biểu hiện triệu chứng cũng là tiêu chí quan trọng đánh giá tính kháng.
Chúng tôi đánh giá dựa trên số liệu đánh giá được từ 2 lần điều tra ngày 6/5 và 11/6
năm 2014. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.10 và Hình 4.13.
Bảng 4.12. Cấp bệnh xoăn vàng lá của các giống ớt AVRDC
STT Giống
Ngày 6/5/2014 Ngày 21/5/2014
n
Số cây
bị bệnh
Cấp
bệnh
(TB)
Cấp
bệnh
(SE)
n
Số cây
bị
bệnh
Cấp
bệnh
(TB)
Cấp
bệnh
(SE)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
https://drivers.vn/
Chú thích: n : tổng số cây điều tra; TB : trung bình; SE (standard eror) : sai số
chuẩn ; (-) không tính được SE, S : nhiễm ; R : kháng
Nhận xét: ????
4.3.1 Thiết kế cấu trúc xâm nhiễm của PepYLVNV
4.3.1.1 Mục đích và phương pháp
Việc lây nhiễm bằng Agroinoculation trên cà chua, ớt, và cây chỉ thị không
biểu hiện triệu chứng nhưng kiểm tra PCR đều mang phản ứng PCR dương (+).
Cùng với đó chúng tôi sử dụng cây cà tím, ớt nguồn mang từ Đà Nẵng về đem lây
cho ớt, cà chua, cà tím bằng bọ phấn đều xuất hiện biểu hiện bệnh. Điều đó dẫn
tới giải thuyết: clone có thể vỡ khung dẫn đến không biểu hiện được triệu chứng
mặc dù trong cây virus vẫn tái sinh. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành xây dựng lại
cấu trúc xân nhiễm để đánh giá chính xác khả năng gây bệnh, đặc trưng sinh học
của virus này.
Mục tiêu của phần nghiên cứu này là ứng dụng kỹ thuật RCA (Rolling circle
amplification) để phân lập và xây dựng cấu trúc xâm nhiễm của các phân tử DNA-
A và DNA-B để phục vụ việc đánh giá tính gây bệnh, đặc trưng sinh học cũng như
sẽ dùng cấu trúc xâm nhiễm này để giải trình tự toàn bộ bộ gen virus để đánh giá
đặc trưng phân tử của virus này.
Cấu trúc xâm nhiễm bao gồm bộ gen virus DNA-A,DNA-B được thiết kế
chứa 2 stem-loop để phục vụ việc tái sinh bộ gen hoàn chỉnh của virus và được nối
vào 1 vị trí nằm giữa bờ trái và bờ phải của 1 vector nhị nguyên. Sau đó được
chuyển vào E.coli để nhân dòng là chọn lọc cấu trúc của DNA-A và DNA-B và
tiếp theo đó cấu trúc xâm nhiễm sẽ được biến nạp vào tế bào vi khuẩn A.
Tumerfaciens để tiến hành đánh giá tính gây bệnh sử dụng kỹ thuật
Agroinoculation.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nhân bộ gen DNA virus dưới
dạng các multimer bằng kỹ thuật RCA. Sản phẩm RCA sau đó được cắt không
triệt để bằng enzyme cắt giới hạn để thu dạng dimer của phân tử DNA. Các phân
tử dimer này, có kích thước ~ 5,4 kb, được nối vào vector nhị nguyên pCAMBIA-
2300. Cuối cùng chuyển vector tái tổ hợp này vào vi khuẩn E.coli và vi khuẩn A. https://drivers.vn/
chuẩn ; (-) không tính được SE, S : nhiễm ; R : kháng
Nhận xét: ????
4.3.1 Thiết kế cấu trúc xâm nhiễm của PepYLVNV
4.3.1.1 Mục đích và phương pháp
Việc lây nhiễm bằng Agroinoculation trên cà chua, ớt, và cây chỉ thị không
biểu hiện triệu chứng nhưng kiểm tra PCR đều mang phản ứng PCR dương (+).
Cùng với đó chúng tôi sử dụng cây cà tím, ớt nguồn mang từ Đà Nẵng về đem lây
cho ớt, cà chua, cà tím bằng bọ phấn đều xuất hiện biểu hiện bệnh. Điều đó dẫn
tới giải thuyết: clone có thể vỡ khung dẫn đến không biểu hiện được triệu chứng
mặc dù trong cây virus vẫn tái sinh. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành xây dựng lại
cấu trúc xân nhiễm để đánh giá chính xác khả năng gây bệnh, đặc trưng sinh học
của virus này.
Mục tiêu của phần nghiên cứu này là ứng dụng kỹ thuật RCA (Rolling circle
amplification) để phân lập và xây dựng cấu trúc xâm nhiễm của các phân tử DNA-
A và DNA-B để phục vụ việc đánh giá tính gây bệnh, đặc trưng sinh học cũng như
sẽ dùng cấu trúc xâm nhiễm này để giải trình tự toàn bộ bộ gen virus để đánh giá
đặc trưng phân tử của virus này.
Cấu trúc xâm nhiễm bao gồm bộ gen virus DNA-A,DNA-B được thiết kế
chứa 2 stem-loop để phục vụ việc tái sinh bộ gen hoàn chỉnh của virus và được nối
vào 1 vị trí nằm giữa bờ trái và bờ phải của 1 vector nhị nguyên. Sau đó được
chuyển vào E.coli để nhân dòng là chọn lọc cấu trúc của DNA-A và DNA-B và
tiếp theo đó cấu trúc xâm nhiễm sẽ được biến nạp vào tế bào vi khuẩn A.
Tumerfaciens để tiến hành đánh giá tính gây bệnh sử dụng kỹ thuật
Agroinoculation.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nhân bộ gen DNA virus dưới
dạng các multimer bằng kỹ thuật RCA. Sản phẩm RCA sau đó được cắt không
triệt để bằng enzyme cắt giới hạn để thu dạng dimer của phân tử DNA. Các phân
tử dimer này, có kích thước ~ 5,4 kb, được nối vào vector nhị nguyên pCAMBIA-
2300. Cuối cùng chuyển vector tái tổ hợp này vào vi khuẩn E.coli và vi khuẩn A. https://drivers.vn/
Tumerfacien.
Hình 4.12. Sơ đồ các bước xây dựng cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV
sử dụng kỹ thuật RCA
Bảng 4.12. Tóm tắt các bước xây dựng cấu trúc xâm nhiễm
Bước chuẩn bị Quá trình chuẩn bị
Chuẩn bị vector
pCAMBIA2300
Biến nạp pCAMBIA2300 vào E.coli XL1-Blue sau đó
minipreps thu nguồn pCAMBIA2300 (kiểm tra lại bằng mồi
đặc hiệu vector)
Mở vòng vector bằng BamHI Desphosphoryl
pCAMBIA2300 bằng Alkaline photphase và tinh sạch
Phản ứng RCA
Phản ứng RCA sử dụng exo-hexamer primer và Phi 29
polymerase
Thu dimer của
bộ gen
PepYLCVNV
Cắt không hoàn toàn sản phẩm RCA bằng enzyme BamHI
sau đó điện di,thôi gel thu sản phẩm kích thước 5,4kb
Cấu trúc xâm
nhiễm của
PepYLCVNV
Nối dimer thu được với vector pCAMBIA đã mở vòng và
dephosphoryl hóa
Biến nạp vào E.coli XL1-Blue
Chọn dòng mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-A, DNA-B
Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào Agrobacterium để tiến
hành Agroinoculation và giải trình tự để đánh giá đặc trưng
phân tử https://drivers.vn/
Hình 4.12. Sơ đồ các bước xây dựng cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV
sử dụng kỹ thuật RCA
Bảng 4.12. Tóm tắt các bước xây dựng cấu trúc xâm nhiễm
Bước chuẩn bị Quá trình chuẩn bị
Chuẩn bị vector
pCAMBIA2300
Biến nạp pCAMBIA2300 vào E.coli XL1-Blue sau đó
minipreps thu nguồn pCAMBIA2300 (kiểm tra lại bằng mồi
đặc hiệu vector)
Mở vòng vector bằng BamHI Desphosphoryl
pCAMBIA2300 bằng Alkaline photphase và tinh sạch
Phản ứng RCA
Phản ứng RCA sử dụng exo-hexamer primer và Phi 29
polymerase
Thu dimer của
bộ gen
PepYLCVNV
Cắt không hoàn toàn sản phẩm RCA bằng enzyme BamHI
sau đó điện di,thôi gel thu sản phẩm kích thước 5,4kb
Cấu trúc xâm
nhiễm của
PepYLCVNV
Nối dimer thu được với vector pCAMBIA đã mở vòng và
dephosphoryl hóa
Biến nạp vào E.coli XL1-Blue
Chọn dòng mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-A, DNA-B
Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào Agrobacterium để tiến
hành Agroinoculation và giải trình tự để đánh giá đặc trưng
phân tử https://drivers.vn/
4.3.2 Chuẩn bị vector pCAMBIA2300
Vector nhị nguyên được sử dụng để làm cấu trúc xâm nhiễm là vector
pCAMBIA2300 được tạo ra bởi viện CAMBIA.pCAMBIA-2300 là vector cho
chuyển gen thực vật và được sử dụng tốt trong thí nghiệm agroinoculation.
Hình 4.13. Sơ đồ vector pCAMBIA2300
Vector pCAMBIA2300 dạng khô được bảo quản ở tủ -80
o
C được hòa loãng
với nước và biến nạp vào E.coli chủng XL1-Blue sử dụng phương pháp sốc nhiệt
và được cấy trải trên môi trường LB với tetracyline và kanamycine để chọc lọc các
dòng mang cấu trúc xâm nhiễm.
Sau khi ủ 18h ở 37
o
C thì có 200 khuẩn lạc đơn mọc trên môi trường LB với
đặc điểm đặc trưng của E.coli ( màu trắng sữa, có viền bao quanh, bề mặt trơn).
Một số khuẩn lạc đơn được chuyển qua nuôi lắc trong ống nghiệm, mỗi ống
nghiệm có 5ml môi trường LB lỏng chứa tetracyline và kanamycine, nuôi lắc 200
rpm. Sau đó plasmid sẽ được tinh chiết bằng Purelink quick plasmid miniprep kit
(Invitrogen), một lượng nhỏ sản phẩm minipreps sẽ được kiểm tra bằng PCR sử
dụng cặp mồi đặc hiệu của vector pCAMBIA2300 là mồi pCAMseqF1 và
pCAMseqR.
Phản ứng PCR được thực hiện với điều kiện sau: khởi đầu biến tính ở 94
0
C
trong 4 phút; tiếp theo là 35 chu trình PCR (biến tính ở 94
0
C trong 40 giây, gắn https://drivers.vn/
Vector nhị nguyên được sử dụng để làm cấu trúc xâm nhiễm là vector
pCAMBIA2300 được tạo ra bởi viện CAMBIA.pCAMBIA-2300 là vector cho
chuyển gen thực vật và được sử dụng tốt trong thí nghiệm agroinoculation.
Hình 4.13. Sơ đồ vector pCAMBIA2300
Vector pCAMBIA2300 dạng khô được bảo quản ở tủ -80
o
C được hòa loãng
với nước và biến nạp vào E.coli chủng XL1-Blue sử dụng phương pháp sốc nhiệt
và được cấy trải trên môi trường LB với tetracyline và kanamycine để chọc lọc các
dòng mang cấu trúc xâm nhiễm.
Sau khi ủ 18h ở 37
o
C thì có 200 khuẩn lạc đơn mọc trên môi trường LB với
đặc điểm đặc trưng của E.coli ( màu trắng sữa, có viền bao quanh, bề mặt trơn).
Một số khuẩn lạc đơn được chuyển qua nuôi lắc trong ống nghiệm, mỗi ống
nghiệm có 5ml môi trường LB lỏng chứa tetracyline và kanamycine, nuôi lắc 200
rpm. Sau đó plasmid sẽ được tinh chiết bằng Purelink quick plasmid miniprep kit
(Invitrogen), một lượng nhỏ sản phẩm minipreps sẽ được kiểm tra bằng PCR sử
dụng cặp mồi đặc hiệu của vector pCAMBIA2300 là mồi pCAMseqF1 và
pCAMseqR.
