MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS: “NESTED PCR O PCR ANIDADA”

La PCR anidada es una modificación de la PCR diseñada para aumentar la sensibilidad de la reacción del ensayo. Esta modificación consta de dos grupos de cebadores dirigidos contra la misma diana. El primer grupo de cebadores se desarrolla de la manera usual, mientras que el segundo grupo son cebadores situados internamente o anidados con respecto al primer grupo.

1. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS : “NESTED PCR O PCR ANIDADA” SEMINARIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR INTEGRANTES : BELTRÁN UBE CARLOS GUERRERO MACIAS SELENA PEÑAFIEL JESÚS GRUPO #7 DOCENTE: Blgo. Saúl Escobar

2. NESTED PCR O PCR ANIDADA La PCR anidada es una modificación de la PCR, diseñada para aumentar la sensibilidad de la reacción del ensayo. Esta modificación consta de dos grupos de cebadores dirigidos contra la misma diana. El primer grupo de cebadores se desarrolla de la manera usual, mientras que el segundo grupo son cebadores situados internamente o anidados con respecto al primer grupo. ESPECIFICIDAD La especificidad de la PCR ANIDADA depende, fundamentalmente, de la temperatura empleada en la fase de hibridación y de la cantidad de iones divalentes que se incorporan a la reacción (además de depender de la secuencia de los cebadores).

3. COMPONENTES DE LA PCR ANIDADA Sabemos que el objetivo de la reacción en cadena de la polimerasa es obtener muchas copias de un fragmento de DNA, para después poder visualizar este fragmento y utilizarlo en otras aplicaciones si es necesario. Para alcanzar este resultado, se necesita: El DNA a partir del cual queremos obtener una copia de un fragmento, es decir, el DNA que queremos amplificar. Este DNA se conoce como DNA molde. Una enzima capaz de generar una copia de DNA a partir del DNA molde: una DNA polimerasa. La reacción se lleva a cabo en un tampón apropiado para el funcionamiento de la enzima polimerasa. Además, como cofactores de la polimerasa se añaden cationes divalentes, generalmente en forma de cloruro de magnesio (MgCl2). Iniciadores de la reacción: Las enzimas DNA polimerasas únicamente son capaces de añadir nucleótidos al extremo 3’ libre de una doble cadena de DNA. Nucleótidos libres: las enzimas DNA polimerasas van a crear una cadena complementaria a la cadena molde mediante la incorporación de nucleótidos al extremo 3’ libre del cebador que se ha unido a la cadena molde.

4. PASOS PARA REALIZAR PCR ANIDADA

5. Desnaturalización La primera reacción consiste en la desnaturalización del DNA, separándose las dos cadenas por ruptura de los enlaces de hidrógeno. Las condiciones típicas de desnaturalización son 95ºC por 30 segundos, o 97ºC por 15 segundos; sin embargo temperaturas más altas pueden ser apropiadas especialmente para templados ricos en G + C Alineamiento La segunda reacción consiste en la hibridación de los primers. Para ello se baja la temperatura y las condiciones serán tales que se facilitará la unión de los primers a las cadenas. La temperatura y el tiempo requerido para el alineamiento de los primers dependen de la composición, tamaño y concentración de los primers amplificadores. Una temperatura de alineamiento óptima es 5ºC por debajo del Tm de los primers.

6. Extensión La tercera reacción se efectúa a 72º C, temperatura a la cual, la polimerasa lleva a cabo su acción, insertando los diferentes nucleótidos complementarios en el orden que le va indicando la cadena que actúa como molde. El tiempo de extensión depende de la longitud y concentración de la secuencia blanco y de la temperatura. La extensión del primer se realiza tradicionalmente a 72ºC. CICLOS Las nuevas cadenas de ADN creados en la etapa de extensión y las plantillas de ADN originales se desnaturalizan por calentamiento de la reacción, y otra ronda o ciclo de PCR comienza. El ciclismo es esencialmente tomando desnaturalización, hibridación y extensión y haciendo una y otra vez. La polimerasa de ADN de la termófilo T. aquaticus se utiliza para construir nuevas cadenas de ADN en la PCR debido a que la etapa de desnaturalización utiliza para separar las hebras de ADN no afecta a la polimerasa. Por lo tanto, las etapas se pueden repetir muchas veces, cada vez con más plantilla de ADN disponible para la hibridación del cebador y extensión por la polimerasa. La cantidad de ADN aumenta exponencialmente, generando cantidades utilizables de ADN de alta calidad en un tiempo relativamente corto.

7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS BioPharmaceutical Technology Center. (2013). BioPharmaceutical Technology Center . Obtenido de BioPharmaceutical Technology Center: http://www.btci.org/k12/bft/pcr/pcr_geneticscreening.html Prats, P. G. (2005). Limitaciones de la PCR. En P. G. Prats, Microbiología Clínica (pág. 196). Madrid : Editorial Médica Panamericana. Prats, P. G. (2005). Marcado de los amplicones . En P. G. Prats, Microbiología Clínica (pág. 196). Madrid: Editorial Médica Panamericana. Prats, P. G. (2005). Ventajas de la Nested PCR. En P. G. Prats, Microbiología Clínica (pág. 196). Madrid : Editorial Médica Panamericana.