Métodos de conservación de microorganismos.pptx

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1. Métodos de conservación de microorganismos División: Químico - Biológicas Materia: Ingeniería de las fermentaciones Grupo: 10IBT1 Alumnos: Aguilar González David Alejandro Castillo Nava Alan Omar Domínguez Lora Luis García Moncada Elizabeth Gutiérrez Sandoval María Teresa Linares Soledad Daniela Lilian Ramírez Sánchez Jesús

2. Introducción: ¿Qué debemos saber? M icroorganismos  M ateriales esenciales de trabajo en la obtención de medicamentos (antibióticos, vitaminas y aminoácidos), elaboración de alimentos (pan, queso, leche, bebidas y licores) y fabricación de solventes y reactivos, entre otras aplicaciones. El creciente uso de estos materiales biológicos en la biotecnología y la protección medioambiental han fortalecido la necesidad de mantener los cultivos microbianos de manera que las propiedades que los hacen importantes permanezcan estables.

3. Características que deben cumplir los métodos de conservación El cultivo a preservar debe ser puro , evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de conservación. Durante el tiempo de conservación deben sobrevivir al menos el 70-80% de las células y que estas células permanezcan genéticamente estables.

4. Criterios para la elección del método Deben considerarse: Viabilidad y pureza de las cepas. Cambios poblacionales y genéticos. Número y valor de los cultivos. Costo, suministro y transporte de cepas. Frecuencia del uso de los cultivos. Federación Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC, por sus siglas en inglés) , enuncia que por seguridad y para minimizar la probabilidad de pérdida de las cepas, cada una debe ser mantenida por al menos 2 procedimientos diferentes.

5. Comprobación de viabilidad de las cepas

6. Objetivo: Reducir el ritmo metabólico de los organismos por retención de nutrientes, agua y oxígeno; por reducción de la temperatura de conservación; o por combinación de ambos. Se agrupan en tres grandes grupos : Métodos a largo y corto plazo y métodos alternativos.

7. MÉTODOS DE CONSERVACIÓN A LARGO PLAZO Garantizan la estabilidad genética. Son los más utilizados en microorganismos que han sido sujetos a manipulaciones genéticas. Permiten evaluar medicamentos con alto potencial genotóxico y carcinogénico Test de Ames , (cepas his de Salmonella typhimurium ), caracterizadas a nivel genético-molecular, evalúa el crecimiento de bacterias que hayan experimentado reversiones. Entre estos métodos se encuentran la congelación y la liofilización.

8. Congelación Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector (y se guardan a temperaturas inferiores a cero grados centígrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las células de agua en forma líquida, no hay crecimiento. Factores que influyen en el método: Edad de las células: células maduras del inicio de la fase estacionaria Velocidad en la congelación y descongelación: Conviene poner las células a 37ºC Temperatura de almacenamiento: tubos cerrados o sellados, que contengan las células microbianas, sumergidos en nitrógeno líquido (–195ºC), o bien en la fase gaseosa del nitrógeno líquido, con una temperatura de (–140ºC) .En el mercado existen variados tipos de armarios congeladores, de los cuales los más aconsejables son los que alcanzan temperaturas por debajo de –70ºC. Empleo de agentes crioprotectores : glicerol, a una concentración del 15 al 20%, dimetilsulfóxido , la leche descremada y carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa, inositol, sucrosa , entre otros).

9. Congelación

10. Liofilización Es una técnica de sublimación al vacío (eliminación del agua de una sustancia congelada por sublimación del hielo bajo vacío) Los productos de liofilización son higroscópicos y deben protegerse de la humedad durante el almacenamiento. Lioprotector (generalmente sacarosa) Los cultivos liofilizados se almacenan en la oscuridad a 4 ° C en refrigeradores. Viabilidad: Durante más de 20 años. Es muy ventajoso ya que solo se requiere un mínimo espacio de almacenamiento para preservar.