Phản ứng PCR được thực hiện với điều kiện sau: khởi đầu biến tính ở 94
0
C
trong 4 phút; tiếp theo là 35 chu trình PCR (biến tính ở 94
0
C trong 40 giây, gắn https://drivers.vn/
mồi ở 50
0
C trong 35 giây và tổng hợp sợi ở 72
0
C trong 1 phút 30 giây). Phản ứng
được kết thúc với 5 phút ở 72
0
C.Sau đó điện di kiểm tra sản phẩm, kích thước sản
phẩm PCR ~ 1,4kb, chứng tỏ đã thành công trong việc chuẩn bị vector
pCAMBIA2300 để làm cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV.
Hình 4.14.Điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid sử dụng
cặp mồi pCAMseqF1/R
M: Ladder 1kb, 1-2-3-4 lần lượt plasmid được tinh chiết từ 3 clone bất kỳ
sau khi biến nạp vector pCAMBIA2300
Vector pCAMBIA2300 sau khi được tinh chiết và kiểm tra sẽ được mở vòng
bằng enzyme Bam HI sau đó desphosphoryl hóa bằng alkaline phosphase và được
tinh sạch bằng Purelink PCR purification kit (Invitrogen) (Hình 4.15)
Hình 4.15. Điện di sản phẩm khi mở vòng pCAMBIA 2300 bằng BamHI
4.3.2.1 Phản ứng RCA để nhân dòng toàn bộ bộ gen PepYLCVNV
Mẫu VNP1500 thu được tại TTBCNĐ-ĐHNNHN được chọn để nhân dòng
toàn bộ bộ gen của PepYLCVNV bằng phản ứng RCA.Mẫu này là mẫu ớt, giống
Hiểm Lai F1-207, được gieo tại trung tâm trồng chậu 27/2 đã được lây nhiễm bằng
bọ phấn từ 5 cây ớt bị bệnh xoăn vàng lá do Đức Anh – CNSH54 thu thập tại Cao https://drivers.vn/
0
C trong 35 giây và tổng hợp sợi ở 72
0
C trong 1 phút 30 giây). Phản ứng
được kết thúc với 5 phút ở 72
0
C.Sau đó điện di kiểm tra sản phẩm, kích thước sản
phẩm PCR ~ 1,4kb, chứng tỏ đã thành công trong việc chuẩn bị vector
pCAMBIA2300 để làm cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV.
Hình 4.14.Điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid sử dụng
cặp mồi pCAMseqF1/R
M: Ladder 1kb, 1-2-3-4 lần lượt plasmid được tinh chiết từ 3 clone bất kỳ
sau khi biến nạp vector pCAMBIA2300
Vector pCAMBIA2300 sau khi được tinh chiết và kiểm tra sẽ được mở vòng
bằng enzyme Bam HI sau đó desphosphoryl hóa bằng alkaline phosphase và được
tinh sạch bằng Purelink PCR purification kit (Invitrogen) (Hình 4.15)
Hình 4.15. Điện di sản phẩm khi mở vòng pCAMBIA 2300 bằng BamHI
4.3.2.1 Phản ứng RCA để nhân dòng toàn bộ bộ gen PepYLCVNV
Mẫu VNP1500 thu được tại TTBCNĐ-ĐHNNHN được chọn để nhân dòng
toàn bộ bộ gen của PepYLCVNV bằng phản ứng RCA.Mẫu này là mẫu ớt, giống
Hiểm Lai F1-207, được gieo tại trung tâm trồng chậu 27/2 đã được lây nhiễm bằng
bọ phấn từ 5 cây ớt bị bệnh xoăn vàng lá do Đức Anh – CNSH54 thu thập tại Cao https://drivers.vn/
lãnh-Đồng Tháp. 5 cây ớt đã kiểm tra PCR đều nhiểm những chỉ phản ứng PCR
dương với mối đặc hiệu PepYLV DNA-A. Điều đó đặt ra 2 giả thuyết:
- Chỉ có DNA-A
- DNA-B của virus khác
Chúng tôi tiến hành phản ứng RCA sử dụng 2 phương pháp chiết DNA:
Phương pháp CTAB và phương pháp chiết DNA sử dụng kit chuyện dụng nhằm
tăng khả năng thành công khi xử lý sản phẩm RCA bằng Bam HI
Bảng 4.13. Hiệu quả xử lý sản phẩm RCA với các phương pháp
chiết khác nhau
STT Mẫu Phương pháp chiết
Cắt hoàn toàn
sản phẩm RCA
bằng BamHI
1 VNP1500 CTAB ~3kb,2kb
2 VNP1500
AccuPrep GMO(Plant) Genomic
DNA
Extraction Kit (Bioneer)
~3kb,2kb
Chúng tôi nhận thất sử dụng phương pháp chiết sử dụng Kit Temphiliph hiệu
quả tốt hơn so với phương pháp chiết CTAB. Chính vì vậy, chúng tôi quyết định
chọn phương pháp chiết DNA bằng Kit Temphilip để làm khuôn cho phản ứng
RCA.Mẫu được chọn là mẫu ớt thu tại TTBCNĐ-ĐHNNHN được lây nhiễm bằng
bọ phấn từ 5 cây ớt với những triệu chứng điển hình của PepYLCV đã được kiểm
tra lại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi mới thiết kế là mồi đặc hiệu phát hiện
PepYLCV là VNP93-A-F1/R1 và VNP93-B-F1/R1
Hình 4.16. PCR kiểm tra mẫu VNP1500 chiết bằng CTAB, Kit
Tephiliph
DNA từ mẫu ớt VNP1500 sẽ được dùng làm khuôn cho phản ứng RCA.Phản
ứng RCA sẽ nhân toàn bộ bộ gen của các begomovirus theo cơ chế vòng lăn tương
tự quá trình tái sinh của virus ngoài tự nhiên thành dạng multimer nhờ enzyme Phi
29 polymerase và mồi exo-random hexamer.
https://drivers.vn/
dương với mối đặc hiệu PepYLV DNA-A. Điều đó đặt ra 2 giả thuyết:
- Chỉ có DNA-A
- DNA-B của virus khác
Chúng tôi tiến hành phản ứng RCA sử dụng 2 phương pháp chiết DNA:
Phương pháp CTAB và phương pháp chiết DNA sử dụng kit chuyện dụng nhằm
tăng khả năng thành công khi xử lý sản phẩm RCA bằng Bam HI
Bảng 4.13. Hiệu quả xử lý sản phẩm RCA với các phương pháp
chiết khác nhau
STT Mẫu Phương pháp chiết
Cắt hoàn toàn
sản phẩm RCA
bằng BamHI
1 VNP1500 CTAB ~3kb,2kb
2 VNP1500
AccuPrep GMO(Plant) Genomic
DNA
Extraction Kit (Bioneer)
~3kb,2kb
Chúng tôi nhận thất sử dụng phương pháp chiết sử dụng Kit Temphiliph hiệu
quả tốt hơn so với phương pháp chiết CTAB. Chính vì vậy, chúng tôi quyết định
chọn phương pháp chiết DNA bằng Kit Temphilip để làm khuôn cho phản ứng
RCA.Mẫu được chọn là mẫu ớt thu tại TTBCNĐ-ĐHNNHN được lây nhiễm bằng
bọ phấn từ 5 cây ớt với những triệu chứng điển hình của PepYLCV đã được kiểm
tra lại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi mới thiết kế là mồi đặc hiệu phát hiện
PepYLCV là VNP93-A-F1/R1 và VNP93-B-F1/R1
Hình 4.16. PCR kiểm tra mẫu VNP1500 chiết bằng CTAB, Kit
Tephiliph
DNA từ mẫu ớt VNP1500 sẽ được dùng làm khuôn cho phản ứng RCA.Phản
ứng RCA sẽ nhân toàn bộ bộ gen của các begomovirus theo cơ chế vòng lăn tương
tự quá trình tái sinh của virus ngoài tự nhiên thành dạng multimer nhờ enzyme Phi
29 polymerase và mồi exo-random hexamer.
https://drivers.vn/
4.3.2.2 Tối ưu hóa điều kiện cho phản ứng cắt không hoàn toàn sản phẩm RCA
Sau khi thực hiện phản ứng RCA,chúng tôi xử lý sản phẩm RCA bằng cách
cắt hoàn toàn bằng enzyme Bam HI 10 u/µl để chắc chắn rằng phản ứng RCA đã
nhân được bộ gen của virus.Thành phẩn của phản ứng cắt triệt để sản phẩm RCA
bao gồm 1 µl sản phẩm RCA,1 µl Bam HI 10 u/µl,1µl 10 X React3, 7 µl nước cất
invitro sau đó được ủ ở 37
o
C trong 1h.
Hình 4.17. Xử lý sản phẩm RCA mẫu VNP1500 bằng cách cắt hoàn toàn với
enzyme BamHI 10 u/µl
VNP1500→VNP1500→ Marker (ladder: 1kb)
Mục đích chính của việc xử lý sản phẩm RCA là thu được dimer, và để thu
được dimer chúng tôi tiến hành phản ứng cắt với việc thay đổi thời gian, nồng độ
enzyme và nhiệt độ.Chúng tôi tiến hành một loạt các thí nghiệm với các điều kiện
cắt khác nhau để xác định điều kiện cắt tốt nhất nhằm thu được sản phẩm có kích
thước ~ 5,4 kb (dimer).
Bảng 4.14. Tối ưu hóa điều kiện cho phản ứng cắt không hoàn toàn sản
phẩm RCA của PepYLCV
3kb
VNP1500 https://drivers.vn/
Sau khi thực hiện phản ứng RCA,chúng tôi xử lý sản phẩm RCA bằng cách
cắt hoàn toàn bằng enzyme Bam HI 10 u/µl để chắc chắn rằng phản ứng RCA đã
nhân được bộ gen của virus.Thành phẩn của phản ứng cắt triệt để sản phẩm RCA
bao gồm 1 µl sản phẩm RCA,1 µl Bam HI 10 u/µl,1µl 10 X React3, 7 µl nước cất
invitro sau đó được ủ ở 37
o
C trong 1h.
Hình 4.17. Xử lý sản phẩm RCA mẫu VNP1500 bằng cách cắt hoàn toàn với
enzyme BamHI 10 u/µl
VNP1500→VNP1500→ Marker (ladder: 1kb)
Mục đích chính của việc xử lý sản phẩm RCA là thu được dimer, và để thu
được dimer chúng tôi tiến hành phản ứng cắt với việc thay đổi thời gian, nồng độ
enzyme và nhiệt độ.Chúng tôi tiến hành một loạt các thí nghiệm với các điều kiện
cắt khác nhau để xác định điều kiện cắt tốt nhất nhằm thu được sản phẩm có kích
thước ~ 5,4 kb (dimer).
Bảng 4.14. Tối ưu hóa điều kiện cho phản ứng cắt không hoàn toàn sản
phẩm RCA của PepYLCV
3kb
VNP1500 https://drivers.vn/
CT
Nồng
độ
enzyme
Nhiệt
độ cắt
(
o
C)
Thơi
gian cắt
(phút)
Bất hoạt Sản phẩm cắt
1 10 u/µl 37 5 80
o
C/20’
Monomer và đoạn ngắn hơn
3kb
2 0.5 u/µl 37 3 80
o
C/20’ Trimer, dimer, monomer
3 0.2 u/µl 37 3 80
o
C/20’ Trimer, dimer, monomer
4 0.1 u/µl 37 25 80
o
C/20’ Trimer, dimer, monomer
5 0.05u/µl 37 15
80
o
C/20’ Không cắt
Hình 4.18. Xử lý sản phẩm RCA mẫu VNP1500 bằng cách cắt không hoàn
toàn với enzyme BamHI 0.2 u/µl.
Marker→VNP1500→VNP1500 (ladder: 1kb)
Như vậy chúng tôi đã chọn được nồng độ enzyme sử dụng tốt nhất để cắt
không hoàn toàn sản phẩm RCA ở nồng độ 0.2 u/µl, nhiệt độ tối ưu cho phản ứng
cắt là 37
o
C trong khoảng 3 phút để thu được dimer (5kb) cho việc thiết kế cấu trúc
xâm nhiễm của begomovirus.
4.3.2.3 .Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào E.coli
Sau khi tối ưu hóa điều kiện cắt không hoàn toàn sản phẩm RCA để thu được
dimer genome PepYLCV, băng 5kb được cắt từ gel agarose và được tinh chiết bằng
VNP1500
3kb
5kb https://drivers.vn/
Nồng
độ
enzyme
Nhiệt
độ cắt
(
o
C)
Thơi
gian cắt
(phút)
Bất hoạt Sản phẩm cắt
1 10 u/µl 37 5 80
o
C/20’
Monomer và đoạn ngắn hơn
3kb
2 0.5 u/µl 37 3 80
o
C/20’ Trimer, dimer, monomer
3 0.2 u/µl 37 3 80
o
C/20’ Trimer, dimer, monomer
4 0.1 u/µl 37 25 80
o
C/20’ Trimer, dimer, monomer
5 0.05u/µl 37 15
80
o
C/20’ Không cắt
Hình 4.18. Xử lý sản phẩm RCA mẫu VNP1500 bằng cách cắt không hoàn
toàn với enzyme BamHI 0.2 u/µl.
Marker→VNP1500→VNP1500 (ladder: 1kb)
Như vậy chúng tôi đã chọn được nồng độ enzyme sử dụng tốt nhất để cắt
không hoàn toàn sản phẩm RCA ở nồng độ 0.2 u/µl, nhiệt độ tối ưu cho phản ứng
cắt là 37
o
C trong khoảng 3 phút để thu được dimer (5kb) cho việc thiết kế cấu trúc
xâm nhiễm của begomovirus.
4.3.2.3 .Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào E.coli
Sau khi tối ưu hóa điều kiện cắt không hoàn toàn sản phẩm RCA để thu được
dimer genome PepYLCV, băng 5kb được cắt từ gel agarose và được tinh chiết bằng
VNP1500
3kb
5kb https://drivers.vn/
Accuprep Gel purification kit (Bioneer).Sản phẩm dimer được nối với vector
pCAMBIA2300 đã được mở vòng bằng Bam HI và được desphosphoryl hóa bằng
enzyme T4 Ligase (Fermentas) để hình thành cấu trúc xâm nhiễm.Sau đó sản phẩm
nối sẽ được biến nạp vào E.coli chủng XL1-Blue khả biến.
Trong quá trình biến nạp chúng tôi thu được 20 clone. Sau đó chúng tôi tiến
hành kiểm tra liệu đã có dimer genome của virus được nối vào trong vector hay
chưa. Có 2 phương pháp để kiểm tra đó là: Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu
VNP93-A-F1/R1 (mồi A) hoặc là phản ứng cắt kiểm tra sản phẩm nối sử dụng
enzyme cắt BamHI.
Tất cả khuẩn lạc đơn sẽ được nuôi lắc 200 rpm trong 5ml LB lỏng cộng với
kanamycine và tetracycline.Sau đó tinh chiết plasmid bằng phương pháp miniprep
(Sambrook, Fritsch et al., 1989).Sau khi thu được plasmid chúng tôi tiến hành kiểm
tra cả 20 clones bằng cách cắt bằng enzyme Bam HI để chắc chắn rằng có sản phẩm
nối trong vector pCAMBIA2300.
Hình 4.19. Kết quả biến nạp cấu trúc xâm nhiễm PepYLCV vào E.coli.
https://drivers.vn/
pCAMBIA2300 đã được mở vòng bằng Bam HI và được desphosphoryl hóa bằng
enzyme T4 Ligase (Fermentas) để hình thành cấu trúc xâm nhiễm.Sau đó sản phẩm
nối sẽ được biến nạp vào E.coli chủng XL1-Blue khả biến.
Trong quá trình biến nạp chúng tôi thu được 20 clone. Sau đó chúng tôi tiến
hành kiểm tra liệu đã có dimer genome của virus được nối vào trong vector hay
chưa. Có 2 phương pháp để kiểm tra đó là: Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu
VNP93-A-F1/R1 (mồi A) hoặc là phản ứng cắt kiểm tra sản phẩm nối sử dụng
enzyme cắt BamHI.
Tất cả khuẩn lạc đơn sẽ được nuôi lắc 200 rpm trong 5ml LB lỏng cộng với
kanamycine và tetracycline.Sau đó tinh chiết plasmid bằng phương pháp miniprep
(Sambrook, Fritsch et al., 1989).Sau khi thu được plasmid chúng tôi tiến hành kiểm
tra cả 20 clones bằng cách cắt bằng enzyme Bam HI để chắc chắn rằng có sản phẩm
nối trong vector pCAMBIA2300.
Hình 4.19. Kết quả biến nạp cấu trúc xâm nhiễm PepYLCV vào E.coli.
https://drivers.vn/
Hình 4.20. Điện di sản phẩm cắt các clone bằng BamHI
Trong 20 clones thu được, chỉ có 3 clone mang sản phẩm nối là dimer của
virus gồm: clone 5-1, clone 5-5 và clone 5-20. Chúng tôi tiến hành kiểm tra lại bằng
phản ứng PCR 3 clones này sử dụng cặp mồi VNP93-A-F1/R1 (mồi A).
Hình 4.21. Điện di kiểm tra PCR
Kết quả cho thấy có 2 clone 5-1 và clone 5-4 là dương với mồi VNP93-A-
F1/R1 còn clone 5-8 thì không, . Điều đó cho thấy 2 clones 5-1 và 5-5 mang dimer
phân tử DNA-A của virus PepYLCVNV, còn clone 5-20 có 2 khả năng: là dimer
của phân tử DNA-A, cũng có thể là dimer của phân tử DNA-B (của 1 loài virus
khác). Chúng tôi chọn 2 clone 5-1 và clone 5-20 gửi đến Macrogen-Korea để giải
trình tự nhằm định danh chính xác loài begomovirus này.
4.4 Giải trình tự bộ gen của mẫu VNP1500
Sau khi có kết quả chúng tôi tiến hành biên tập bằng phần mềm Seqman
(DNAstar 7.1-Lasergen) để loại bỏ những trình tự nhiễu xấu và những trình tự
trùng với vector. Kết quả giải trình tự được thể hiện ở bảng 4.15.
Bảng 4.15. Kết quả giải trình tự 2 dòng plasmid mang cấu trúc xâm
nhiễm của virus mẫu VNP1500
STT
Mã giải trình
tự
Dòng plasmid
Mồi giải trình
tự
Kích thước đoạn
đọc được
(nucleotide)
1 163DZAB045 VNP1500-1 (A) pCambia SeqF 572
2 163DZAB046 VNP1500-1 (A) pCambia SeqR 148
3 163DZAB047 VNP1500-1 (A) VNP93-A-F 976
4 163DZAB048 VNP1500-1 (A) VNP93-A-R 920
5 163DZAB049 VNP1500-1 (A) VNP93-A-F1 871 https://drivers.vn/
Trong 20 clones thu được, chỉ có 3 clone mang sản phẩm nối là dimer của
virus gồm: clone 5-1, clone 5-5 và clone 5-20. Chúng tôi tiến hành kiểm tra lại bằng
phản ứng PCR 3 clones này sử dụng cặp mồi VNP93-A-F1/R1 (mồi A).
Hình 4.21. Điện di kiểm tra PCR
Kết quả cho thấy có 2 clone 5-1 và clone 5-4 là dương với mồi VNP93-A-
F1/R1 còn clone 5-8 thì không, . Điều đó cho thấy 2 clones 5-1 và 5-5 mang dimer
phân tử DNA-A của virus PepYLCVNV, còn clone 5-20 có 2 khả năng: là dimer
của phân tử DNA-A, cũng có thể là dimer của phân tử DNA-B (của 1 loài virus
khác). Chúng tôi chọn 2 clone 5-1 và clone 5-20 gửi đến Macrogen-Korea để giải
trình tự nhằm định danh chính xác loài begomovirus này.
4.4 Giải trình tự bộ gen của mẫu VNP1500
Sau khi có kết quả chúng tôi tiến hành biên tập bằng phần mềm Seqman
(DNAstar 7.1-Lasergen) để loại bỏ những trình tự nhiễu xấu và những trình tự
trùng với vector. Kết quả giải trình tự được thể hiện ở bảng 4.15.
Bảng 4.15. Kết quả giải trình tự 2 dòng plasmid mang cấu trúc xâm
nhiễm của virus mẫu VNP1500
STT
Mã giải trình
tự
Dòng plasmid
Mồi giải trình
tự
Kích thước đoạn
đọc được
(nucleotide)
1 163DZAB045 VNP1500-1 (A) pCambia SeqF 572
2 163DZAB046 VNP1500-1 (A) pCambia SeqR 148
3 163DZAB047 VNP1500-1 (A) VNP93-A-F 976
4 163DZAB048 VNP1500-1 (A) VNP93-A-R 920
5 163DZAB049 VNP1500-1 (A) VNP93-A-F1 871 https://drivers.vn/
6 163DZAB050 VNP1500-1 (A) VNP93-A-R1 Nhiễu
7 163DZAB051 VNP1500-20 pCambia SeqF 722
8 163DZAB052 VNP1500-20 pCambia SeqR 680
Sau khi lắp ráp bằng phần mềm Seqman, chúng tôi nhận được trình tự phân
tử DNA-A và DNA-B như sau:
>VNP1500-1, 1697 nts
ATCTATTTCTATGATTCGGTTCAAATTAATAAATATTGAATTTTA
TTATATCCGAAAGATGAGCATCAATTGTGCCCTCAAGTACATTGTACA
ATACATGTCTAATTGCCCTAATAACGTTGTTGATACTAATAACTCCTA
AATGGTCTAAATACTTTATACATTGGTATCTAAATACTCTTAAGAAAC
GCGAGGTCTGAGGACGTAAACGAGTCCAGATTTGGCAGATTAGATAG
CATTGGTGTAGTCCCAACGC TTTCCTCAGGTTGTAGTTGAACTGGATCT
GCACTGTGATCATGTCGTGGTTCATCATGAATGGTCTCTCGCGGTGGT
GGGTTATGTTGAAATAGAGGGGATTGTTGACCGTCCAGATATACACGC
CATTCTCTGCCTGAGCTGCAGTGATGCGTTCCCCTGTGCGTGAATCCAT
GGTTGTGGCAACCTAGAGCGACGAAGTACGAACAACCACAAGGGAGA
TCAATTCTTCTCCTTCTATTGGTCTTCTTGGCGAT TCGGTGTTGCACCTT
GATTGGTACCTGAGTAGAGTGGGCCTTGGAGGGTGACGAAGATTGCA
TTTTTTAAAGCCCAATGTTTAAGTGCGGTGTTCTTTTCCTCTTCCAAGA
ACTCTTTATAGCTGGAATGTGGTCCTGGATTGCAGAGGAAGATAGTGG
GAATCCCGCCTTTAATTTGAACTGGTTTCCCGTACTTGGTGTTGCTTTG
CCAGTCTCTTTGGGCCCCCATGAACTCTTTAAAGTGCTTTAGATAATG C
GGATCGACGTCATCAATGACGTTATACCAAGCAGCATTATTGAACACT