11. Liofilización

12. Factores que influyen en la liofilización 1. Tipo de microorganismo: Algunos no resisten el método. 2. Concentración celular : Suspensiones celulares de bacterias [108-109 células/ml] y un poco inferior para hongos filamentosos y levaduras. 3. Temperatura durante la sublimación: > - 50°C 4. Grado de deshidratación alcanzado 5. Atmósfera de oxígeno en el tubo 6. Condiciones de almacenamiento: 20°C y sin bajar de los 0ºC, en oscuridad

13. Liofilizador

14. Almacenamiento en suelo estéril Se aplica principalmente para la preservación de microorganismos esporulantes : Fusarium, Penicillium , Alternaria, Rhizopus , entre otros. Implica la inoculación de 1 ml de suspensión de esporas en el suelo y la incubación a temperatura ambiente durante 4-5 días. El período de crecimiento inicial permite que el hongo use la humedad disponible y que se vuelva inactivo gradualmente. Las ampolletas se almacenan en el refrigerador. Viabilidad: Alrededor de 70-80 años.

15. Almacenamiento en suelo estéril

16. Almacenamiento en aceite mineral o parafina líquida Se vierte parafina líquida estéril sobre el cultivo inclinado de microorganismos y se almacena en posición vertical a temperatura ambiente. También se pueden mantener cubriendo las inclinaciones de agar con aceite mineral estéril que se almacena a temperatura ambiente o preferiblemente a 0-5 ° C. Limita el acceso de oxígeno, reduciendo el metabolismo y el crecimiento del microorganismo, así como el secado celular. Período de conservación: Azotobacter y Mycobacterium es de 7-10 años, para Bacillus es de 8-12 años.

17. Almacenamiento en suspensión salina El cultivo bacteriano se conserva en una concentración de sal al 1% en tubos con tapa de rosca para evitar la evaporación. Los tubos se almacenan a temperatura ambiente. Cuando sea necesario, la transferencia se realiza en Agar Slant .

18. Criopreservación Congelación en nitrógeno líquido (-196 ° C) o en estado gaseoso (-150 ° C). Los moo’s se congelan en presencia de agentes estabilizadores como el glicerol o el dimetilsulfóxido (DMSO) que previenen el daño celular debido a la formación de cristales de hielo y promueven la supervivencia celular . Viabilidad: 10-30 años sin sufrir cambios en sus características.

19. Criopreservación

20. Inmersión en agua destilada Método económico y de bajo mantenimiento para almacenar cultivos de hongos que espurulan . Temperatura: 20 ° C, Viabilidad: hasta 2-10 años dependiendo de la especie. Implica inocular las inclinaciones de agar con cultivos de hongos y luego incubarlos a 25 ° C durante varias semanas para inducir la esporulación. Se agrega agua destilada estéril (6-7 ml) asépticamente al cultivo, y la superficie del cultivo se raspa suavemente con una pipeta para producir una espora y una suspensión de micelio. Se mantiene en un vial de vidrio estéril a 25 ° C y para recuperar un cultivo, se extraen 200-300 µl de la suspensión del vial y se colocan en medio fresco.

21. Almacenamiento en gel de sílice

22. Almacenamiento en gel de sílice Los mo’s se pueden almacenar en polvo de gel de sílice a baja temperatura durante un período de 1 a 2 años. Desecación rápida a baja temperatura, lo que permite que la célula permanezca viable durante un largo período de tiempo. Algunas de las especies que se conservan en gel de sílice anhidro son: Saccharomyces cerevisiae , Aspergillus nidulans , Pseudomonas denitrificans , Escherichia coli , entre otros.

23. MÉTODOS A CORTO PLAZO No se pueden emplear otros métodos debido a: Carecer de los equipos necesarios. La cepa no resiste los tratamientos de la conservación por otros métodos. Las cepas contienen construcciones genéticas especificas o características especiales que se utilicen para medir el efecto de toxicológico de un fármaco. Se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos.

24. Transferencia periódica o subcultivo La cepa microbiana  C ultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido. Excretan productos tóxicos del metabolismo que se acumulan provocando envejecimiento y muerte celulares. Es el peor método para conseguir la estabilidad genética, (alternancia de generaciones). Es aconsejable retardar el envejecimiento y alargar los periodos entre dos resiembras, de varias maneras como por ejemplo: disminuyendo la cantidad de inóculo; rebajando la proporción de algunos nutrientes en el medio de cultivo; inoculando en picadura los microorganismos que son anaerobios facultativos y almacenando los cultivos a 4ºC-8ºC. Se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral estéril para evitar en la medida la desecación del medio de cultivo,. Los hongos filamentosos, no se pueden guardar en tubos completamente cerrados. Por último, La contaminación de los cultivos resulta más fácil al tener que manejar los tubos a lo largo del tiempo.