TTAGGACTTAAGTCTAAATGCCCACATAAGTAGTTATGTGGGCCCAAT
GACCTGGCCCACATTGTCTTCCCTGTACGACTATCGCCCTCTAACACA
ATGCTTATCGGTCTTAATGGCCGCGCAGCGGCACTAACAACGTTTCCG
GCAACCCATTCATCAAGTTCCTCGGGGACTTGGTCAAAAGAAGAAGA
CAAGAAAGGACAAACA AAAACCTCTAAAGGAGGTGCAAAAATCCTAT
CTAAATTACTATGTAAATTATGAAACTGTAAAACAAAATCTTTGGGGG
CCTTCTCCTTTAATATATTGAGGGCCTCTGCTTGACCTGAATTGATTGC
CTCGGCATATGCGTCGTTGGCAGATCGGCAACCTCCTCTAGCTGATCThttps://drivers.vn/
7 163DZAB051 VNP1500-20 pCambia SeqF 722
8 163DZAB052 VNP1500-20 pCambia SeqR 680
Sau khi lắp ráp bằng phần mềm Seqman, chúng tôi nhận được trình tự phân
tử DNA-A và DNA-B như sau:
>VNP1500-1, 1697 nts
ATCTATTTCTATGATTCGGTTCAAATTAATAAATATTGAATTTTA
TTATATCCGAAAGATGAGCATCAATTGTGCCCTCAAGTACATTGTACA
ATACATGTCTAATTGCCCTAATAACGTTGTTGATACTAATAACTCCTA
AATGGTCTAAATACTTTATACATTGGTATCTAAATACTCTTAAGAAAC
GCGAGGTCTGAGGACGTAAACGAGTCCAGATTTGGCAGATTAGATAG
CATTGGTGTAGTCCCAACGC TTTCCTCAGGTTGTAGTTGAACTGGATCT
GCACTGTGATCATGTCGTGGTTCATCATGAATGGTCTCTCGCGGTGGT
GGGTTATGTTGAAATAGAGGGGATTGTTGACCGTCCAGATATACACGC
CATTCTCTGCCTGAGCTGCAGTGATGCGTTCCCCTGTGCGTGAATCCAT
GGTTGTGGCAACCTAGAGCGACGAAGTACGAACAACCACAAGGGAGA
TCAATTCTTCTCCTTCTATTGGTCTTCTTGGCGAT TCGGTGTTGCACCTT
GATTGGTACCTGAGTAGAGTGGGCCTTGGAGGGTGACGAAGATTGCA
TTTTTTAAAGCCCAATGTTTAAGTGCGGTGTTCTTTTCCTCTTCCAAGA
ACTCTTTATAGCTGGAATGTGGTCCTGGATTGCAGAGGAAGATAGTGG
GAATCCCGCCTTTAATTTGAACTGGTTTCCCGTACTTGGTGTTGCTTTG
CCAGTCTCTTTGGGCCCCCATGAACTCTTTAAAGTGCTTTAGATAATG C
GGATCGACGTCATCAATGACGTTATACCAAGCAGCATTATTGAACACT
TTAGGACTTAAGTCTAAATGCCCACATAAGTAGTTATGTGGGCCCAAT
GACCTGGCCCACATTGTCTTCCCTGTACGACTATCGCCCTCTAACACA
ATGCTTATCGGTCTTAATGGCCGCGCAGCGGCACTAACAACGTTTCCG
GCAACCCATTCATCAAGTTCCTCGGGGACTTGGTCAAAAGAAGAAGA
CAAGAAAGGACAAACA AAAACCTCTAAAGGAGGTGCAAAAATCCTAT
CTAAATTACTATGTAAATTATGAAACTGTAAAACAAAATCTTTGGGGG
CCTTCTCCTTTAATATATTGAGGGCCTCTGCTTGACCTGAATTGATTGC
CTCGGCATATGCGTCGTTGGCAGATCGGCAACCTCCTCTAGCTGATCThttps://drivers.vn/
GCCATCGATCTGGAAAACTCCATGATCAAGCACGTCTCCGTCTTTCTC
CATGTATGCTTTAACATCTGACGAGCTCTTAGCTCCCTGAATGTTCGG
ATGGAAATGTGCTGACCTGGTTGGGGATCTGAGGTCGAAGAACCTTTG
ATTTTTGCATTGGAATTTACCTTCGAATTGGATGAGGACATGCAAGTG
AGGAGTCCCATCTTCGTGCAATTCCCTGCAAATCCTGATAAACAGTTT
ATTTGTTGGTGTTTCT ATGGCTTGAATTTGGGAAAGTGCCTCTTCTTTG
GTGAGAGAGCAGTGTGGGTATGTGAGGAAATAGTTTTTAGCATTTATT
CTGAATTTGCTTGGGGGAGCCATTGACCGGTCAATCGGTGTCTCTCAA
CTTGGGCTATGTAATTGGTGTCTGGGGTCTTATTTATATGGAGACCCTA
AATGGCAATATTGTAATTTCTTAAAGAAATTTAAATTCCAAAAGCGGC
CATCCGTATAATATT
>VNP1500-20, 1396 nts
ACCGGATGGCCGCGATTTTTTTTTTACGTGGTCCCCGCACGCGTTTCTG
ACATTTGTGTCCATTCGATCAATCCCACCCATTGAAACTGAACACGTG
TTACCATCTTAAGTCAGGGATGTTTCCACGTCTGTTTTCTATATATTGG
TCCTATTCATCTCCTCTCTCATTTGTAAATAAAAATGAGAGTTCCAATC
CGGAGGAATTCAGGCGTCAATTCTGATCGTCGTCCTTCCAATGGGTCA
ATCCACCGGTGGA ACTACCCATATTCCAACTATTTTGGGAGGAGGATT
GGCAACCGTGTATACGGCATGCCATTCGGAAACCAACAAGTGCAACG
ACGTGAGTTTAAGCAAACTCAACGTCTTACCAAGTCTGCTGAGCAGGT
TTCATGTAGGAGGAAGTCTATGAAGACGGTTGAGGAAATACACGATG
GCACTGACTACTTGCTGTGCAGTAACATGTCTAAGGTGTCGTATATTA
GCTACCCGCCTCTATCCGGCACTGAATATGG TAGTAGAGCTGAGTCCT
ATATCAAAGTCTTGGGAGTCACTGTATCTGGGTCTGCTGTGCTGAAGC
AGACGGGCATGCGTGAAGCAGATGGGTCTCAAGGAATTCATGGGATA
TTTACTACAGTACTTGTTCGTGACAAGAGACCATGTCAGTTCTCTGCC
GTGGATCCGATCATCCCATTTGCGGAGCTGTTTGGACAAGAGAAGAG
AGCATGCTCCTCATTACGTGTTAGAGATTCTTATAAGAATCGATTTAG
TGTTGTCTACCAGAAGAAGCATGTAGTAAATAGTGCTCTATCAACACA
TGTATTTAGGTATAATTTTAATGTGAAATTCTCTAGATTTCCTTTCTGG
GTGTCTTTCAAAGACACCTCCAACGCAGAGCCTACTGGGCGATATTCT
AATGTGTCGAAGAACGCATTGGTTGTGTACTATGTTTGGCTATGTGAT
TCAAATGTAACAGCCGAAGTGCACGTGCAATATGATTTGAACTACATT
GGATAAATAAAATCAT ATTTTTTTTACATTCGAGGAGACATTACTCCC
CTCCATACATAGCTCAACAGTTTTTTTAATAATATTAATTACATCGTCA
TTTACTTTGTTGCTACCTGCAACAACTTCCGACGCCGAAGGGCCTGGAhttps://drivers.vn/
CATGTATGCTTTAACATCTGACGAGCTCTTAGCTCCCTGAATGTTCGG
ATGGAAATGTGCTGACCTGGTTGGGGATCTGAGGTCGAAGAACCTTTG
ATTTTTGCATTGGAATTTACCTTCGAATTGGATGAGGACATGCAAGTG
AGGAGTCCCATCTTCGTGCAATTCCCTGCAAATCCTGATAAACAGTTT
ATTTGTTGGTGTTTCT ATGGCTTGAATTTGGGAAAGTGCCTCTTCTTTG
GTGAGAGAGCAGTGTGGGTATGTGAGGAAATAGTTTTTAGCATTTATT
CTGAATTTGCTTGGGGGAGCCATTGACCGGTCAATCGGTGTCTCTCAA
CTTGGGCTATGTAATTGGTGTCTGGGGTCTTATTTATATGGAGACCCTA
AATGGCAATATTGTAATTTCTTAAAGAAATTTAAATTCCAAAAGCGGC
CATCCGTATAATATT
>VNP1500-20, 1396 nts
ACCGGATGGCCGCGATTTTTTTTTTACGTGGTCCCCGCACGCGTTTCTG
ACATTTGTGTCCATTCGATCAATCCCACCCATTGAAACTGAACACGTG
TTACCATCTTAAGTCAGGGATGTTTCCACGTCTGTTTTCTATATATTGG
TCCTATTCATCTCCTCTCTCATTTGTAAATAAAAATGAGAGTTCCAATC
CGGAGGAATTCAGGCGTCAATTCTGATCGTCGTCCTTCCAATGGGTCA
ATCCACCGGTGGA ACTACCCATATTCCAACTATTTTGGGAGGAGGATT
GGCAACCGTGTATACGGCATGCCATTCGGAAACCAACAAGTGCAACG
ACGTGAGTTTAAGCAAACTCAACGTCTTACCAAGTCTGCTGAGCAGGT
TTCATGTAGGAGGAAGTCTATGAAGACGGTTGAGGAAATACACGATG
GCACTGACTACTTGCTGTGCAGTAACATGTCTAAGGTGTCGTATATTA
GCTACCCGCCTCTATCCGGCACTGAATATGG TAGTAGAGCTGAGTCCT
ATATCAAAGTCTTGGGAGTCACTGTATCTGGGTCTGCTGTGCTGAAGC
AGACGGGCATGCGTGAAGCAGATGGGTCTCAAGGAATTCATGGGATA
TTTACTACAGTACTTGTTCGTGACAAGAGACCATGTCAGTTCTCTGCC
GTGGATCCGATCATCCCATTTGCGGAGCTGTTTGGACAAGAGAAGAG
AGCATGCTCCTCATTACGTGTTAGAGATTCTTATAAGAATCGATTTAG
TGTTGTCTACCAGAAGAAGCATGTAGTAAATAGTGCTCTATCAACACA
TGTATTTAGGTATAATTTTAATGTGAAATTCTCTAGATTTCCTTTCTGG
GTGTCTTTCAAAGACACCTCCAACGCAGAGCCTACTGGGCGATATTCT
AATGTGTCGAAGAACGCATTGGTTGTGTACTATGTTTGGCTATGTGAT
TCAAATGTAACAGCCGAAGTGCACGTGCAATATGATTTGAACTACATT
GGATAAATAAAATCAT ATTTTTTTTACATTCGAGGAGACATTACTCCC
CTCCATACATAGCTCAACAGTTTTTTTAATAATATTAATTACATCGTCA
TTTACTTTGTTGCTACCTGCAACAACTTCCGACGCCGAAGGGCCTGGAhttps://drivers.vn/
TCTAGGGTTCCATCTTGCAGCCGATGTAAATGTCTATATGGGTGCTCCT
CTATGTCGTTGTTCTCCACTGTGCTGGCTGAAGCCCAAGTATGCCCCTG
TGGAATGGCATTTGTAGTGTATCTGGAAGACTGTGACCTCATGTGTGT
TAGGGCTTGTACTGGTTTTCTTGATACAGTTGATTGAGGCACATGCCA
GAAATCTATGTGGTTCATGTTATACGCCTTTGATAGTATTTCAATCTTA
Kết quả giải trình tự chưa thu được đầy đủ phân tử DNA-A của mẫu virus
VNP1500. Phân tử DNA-A của mẫu virus còn thiếu khảng 1000 nts (Hình A). Đối
với plasmid VNP1500-20, trước khi giải trình tự, chúng tôi vẫn chưa rõ liệu đây là
DNA-A hay là DNA-B (của một loài khác) mặc dù đã được dự đoán là DNA-B
(phần ...). Đoạn trình tự virus thu được của plasmid này chỉ gồm 2 đoạn là 722 và
680 nts (tính từ 2 phía của vị trí cắt bằng enzyme BamHI).
Hình 4.22. Các đoạn trình tự của dòng plasmid VNP1500 – 1 (DNA-A)
được lắp ráp bằng phần mềm SeqMan (DNASTAR)
4.5 Xác định danh tính virus dựa trên trình tự sẵn có
4.5.1 Tìm kiếm Blast
Các trình tự thu được, bao gồm đoạn dài 1697 nts của plasmid VNP1500-1
và đoạn dài 1396 nts của plasmid VNP1500-20, đã được sử dụng để xác định danh
tính virus dùng phần mềm tìm kiếm trực tuyến Blast. Tìm kiếm này cũng đồng thời
xác định bản chất là DNA-A hay DNA-B của plasmid VNP1500-20. Kết quả tìm
kiếm được trình bày ở Bảng 4.16 . https://drivers.vn/
CTATGTCGTTGTTCTCCACTGTGCTGGCTGAAGCCCAAGTATGCCCCTG
TGGAATGGCATTTGTAGTGTATCTGGAAGACTGTGACCTCATGTGTGT
TAGGGCTTGTACTGGTTTTCTTGATACAGTTGATTGAGGCACATGCCA
GAAATCTATGTGGTTCATGTTATACGCCTTTGATAGTATTTCAATCTTA
Kết quả giải trình tự chưa thu được đầy đủ phân tử DNA-A của mẫu virus
VNP1500. Phân tử DNA-A của mẫu virus còn thiếu khảng 1000 nts (Hình A). Đối
với plasmid VNP1500-20, trước khi giải trình tự, chúng tôi vẫn chưa rõ liệu đây là
DNA-A hay là DNA-B (của một loài khác) mặc dù đã được dự đoán là DNA-B
(phần ...). Đoạn trình tự virus thu được của plasmid này chỉ gồm 2 đoạn là 722 và
680 nts (tính từ 2 phía của vị trí cắt bằng enzyme BamHI).
Hình 4.22. Các đoạn trình tự của dòng plasmid VNP1500 – 1 (DNA-A)
được lắp ráp bằng phần mềm SeqMan (DNASTAR)
4.5 Xác định danh tính virus dựa trên trình tự sẵn có
4.5.1 Tìm kiếm Blast
Các trình tự thu được, bao gồm đoạn dài 1697 nts của plasmid VNP1500-1
và đoạn dài 1396 nts của plasmid VNP1500-20, đã được sử dụng để xác định danh
tính virus dùng phần mềm tìm kiếm trực tuyến Blast. Tìm kiếm này cũng đồng thời
xác định bản chất là DNA-A hay DNA-B của plasmid VNP1500-20. Kết quả tìm
kiếm được trình bày ở Bảng 4.16 . https://drivers.vn/
Kết quả tìm kiếm trực tuyến cho thấy DNA-A của mẫu virus VNP1500 gần
gũi nhất với DNA-A của Pepper leaf curl (Malaysia) virus (mức đồng nhất trình tự
là 88 %).
Kết quả tìm kiếm trực tuyến cho thấy đoạn trình tự virus của plasmid
VNP1500-20 là DNA-B và gần gũi nhất với DNA-B của Tomato yellow leaf curl
Kanchanaburi virus với mức đồng nhất trình tự 89% (bảng 4.16).
Các mức đồng nhất trình tự ở trên khá thấp và chưa đủ để kết luận danh tính
virus.
Bảng 4.16. Kết quả tìm kiếm virus gần gũi nhất trên Ngân hàng gen
(Genbank) dùng trình tự thu được của mẫu virus VNP1500
Plasmid
giải trình
tự
Virus gần gũi nhất trên Ngân hàng gen*
Tên virus (nguồn gốc), loại phân tử của bộ
gen
Mã Ngân
hàng gen
Phần
trăm
đoạn so
sánh
(%)
Mức
đồng
nhất
trình
tự (%0
VNP1500-
1 (DNA-
A)
Pepper leaf curl Malaysia virus (Malaysia),
DNA-A
AF414287 100 88
Erectites yellow mosaic virus (Việt Nam),
DNA-A
DQ641698 97 89
Pepper leaf curl virus (Thái Lan), DNA-A AF134484 100 97
VNP1500-
20
Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi
virus (Thái Lan, isolate E4), DNA-B
KF446664 93 89
Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi
virus (Thái Lan, isolate P4), DNA-B
KF446672 93 89
Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi
virus (Thái Lan, isolate P3), DNA-B
KF446670 93 89
* Chỉ trình bày 3 virus gần gũi nhất dung phần mềm tìm kiếm trực tuyến BLAST
tại NCBI https://drivers.vn/
gũi nhất với DNA-A của Pepper leaf curl (Malaysia) virus (mức đồng nhất trình tự
là 88 %).
Kết quả tìm kiếm trực tuyến cho thấy đoạn trình tự virus của plasmid
VNP1500-20 là DNA-B và gần gũi nhất với DNA-B của Tomato yellow leaf curl
Kanchanaburi virus với mức đồng nhất trình tự 89% (bảng 4.16).
Các mức đồng nhất trình tự ở trên khá thấp và chưa đủ để kết luận danh tính
virus.
Bảng 4.16. Kết quả tìm kiếm virus gần gũi nhất trên Ngân hàng gen
(Genbank) dùng trình tự thu được của mẫu virus VNP1500
Plasmid
giải trình
tự
Virus gần gũi nhất trên Ngân hàng gen*
Tên virus (nguồn gốc), loại phân tử của bộ
gen
Mã Ngân
hàng gen
Phần
trăm
đoạn so
sánh
(%)
Mức
đồng
nhất
trình
tự (%0
VNP1500-
1 (DNA-
A)
Pepper leaf curl Malaysia virus (Malaysia),
DNA-A
AF414287 100 88
Erectites yellow mosaic virus (Việt Nam),
DNA-A
DQ641698 97 89
Pepper leaf curl virus (Thái Lan), DNA-A AF134484 100 97
VNP1500-
20
Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi
virus (Thái Lan, isolate E4), DNA-B
KF446664 93 89
Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi
virus (Thái Lan, isolate P4), DNA-B
KF446672 93 89
Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi
virus (Thái Lan, isolate P3), DNA-B
KF446670 93 89
* Chỉ trình bày 3 virus gần gũi nhất dung phần mềm tìm kiếm trực tuyến BLAST
tại NCBI https://drivers.vn/
4.5.2 So sánh trình tự với PepYLCVNV
Do DNA-A của mẫu virus VNP1500 luôn có phản ứng PCR dương tính với
mồi đặc hiệu của PepYLCVNV. Bộ gen của virus này vẫn chưa được gửi trên Ngân
hàng gen nên chúng tôi đã tiến hành so sánh trình tự của mẫu virus VNP1500 với
PepYLCVNV (VNP93). Trình tự của các virus gần gũi trên Ngân hàng gen như:
PepLCV, TYLCKaV và ErYV cũng được sử dụng trong phân tích. Kết quả so sánh
được trình bày ở bảng 4.17.
Kết quả so sánh cho thấy cả 2 phân tử DNA-A và DNA-B của mẫu VNP1500
đều có mức đồng nhất trình tự rất cao (>90%) đối với virus PeYLCVNV (mẫu
VNP93). Mặc dù danh tính chính xác của virus chỉ có thể được xác định dựa trên
trình tự toàn bộ bộ gen nhưng mức đồng nhất cao ở trên cho thấy mẫu VNP1500
chính là PepYLCVNV.
Kết quả này cho thấy PepLCVNV có phân bố khá rộng, ít nhất ở các tỉnh
miền Trung và miền nam nước ta.
Bảng 4.17. So sánh đoạn trình tự thu được của mẫu virus VNP1500 với
PepYLCVNV (VNP93) và các gần gũi nhất trên Ngân hàng gen
Loại
phân
tử
geno
me
Virus so sánh
Mức đồng nhất trình tự (%)*
VNP1500-1 VNP1500-20
DNA-
A
PepYLCVNV (VNP93, Việt nam,
DNA-A)
90.9
PepLCV (AF414287, Malaysia,
DNA-A)
87.8
PepLCV (AF134484, Thái Lan,
DNA-A)
86.3
EYMV (DQ641698, Việt Nam, DNA-
A)
86.9
TYLCKaV (AF511529, Thai Lan,
DNA-A)
71.7
https://drivers.vn/
Do DNA-A của mẫu virus VNP1500 luôn có phản ứng PCR dương tính với
mồi đặc hiệu của PepYLCVNV. Bộ gen của virus này vẫn chưa được gửi trên Ngân
hàng gen nên chúng tôi đã tiến hành so sánh trình tự của mẫu virus VNP1500 với
PepYLCVNV (VNP93). Trình tự của các virus gần gũi trên Ngân hàng gen như:
PepLCV, TYLCKaV và ErYV cũng được sử dụng trong phân tích. Kết quả so sánh
được trình bày ở bảng 4.17.
Kết quả so sánh cho thấy cả 2 phân tử DNA-A và DNA-B của mẫu VNP1500
đều có mức đồng nhất trình tự rất cao (>90%) đối với virus PeYLCVNV (mẫu
VNP93). Mặc dù danh tính chính xác của virus chỉ có thể được xác định dựa trên
trình tự toàn bộ bộ gen nhưng mức đồng nhất cao ở trên cho thấy mẫu VNP1500
chính là PepYLCVNV.
Kết quả này cho thấy PepLCVNV có phân bố khá rộng, ít nhất ở các tỉnh
miền Trung và miền nam nước ta.
Bảng 4.17. So sánh đoạn trình tự thu được của mẫu virus VNP1500 với
PepYLCVNV (VNP93) và các gần gũi nhất trên Ngân hàng gen
Loại
phân
tử
geno
me
Virus so sánh
Mức đồng nhất trình tự (%)*
VNP1500-1 VNP1500-20
DNA-
A
PepYLCVNV (VNP93, Việt nam,
DNA-A)
90.9
PepLCV (AF414287, Malaysia,
DNA-A)
87.8
PepLCV (AF134484, Thái Lan,
DNA-A)
86.3
EYMV (DQ641698, Việt Nam, DNA-
A)
86.9
TYLCKaV (AF511529, Thai Lan,
DNA-A)
71.7
https://drivers.vn/
DNA-
B
PepYLCVNV (VNP93, Việt nam,
DNA-B)
92.5
TYLCKaV (AF511528, Thái Lan,
DNA-B)
86.6
* Chỉ tính trên đoạn trình tự thu được của mẫu VNP1500 (1697 nts của plasmid
VNP1500-1 và 1396 nts của plasmid VNP1500-20)
4.6 Kết quả kiểm tra một số loại virus gây hại trên ớt thu thập tại miền Bắc
và miền Trung giai đoạn 2012-2013
4.6.1 Kiểm tra virus gây hại thu thập ngoài đồng từ các địa điểm điều tra giai
đoạn 2012-2013 bằng phương pháp ELISA
Nhằm xác định nguyên nhân gây bệnh do virus gây hại trên ớt , chúng tôi
tiến hành thu thập mẫu bệnh có triệu chứng điển hình được thu thập từ các địa điểm
điều tra. Mẫu bệnh thu được làm khô và bảo quản bằng silicagel. Để kiểm tra các
mẫu có triệu chứng thu được, chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phản ứng ELISA
trực tiếp (DAS – ELISA). Nguồn kháng huyết thanh sử dụng là kháng huyết thanh
Chilli Veinal mottle Virus (ChiVMV), đây là potyvirus phổ biến trên ớt tại Việt
Nam. Tổng số 28 mẫu có triệu chứng virus thu thập được trong quá trình điều tra
ngoài đồng ruộng đã được kiểm tra ELISA, trong đó các mẫu được kết luận là
dương tính khi có trị số ELISA lớn gấp đôi trị số ELISA của đối chúng âm (cây
khỏe). Kết quả được thể hiện ở bảng 4.1, hình 4.1.1.
Kết quả bảng 4.1 và hình 4.32 và hình 4.33 cho thấy:
Kết quả kiểm tra cho thấy có 12/28 mẫu bị nhiễm ChiVMV (chiếm 54.55%).
Điều đó, cho thấy chủng ChiVMV là virus quan trọng đối với cây ớt tại Việt Nam.
Bảng 4.18. Kết quả kiểm tra ELISA các mẫu ớt thu được
tại Việt Nam giai đoạn 2012-2013
STT Ký hiệu Triệu chứng
Địa điểm
ChiVMV
OD KL
1 VNP96 Cuốn lá, khảm Túy Loan-Đà Nẵng 0.874 +
2 VNP120 Khảm Thái Bình 2.717 + https://drivers.vn/
B
PepYLCVNV (VNP93, Việt nam,
DNA-B)
92.5
TYLCKaV (AF511528, Thái Lan,
DNA-B)
86.6
* Chỉ tính trên đoạn trình tự thu được của mẫu VNP1500 (1697 nts của plasmid
VNP1500-1 và 1396 nts của plasmid VNP1500-20)
4.6 Kết quả kiểm tra một số loại virus gây hại trên ớt thu thập tại miền Bắc
và miền Trung giai đoạn 2012-2013
4.6.1 Kiểm tra virus gây hại thu thập ngoài đồng từ các địa điểm điều tra giai
đoạn 2012-2013 bằng phương pháp ELISA
Nhằm xác định nguyên nhân gây bệnh do virus gây hại trên ớt , chúng tôi
tiến hành thu thập mẫu bệnh có triệu chứng điển hình được thu thập từ các địa điểm
điều tra. Mẫu bệnh thu được làm khô và bảo quản bằng silicagel. Để kiểm tra các
mẫu có triệu chứng thu được, chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phản ứng ELISA
trực tiếp (DAS – ELISA). Nguồn kháng huyết thanh sử dụng là kháng huyết thanh
Chilli Veinal mottle Virus (ChiVMV), đây là potyvirus phổ biến trên ớt tại Việt
Nam. Tổng số 28 mẫu có triệu chứng virus thu thập được trong quá trình điều tra
ngoài đồng ruộng đã được kiểm tra ELISA, trong đó các mẫu được kết luận là
dương tính khi có trị số ELISA lớn gấp đôi trị số ELISA của đối chúng âm (cây
khỏe). Kết quả được thể hiện ở bảng 4.1, hình 4.1.1.
Kết quả bảng 4.1 và hình 4.32 và hình 4.33 cho thấy:
Kết quả kiểm tra cho thấy có 12/28 mẫu bị nhiễm ChiVMV (chiếm 54.55%).
Điều đó, cho thấy chủng ChiVMV là virus quan trọng đối với cây ớt tại Việt Nam.
Bảng 4.18. Kết quả kiểm tra ELISA các mẫu ớt thu được
tại Việt Nam giai đoạn 2012-2013
STT Ký hiệu Triệu chứng
Địa điểm
ChiVMV
OD KL
1 VNP96 Cuốn lá, khảm Túy Loan-Đà Nẵng 0.874 +
2 VNP120 Khảm Thái Bình 2.717 + https://drivers.vn/
3 VNP179 Cuốn lá, khảm Cam Lộ-Quảng Trị 0.156 –
4 VNP192 Khảm Cam Đường-Lào Cai 0.162 –
5 VNP217 Khảm Cò Nòi-Sơn La 0.244 +
6 VNP237 Cuốn lá,khảm Cổ Phúc-Yên Bái 0.146 –
7 VNP251 Cuốn lá,khảm Chiềng Sinh-Sơn La 0.923 +
8 VNP291
Khảm vàng, lá
nhỏ
Vĩnh Tường-Vĩnh Phúc 1.642 +
9 VNP300 Xoăn vàng lá Sóc Sơn-Hà Nội 0.150 –
10 VNP306 Khảm vàng Yên Thế-Bắc Giang 0.180 –
11 VNP313 Khảm vàng Châu Thành-An Giang 0.161 –
12 VNP453 Khảm vàng Vĩnh Bảo-Hải Phòng 2.174
+
13 VNP535 Khảm Hòa An-Cao Bằng 0.144
–
14 VNP558 Khảm vàng Chợ Mới-Bắc Kạn 0.158 –
15 VNP626 Khảm Túy Loan-Đà Nẵng 0.151 –
16 VNP632 Khảm vàng Túy Loan-Đà Nẵng 0.623 +
17 VNP634 Khảm vàng Điện Bàn-Quảng Nam 0.673 +
18 VNP649 Khảm vàng Phù Cát-Bình Định 1.058 +
19 VNP683 Khảm
Thanh Bình-Đồng
Tháp
2.160 +
20 VNP706 Khảm vàng Châu Thành-An Giang 1.844 +
21 VNP716 Khảm Yên Thế-Bắc Giang >3 +
22 VNP785 Khảm Bình Thủy-Cần Thơ 0.145 –
23 Đối chứng (–) Không bị bệnh TTBCNĐ- ĐHNNHN 0.162 –
24
Đối chứng (–)
Không bị bệnh TTBCNĐ- ĐHNNHN 0.160 –
25
Đối chứng (–)
Không bị bệnh TTBCNĐ- ĐHNNHN 0.172 –
26
Đối chứng (+)
Khảm vàng, lá
nhỏ
TTBCNĐ- ĐHNNHN >3 +
27
Đối chứng (+)
Khảm vàng, lá
nhỏ
TTBCNĐ- ĐHNNHN >3 + https://drivers.vn/
4 VNP192 Khảm Cam Đường-Lào Cai 0.162 –
5 VNP217 Khảm Cò Nòi-Sơn La 0.244 +
6 VNP237 Cuốn lá,khảm Cổ Phúc-Yên Bái 0.146 –
7 VNP251 Cuốn lá,khảm Chiềng Sinh-Sơn La 0.923 +
8 VNP291
Khảm vàng, lá
nhỏ
Vĩnh Tường-Vĩnh Phúc 1.642 +
9 VNP300 Xoăn vàng lá Sóc Sơn-Hà Nội 0.150 –
10 VNP306 Khảm vàng Yên Thế-Bắc Giang 0.180 –
11 VNP313 Khảm vàng Châu Thành-An Giang 0.161 –
12 VNP453 Khảm vàng Vĩnh Bảo-Hải Phòng 2.174
+
13 VNP535 Khảm Hòa An-Cao Bằng 0.144
–
14 VNP558 Khảm vàng Chợ Mới-Bắc Kạn 0.158 –
15 VNP626 Khảm Túy Loan-Đà Nẵng 0.151 –
16 VNP632 Khảm vàng Túy Loan-Đà Nẵng 0.623 +
17 VNP634 Khảm vàng Điện Bàn-Quảng Nam 0.673 +
18 VNP649 Khảm vàng Phù Cát-Bình Định 1.058 +
19 VNP683 Khảm
Thanh Bình-Đồng
Tháp
2.160 +
20 VNP706 Khảm vàng Châu Thành-An Giang 1.844 +
21 VNP716 Khảm Yên Thế-Bắc Giang >3 +
22 VNP785 Khảm Bình Thủy-Cần Thơ 0.145 –
23 Đối chứng (–) Không bị bệnh TTBCNĐ- ĐHNNHN 0.162 –
24
Đối chứng (–)
Không bị bệnh TTBCNĐ- ĐHNNHN 0.160 –
25
Đối chứng (–)
Không bị bệnh TTBCNĐ- ĐHNNHN 0.172 –
26
Đối chứng (+)
Khảm vàng, lá
nhỏ
TTBCNĐ- ĐHNNHN >3 +
27
Đối chứng (+)
Khảm vàng, lá
nhỏ
TTBCNĐ- ĐHNNHN >3 + https://drivers.vn/
28
Đối chứng (+)
Khảm vàng, lá
nhỏ
TTBCNĐ- ĐHNNHN >3 +
Số mẫu +
12
Tỷ lệ mẫu +
54.55%
Ghi chú: OD: Mật độ quang học đo bước sóng 405 nm;
KL: Kết luận; ( -) : Cây không nhiễm bệnh; (+): Cây nhiễm bệnh
2 × trị số trung bình giá trị ở giếng đối chứng âm + độ lệch chuẩn=0.178
Hình 4.22. Kết quả ELISA phát hiện ChiVMV
4.6.2 Kiểm tra virus gây hại thu thập ngoài đồng từ các địa điểm điều tra giai
đoạn 2012-2013 bằng phản ứng PCR
Kết quả kiểm tra ELISA cho thấy, nhiều mẫu với triệu chứng rất điển hình
như khảm vàng toàn bộ diện tích lá, cuốn lá, biến dạng lá… lại không dương với
virus ChiVMV. Chính vì thế chúng tôi nghi ngờ các mẫu trên có thể nhiễm
begomovirus. Vì vậy, chúng tôi chọn một số mẫu âm với virus ChiVMV, cùng với
một số mẫu nghi ngờ nhiễm begomovirus đã thu thập được để kiểm tra PCR.
Tất cả các mẫu đều được chiết DNA tổng số bằng CTAB và phản ứng PCR
sử dụng cặp mồi chung BegoA – For1/BegoA – Rev1. Kết quả được trình bày trong
bảng (4.2) và hình 4.1.2.
Kết quả kiểm tra cho thấy, trong 12 mẫu kiểm tra đã phát hiện thấy 8 mẫu
phản ứng PCR dương (+), tức là cây nhiễm bệnh, chiếm tỷ lệ 66,67%. https://drivers.vn/
Đối chứng (+)
Khảm vàng, lá
nhỏ
TTBCNĐ- ĐHNNHN >3 +
Số mẫu +
12
Tỷ lệ mẫu +
54.55%
Ghi chú: OD: Mật độ quang học đo bước sóng 405 nm;
KL: Kết luận; ( -) : Cây không nhiễm bệnh; (+): Cây nhiễm bệnh
2 × trị số trung bình giá trị ở giếng đối chứng âm + độ lệch chuẩn=0.178
Hình 4.22. Kết quả ELISA phát hiện ChiVMV
4.6.2 Kiểm tra virus gây hại thu thập ngoài đồng từ các địa điểm điều tra giai
đoạn 2012-2013 bằng phản ứng PCR
Kết quả kiểm tra ELISA cho thấy, nhiều mẫu với triệu chứng rất điển hình
như khảm vàng toàn bộ diện tích lá, cuốn lá, biến dạng lá… lại không dương với
virus ChiVMV. Chính vì thế chúng tôi nghi ngờ các mẫu trên có thể nhiễm
begomovirus. Vì vậy, chúng tôi chọn một số mẫu âm với virus ChiVMV, cùng với
một số mẫu nghi ngờ nhiễm begomovirus đã thu thập được để kiểm tra PCR.
Tất cả các mẫu đều được chiết DNA tổng số bằng CTAB và phản ứng PCR
sử dụng cặp mồi chung BegoA – For1/BegoA – Rev1. Kết quả được trình bày trong
bảng (4.2) và hình 4.1.2.
Kết quả kiểm tra cho thấy, trong 12 mẫu kiểm tra đã phát hiện thấy 8 mẫu
phản ứng PCR dương (+), tức là cây nhiễm bệnh, chiếm tỷ lệ 66,67%. https://drivers.vn/
Các mẫu có phản ứng dương với cặp mồi chung BegoA – For1/BegoA –
Rev1 tạo các băng đơn trên bản gel, trùng kích thước sản phẩm băng điện di mong
muốn là ~1.2 kb, mẫu đối chứng dương có phản ứng. Như vậy, kết quả kiểm tra đã
xác nhận sự có mặt của begomovirus trong 12 mẫu ớt kiểm tra.
Bảng 4.19. Kết quả kiểm tra các mẫu ớt bằng PCR sử dụng cặp mồi
BegoA – For1 và BegoA – Rev1
STT Mẫu Triệu chứng Địa điểm
Kết quả
PCR
1 VNP4
Cuốn lá,
khảm
FAVRI +
2 VNP179 Khảm vàng
Cam Lộ – Quảng
Trị
+
3 VNP192 Khảm Cam đường – Lào Cai –
4 VNP234 Khảm Cổ Phúc – Yên Bái –
5 VNP246 Xoăn lá Chiềng Sinh – Sơn La +
6 VNP300 Khảm vàng Sóc Sơn – Hà Nội –
7 VNP306 Khảm Yên Thế – Bắc Giang +
8 VNP456 Sáng gân Quỳnh Phụ – Thái Bình –
9 VNP459
Sáng gân từ
cuống
Quỳnh Phụ – Thái Bình –
10 VNP535 Khảm Hòa An – Cao Bằng –
11 VNP558 Khảm nhăn Chợ Mới – Bắc Kạn –
12 VNP961
Khảm, biến
vàng
An dương – Hải Phòng –
Số mẫu dương/tổng số mẫu thử
8/12
Tỷ lệ(%)
66,67
Ghi chú: (+) Cây nhiễm virus, (–) Cây không nhiễm virus https://drivers.vn/
Rev1 tạo các băng đơn trên bản gel, trùng kích thước sản phẩm băng điện di mong
muốn là ~1.2 kb, mẫu đối chứng dương có phản ứng. Như vậy, kết quả kiểm tra đã
xác nhận sự có mặt của begomovirus trong 12 mẫu ớt kiểm tra.
Bảng 4.19. Kết quả kiểm tra các mẫu ớt bằng PCR sử dụng cặp mồi
BegoA – For1 và BegoA – Rev1
STT Mẫu Triệu chứng Địa điểm
Kết quả
PCR
1 VNP4
Cuốn lá,
khảm
FAVRI +
2 VNP179 Khảm vàng
Cam Lộ – Quảng
Trị
+
3 VNP192 Khảm Cam đường – Lào Cai –
4 VNP234 Khảm Cổ Phúc – Yên Bái –
5 VNP246 Xoăn lá Chiềng Sinh – Sơn La +
6 VNP300 Khảm vàng Sóc Sơn – Hà Nội –
7 VNP306 Khảm Yên Thế – Bắc Giang +
8 VNP456 Sáng gân Quỳnh Phụ – Thái Bình –
9 VNP459
Sáng gân từ
cuống
Quỳnh Phụ – Thái Bình –
10 VNP535 Khảm Hòa An – Cao Bằng –
11 VNP558 Khảm nhăn Chợ Mới – Bắc Kạn –
12 VNP961
Khảm, biến
vàng
An dương – Hải Phòng –
Số mẫu dương/tổng số mẫu thử
8/12
Tỷ lệ(%)
66,67
Ghi chú: (+) Cây nhiễm virus, (–) Cây không nhiễm virus https://drivers.vn/
Hình 4.23. Triệu chứng của Begomovirus gây hại trên ớt tại Đà Nẵng
Hình 4.24. Kiểm tra PCR các mẫu ớt bằng cặp mồi cặp mồi BegoA –
For1 và BegoA – Rev1
Marker→H2O→VNP4→VNP179→VNP192→VNP234→VNP246→VNP300→
VNP306→VNP456→VNP459→VNP538→VNP558→VNP9611
(ladder: 1kb)
Từ kết quả trên, chúng tôi nhận thấy 2 mẫu bệnh ở miền Bắc phản ứng PCR
dương: VNP246 và VNP306. Vì begomovirus chưa từng xuất hiện tại miền Bắc,
do đó chúng tôi tiến hành kiểm tra PCR trên 2 mẫu này thêm 1 lần nữa. Kết quả
trình bày bảng (4.3) và hình 4.1.3.
Bảng 4.20. Kết quả kiểm tra 2 mẫu ớt bằng PCR sử dụng cặp mồi BegoA
– For1 và BegoA – Rev1
STT Mẫu Triệu chứng Địa điểm
Kết quả
PCR
1 VNP246 Xoăn lá Chiềng Sinh – Sơn La –
2 VNP306 Khảm Yên Thế – Bắc Giang +
Số mẫu dương/tổng số mẫu thử
1/2 https://drivers.vn/
Hình 4.24. Kiểm tra PCR các mẫu ớt bằng cặp mồi cặp mồi BegoA –
For1 và BegoA – Rev1
Marker→H2O→VNP4→VNP179→VNP192→VNP234→VNP246→VNP300→
VNP306→VNP456→VNP459→VNP538→VNP558→VNP9611
(ladder: 1kb)
Từ kết quả trên, chúng tôi nhận thấy 2 mẫu bệnh ở miền Bắc phản ứng PCR
dương: VNP246 và VNP306. Vì begomovirus chưa từng xuất hiện tại miền Bắc,
do đó chúng tôi tiến hành kiểm tra PCR trên 2 mẫu này thêm 1 lần nữa. Kết quả
trình bày bảng (4.3) và hình 4.1.3.
Bảng 4.20. Kết quả kiểm tra 2 mẫu ớt bằng PCR sử dụng cặp mồi BegoA
– For1 và BegoA – Rev1
STT Mẫu Triệu chứng Địa điểm
Kết quả
PCR
1 VNP246 Xoăn lá Chiềng Sinh – Sơn La –
2 VNP306 Khảm Yên Thế – Bắc Giang +
Số mẫu dương/tổng số mẫu thử
1/2 https://drivers.vn/
Tỷ lệ(%)
50
Ghi chú: (+) Cây nhiễm virus, (–) Cây không nhiễm virus .
Hình 4.24. Kiểm tra PCR 2 mẫu ớt thu ở miền Bắc bằng cặp mồi cặp
mồi BegoA – For1 và BegoA – Rev1
Marker→H2O→VNP4→VNP179 (ladder: 1kb)
https://drivers.vn/
50
Ghi chú: (+) Cây nhiễm virus, (–) Cây không nhiễm virus .
Hình 4.24. Kiểm tra PCR 2 mẫu ớt thu ở miền Bắc bằng cặp mồi cặp
mồi BegoA – For1 và BegoA – Rev1
Marker→H2O→VNP4→VNP179 (ladder: 1kb)
https://drivers.vn/
5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
1. Đã phục hồi 2 dòng vi khuẩn A. tumerfaciens mang cấu trúc xâm nhiễm của
PepYLCVNV là AT-VNP93-5-4-11 và AT-VNP93-5-8-1.
2. Đã lây nhiễm PepYLCVNV bằng agroinoculation trên các giống: cà chua
Hồng Lan (T20), ớt Hiểm Lai F1-207, và các cây chỉ thị.
3. Đã lây nhiễm PepYLCVNV bằng bọ phấn (B. tabaci) trên các giống: cà chua
Hồng Lan (T20), cà tím GS505, ớt Hiểm lai F1-207. Kết quả cho thấy giống
thí nghiệm đều biểu hiện triệu chứng bệnh với tỷ lệ 100% nhiễm bệnh khi
lây nhiễm bằng bọ phấn.
4. Xây dựng thành công cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV bằng kỹ thuật
RCA (rolling circle amplification).
5. Đã giải trình tự toàn bộ bộ gen gồm 2 thành phần DNA-A và DNA-B của
mẫu virus gây bệnh trên cây ớt thu tại Đồng Tháp (mẫu VNP1500).
6. Đã kiểm tra PCR với cặp mồi chung để phát hiện begomovirus trên các mẫu
ớt thu thập tại miền Bắc và miền Nam Việt Nam. Kết quả cho thấy có 2/12
(16.7%) mẫu ớt thu tại miền Bắc và 6/12 (50%) mẫu ớt thu tại miền Trung
nhiễm begomovirus.
5.2 Kiến nghị
1. Tiếp tục tối ưu hóa phương pháp lây nhiễm nhân tạo sử dụng vi khuẩn
Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation) đối với PepYLCVNV nhằm
đánh giá được tính gây bệnh của PepYLCVNV.
2. Sử dụng cấu trúc xâm nhiễm PepYLCVNV mới thiết kế để đánh giá tính
gây bệnh của PepYLCVNV.
3. Đánh giá tính gây bệnh của begomovirus gây bệnh trên ớt bằng kỹ thuật
Agroinoculation.
4. Tiếp tục đánh gia đa dạng của begomovirus trên ớt tại Việt Nam. https://drivers.vn/
5.1 Kết luận
1. Đã phục hồi 2 dòng vi khuẩn A. tumerfaciens mang cấu trúc xâm nhiễm của
PepYLCVNV là AT-VNP93-5-4-11 và AT-VNP93-5-8-1.
2. Đã lây nhiễm PepYLCVNV bằng agroinoculation trên các giống: cà chua
Hồng Lan (T20), ớt Hiểm Lai F1-207, và các cây chỉ thị.
3. Đã lây nhiễm PepYLCVNV bằng bọ phấn (B. tabaci) trên các giống: cà chua
Hồng Lan (T20), cà tím GS505, ớt Hiểm lai F1-207. Kết quả cho thấy giống
thí nghiệm đều biểu hiện triệu chứng bệnh với tỷ lệ 100% nhiễm bệnh khi
lây nhiễm bằng bọ phấn.
4. Xây dựng thành công cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV bằng kỹ thuật
RCA (rolling circle amplification).
5. Đã giải trình tự toàn bộ bộ gen gồm 2 thành phần DNA-A và DNA-B của
mẫu virus gây bệnh trên cây ớt thu tại Đồng Tháp (mẫu VNP1500).
6. Đã kiểm tra PCR với cặp mồi chung để phát hiện begomovirus trên các mẫu
ớt thu thập tại miền Bắc và miền Nam Việt Nam. Kết quả cho thấy có 2/12
(16.7%) mẫu ớt thu tại miền Bắc và 6/12 (50%) mẫu ớt thu tại miền Trung
nhiễm begomovirus.
5.2 Kiến nghị
1. Tiếp tục tối ưu hóa phương pháp lây nhiễm nhân tạo sử dụng vi khuẩn
Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation) đối với PepYLCVNV nhằm
đánh giá được tính gây bệnh của PepYLCVNV.
2. Sử dụng cấu trúc xâm nhiễm PepYLCVNV mới thiết kế để đánh giá tính
gây bệnh của PepYLCVNV.
3. Đánh giá tính gây bệnh của begomovirus gây bệnh trên ớt bằng kỹ thuật
Agroinoculation.
4. Tiếp tục đánh gia đa dạng của begomovirus trên ớt tại Việt Nam. https://drivers.vn/
5. Lần đầu tiên phát hiện virus begomovirus trên ớt ở miền Bắc nên cần kiểm
tra lại.https://drivers.vn/
tra lại.https://drivers.vn/
6 TÀI LIỆU THAM KHẢO
6.1 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Hà Viết Cường (2010), Công nghệ sinh học trong bệnh cây.
2. Hà Viết Cường (2012), Virus thực vật, Phytoplasma và Viroid . NXB Đại học
Nông nghiệp.
3. Vũ Triệu Mân (2003), Chẩn đoán nhanh bệnh hại thực vật, NXB Nông
Nghiệp.
4. Vũ Triệu Mân – Lê Lương Tề chủ biên (2001). Giáo trình Bệnh cây Nông
Nghiệp. NXB Nông Nghiệp.
5. Lê Lương Tề, Vũ Triệu Mân (1999), Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng.
NXB Giáo dục, Hà Nội.
6. Nguyễn Thị Hà Uyên (2012). Xác định và đánh giá khả năng gây bệnh của
một số begomovirus trên cây cà chua bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo
dùng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens
6.2 TÀI LIỆU TIẾNG ANH.
1. (1990). "High efficiency transformation of< i> Escherichia coli</i> with
plasmids." Gene 96(1): 23-28.
2. Briddon (2003). "Cotton leaf curl disease, a multicomponent begomovirus
complex." Molecular Plant Pathology 4(6): 427-434.
3. Doyle (1987). "A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh
leaf tissue." Phytochem bull 19: 11-15.
4. Fauquet and Stanley (2005). "Revising the way we conceive and name viruses
below the species level: a review of geminivirus taxonomy calls for new
standardized isolate descriptors." Archives of virology 150(10): 2151-2179.
5. Fauquet, et al. (2008). "Geminivirus strain demarcation and nomenclature."
Archives of virology 153(4): 783-821.
6. Ferreira, et al. (2008). "One-step cloning approach for construction of
agroinfectious begomovirus clones." Journal of virological methods 147(2):
351-354. https://drivers.vn/
6.1 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Hà Viết Cường (2010), Công nghệ sinh học trong bệnh cây.
2. Hà Viết Cường (2012), Virus thực vật, Phytoplasma và Viroid . NXB Đại học
Nông nghiệp.
3. Vũ Triệu Mân (2003), Chẩn đoán nhanh bệnh hại thực vật, NXB Nông
Nghiệp.
4. Vũ Triệu Mân – Lê Lương Tề chủ biên (2001). Giáo trình Bệnh cây Nông
Nghiệp. NXB Nông Nghiệp.
5. Lê Lương Tề, Vũ Triệu Mân (1999), Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng.
NXB Giáo dục, Hà Nội.
6. Nguyễn Thị Hà Uyên (2012). Xác định và đánh giá khả năng gây bệnh của
một số begomovirus trên cây cà chua bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo
dùng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens
6.2 TÀI LIỆU TIẾNG ANH.
1. (1990). "High efficiency transformation of< i> Escherichia coli</i> with
plasmids." Gene 96(1): 23-28.
2. Briddon (2003). "Cotton leaf curl disease, a multicomponent begomovirus
complex." Molecular Plant Pathology 4(6): 427-434.
3. Doyle (1987). "A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh
leaf tissue." Phytochem bull 19: 11-15.
4. Fauquet and Stanley (2005). "Revising the way we conceive and name viruses
below the species level: a review of geminivirus taxonomy calls for new
standardized isolate descriptors." Archives of virology 150(10): 2151-2179.
5. Fauquet, et al. (2008). "Geminivirus strain demarcation and nomenclature."
Archives of virology 153(4): 783-821.
6. Ferreira, et al. (2008). "One-step cloning approach for construction of
agroinfectious begomovirus clones." Journal of virological methods 147(2):
351-354. https://drivers.vn/
1
7. Fujii, et al. (2006). "Error-prone rolling circle amplification: the simplest
random mutagenesis protocol." Nature protocols 1(5): 2493-2497.
8. Gafni and Yedidya (2003). "Tomato yellow leaf curl virus, the intracellular
dynamics of a plant DNA virus." Molecular plant pathology 4(1): 9-15.
9. Ghanim and Czosnek (2000). "Tomato yellow leaf curl geminivirus (TYLCV-
Is) is transmitted among whiteflies (Bemisia tabaci) in a sex-related manner."
Journal of Virology 74(10): 4738-4745.
10. Green (1991). Characteristics and control of viruses infecting peppers: a
literature review, Asian Vegetable Research and Development Center.
11. Green and Kim (1991). Characteristics and control of viruses infecting
peppers: a literature review, Asian Vegetable Research and Development
Center.
12. Green, et al. (2001). "Molecular characterization of begomoviruses associated
with leafcurl diseases of tomato in Bangladesh, Laos, Malaysia, Myanmar, and
Vietnam." Plant Disease 85(12): 1286-1286.
13. Gutierrez, et al. (2004). "Geminivirus DNA replication and cell cycle
interactions." Veterinary microbiology 98(2): 111-119.
14. Ha (2007). "Detection and identification of potyviruses and geminiviruses in
Vietnam."
15. Ha (2008). "Molecular characterization of begomoviruses and DNA satellites
from Vietnam: additional evidence that the New World geminiviruses were
present in the Old World prior to continental separation." Journal of General
Virology 89(1): 312-326.
16. Ha, et al. (2008). "Molecular characterization of begomoviruses and DNA
satellites from Vietnam: additional evidence that the New World
geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation."
Journal of General Virology 89(1): 312-326. https://drivers.vn/
7. Fujii, et al. (2006). "Error-prone rolling circle amplification: the simplest
random mutagenesis protocol." Nature protocols 1(5): 2493-2497.
8. Gafni and Yedidya (2003). "Tomato yellow leaf curl virus, the intracellular
dynamics of a plant DNA virus." Molecular plant pathology 4(1): 9-15.
9. Ghanim and Czosnek (2000). "Tomato yellow leaf curl geminivirus (TYLCV-
Is) is transmitted among whiteflies (Bemisia tabaci) in a sex-related manner."
Journal of Virology 74(10): 4738-4745.
10. Green (1991). Characteristics and control of viruses infecting peppers: a
literature review, Asian Vegetable Research and Development Center.
11. Green and Kim (1991). Characteristics and control of viruses infecting
peppers: a literature review, Asian Vegetable Research and Development
Center.
12. Green, et al. (2001). "Molecular characterization of begomoviruses associated
with leafcurl diseases of tomato in Bangladesh, Laos, Malaysia, Myanmar, and
Vietnam." Plant Disease 85(12): 1286-1286.
13. Gutierrez, et al. (2004). "Geminivirus DNA replication and cell cycle
interactions." Veterinary microbiology 98(2): 111-119.
14. Ha (2007). "Detection and identification of potyviruses and geminiviruses in
Vietnam."
15. Ha (2008). "Molecular characterization of begomoviruses and DNA satellites
from Vietnam: additional evidence that the New World geminiviruses were
present in the Old World prior to continental separation." Journal of General
Virology 89(1): 312-326.
16. Ha, et al. (2008). "Molecular characterization of begomoviruses and DNA
satellites from Vietnam: additional evidence that the New World
geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation."
Journal of General Virology 89(1): 312-326. https://drivers.vn/
2
17. Haible, D., et al. (2006). "Rolling circle amplification revolutionizes diagnosis
and genomics of geminiviruses." Journal of virological methods 135(1): 9-16.
18. Harrison and Robinson (2005). "Another quarter century of great progress in
understanding the biological properties of plant viruses." Annals of applied
biology 146(1): 15-37.
19. Hartz, T., et al. (1997). Processing tomato production in California, UCANR
Publications.
20. Hofgen and Willmitzer (1988). "Storage of competent cells for Agrobacterium
transformation." Nucleic Acids Research 16(20): 9877-9877.
21. Inoue-Nagata, et al. (2004). "A simple method for cloning the complete
begomovirus genome using the bacteriophage φ29 DNA polymerase." Journal
of virological methods 116(2): 209-211.
22. Kheyr-Pour, et al. (1991). "Tomato yellow leaf curl virus from sardinia is a
whitefly-transmitted monoparatite geminivirus." Nucleic Acids Research
19(24): 6763-6769.
23. Knierim and Maiss (2007). "Application of Phi29 DNA polymerase in
identification and full-length clone inoculation of tomato yellow leaf curl
Thailand virus and tobacco leaf curl Thailand virus." Archives of virology
152(5): 941-954.
24. Moriones and Navas-Castillo (2000). "Tomato yellow leaf curl virus, an
emerging virus complex causing epidemics worldwide." Virus Research
71(1): 123-134.
25. Murugan and Uthamasamy (2001). "Dispersal behaviour of cotton whitefly
Bemisia tabaci (Genn.) under cotton based gardenland agro ecosystem of
Coimbatore, Tamil Nadu." MADRAS AGRICULTURAL JOURNAL
88(1/3): 1-6.
26. Navot, N., et al. (1991). "Tomato yellow leaf curl virus: a whitefly-transmitted
geminivirus with a single genomic component." Virology 185(1): 151-161. https://drivers.vn/
17. Haible, D., et al. (2006). "Rolling circle amplification revolutionizes diagnosis
and genomics of geminiviruses." Journal of virological methods 135(1): 9-16.
18. Harrison and Robinson (2005). "Another quarter century of great progress in
understanding the biological properties of plant viruses." Annals of applied
biology 146(1): 15-37.
19. Hartz, T., et al. (1997). Processing tomato production in California, UCANR
Publications.
20. Hofgen and Willmitzer (1988). "Storage of competent cells for Agrobacterium
transformation." Nucleic Acids Research 16(20): 9877-9877.
21. Inoue-Nagata, et al. (2004). "A simple method for cloning the complete
begomovirus genome using the bacteriophage φ29 DNA polymerase." Journal
of virological methods 116(2): 209-211.
22. Kheyr-Pour, et al. (1991). "Tomato yellow leaf curl virus from sardinia is a
whitefly-transmitted monoparatite geminivirus." Nucleic Acids Research
19(24): 6763-6769.
23. Knierim and Maiss (2007). "Application of Phi29 DNA polymerase in
identification and full-length clone inoculation of tomato yellow leaf curl
Thailand virus and tobacco leaf curl Thailand virus." Archives of virology
152(5): 941-954.
24. Moriones and Navas-Castillo (2000). "Tomato yellow leaf curl virus, an
emerging virus complex causing epidemics worldwide." Virus Research
71(1): 123-134.
25. Murugan and Uthamasamy (2001). "Dispersal behaviour of cotton whitefly
Bemisia tabaci (Genn.) under cotton based gardenland agro ecosystem of
Coimbatore, Tamil Nadu." MADRAS AGRICULTURAL JOURNAL
88(1/3): 1-6.
26. Navot, N., et al. (1991). "Tomato yellow leaf curl virus: a whitefly-transmitted
geminivirus with a single genomic component." Virology 185(1): 151-161. https://drivers.vn/
3
27. Padidam, et al. (1999). "Possible emergence of new geminiviruses by frequent
recombination." Virology 265(2): 218-225.
28. Picó, et al. (1996). "Viral diseases causing the greatest economic losses to the
tomato crop. II. The Tomato yellow leaf curl virus—A review." Scientia
Horticulturae 67(3): 151-196.
29. Picó, B., et al. (1996). "Viral diseases causing the greatest economic losses to
the tomato crop. II. The Tomato yellow leaf curl virus—a review." Scientia
Horticulturae 67(3): 151-196.
30. Rybicki (1994). "A phylogenetic and evolutionary justification for three
genera of Geminiviridae." Archives of Virology 139(1-2): 49-77.
31. Sambrook, et al. (1989). "Extraction and purification of plasmid DNA."
Molecular cloning: a laboratory manual 1: 1.21-21.52.
32. Wang, et al. (1993). "A simple method of preparing plant samples for PCR."
Nucleic Acids Res 21(17): 4153-4154.
33. Wang, T. C., et al. (1994). "Mammary hyperplasia and carcinoma in MMTV-
cyclin D1 transgenic mice."
34. Wu, et al. (2008). "A simplified method of constructing infectious clones of
begomovirus employing limited restriction enzyme digestion of products of
rolling circle amplification." Journal of virological methods 147(2): 355-359.
35. Wyant, et al. (2011). "The genomes of four novel begomoviruses and a new
Sida micrantha mosaic virus strain from Bolivian weeds." Archives of
virology 156(2): 347-352.
36. Zhang, et al. (2001). "Movement proteins (BC1 and BV1) of Abutilon mosaic
geminivirus are cotransported in and between cells of sink but not of source
leaves as detected by green fluorescent protein tagging." Virology 290(2):
249-260.
6.3 CÁC TRANG WEB
1. http://www.avrdc.org
2. http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html https://drivers.vn/
27. Padidam, et al. (1999). "Possible emergence of new geminiviruses by frequent
recombination." Virology 265(2): 218-225.
28. Picó, et al. (1996). "Viral diseases causing the greatest economic losses to the
tomato crop. II. The Tomato yellow leaf curl virus—A review." Scientia
Horticulturae 67(3): 151-196.
29. Picó, B., et al. (1996). "Viral diseases causing the greatest economic losses to
the tomato crop. II. The Tomato yellow leaf curl virus—a review." Scientia
Horticulturae 67(3): 151-196.
30. Rybicki (1994). "A phylogenetic and evolutionary justification for three
genera of Geminiviridae." Archives of Virology 139(1-2): 49-77.
31. Sambrook, et al. (1989). "Extraction and purification of plasmid DNA."
Molecular cloning: a laboratory manual 1: 1.21-21.52.
32. Wang, et al. (1993). "A simple method of preparing plant samples for PCR."
Nucleic Acids Res 21(17): 4153-4154.
33. Wang, T. C., et al. (1994). "Mammary hyperplasia and carcinoma in MMTV-
cyclin D1 transgenic mice."
34. Wu, et al. (2008). "A simplified method of constructing infectious clones of
begomovirus employing limited restriction enzyme digestion of products of
rolling circle amplification." Journal of virological methods 147(2): 355-359.
35. Wyant, et al. (2011). "The genomes of four novel begomoviruses and a new
Sida micrantha mosaic virus strain from Bolivian weeds." Archives of
virology 156(2): 347-352.
36. Zhang, et al. (2001). "Movement proteins (BC1 and BV1) of Abutilon mosaic
geminivirus are cotransported in and between cells of sink but not of source
leaves as detected by green fluorescent protein tagging." Virology 290(2):
249-260.
6.3 CÁC TRANG WEB
1. http://www.avrdc.org
2. http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html https://drivers.vn/
4
3. http://wcrc.confex.com
4. http://www.informaworld.com
5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
https://drivers.vn/
3. http://wcrc.confex.com
4. http://www.informaworld.com
5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
https://drivers.vn/
Categories
GeneralDownload
Download Slideshow Get the original presentation fileQuick Actions
Statistics
- Views 11
- Slides 95
- Age 417 days
Related Slideshows
22
Pray For The Peace Of Jerusalem and You Will Prosper
RodolfoMoralesMarcuc
45 views
26
Don_t_Waste_Your_Life_God.....powerpoint
chalobrido8
49 views
31
VILLASUR_FACTORS_TO_CONSIDER_IN_PLATING_SALAD_10-13.pdf
JaiJai148317
44 views
14
Fertility awareness methods for women in the society
Isaiah47
41 views
35
Chapter 5 Arithmetic Functions Computer Organisation and Architecture
RitikSharma297999
43 views
5
syakira bhasa inggris (1) (1).pptx.......
ourcommunity56
42 views