Métodos de Transformação Genética

2. Métodos
-diretos- causam danos
-indiretos – não causam danos

3. Eletroporação de protoplastos:
É um método utilizado para introduzir
macromoléculas em células vegetais.
 Protoplastos são células vegetais desprovidas de
paredes celulares e, teoricamente, podem ser
isoladas de qualquer tecido vegetal.
Em condições bem estabelecidas de cultura de
tecidos, os protoplastos reconstituem suas
paredes, dividem-se, formam colônias, calos e
regeneram plantas.

4. A eletroporação consiste na indução de poros
reversíveis em membranas celulares,
resultando em fluxo de íons e moléculas
através da membrana deformada.
Por meio da eletroporação de protoplastos
diferentes genes foram incorporados ao
genoma de diversas plantas (transformação
estável), conferindo-lhes novas características

5. PEG
Policátions,como o polietilenoglicol (PEG) pode ser
usado com agente químicos que permitem a passagem
passiva do DNA para dentro da célula vegetal.
No contato do protoplastos com os policátions, a
permeabilidade da membrana é aumentada pela
interação das cargas positivas dos policátions com as
cargas negativas do Dna e da membrana,facilitando a
penetração daquele.
Os policátions também protegem o DNA exógeno contra
a ação das nucleases da célula vegetal.

6. A maior limitação do uso desta técnica consiste
na obrigatoriedade do uso de protoplastos.

7. Bombeamento de partículas
A biobalística utiliza microprojéteis em alta
velocidade para introduzir ácidos nucléicos e
outras moléculas em células e tecidos in vivo

8. Introduzir o DNA na célula, rompendo a barreira da
parede celular e da membrana plasmática, sem o uso
de vetores biológicos;
Microprojéteis de ouro ou tungstênio, cobertos com
moléculas de DNA, são acelerados a alta velocidade, o
que possibilita sua penetração em células intactas;
Foram baseados na geração de micropartículas de uma
onda de choque com energia sufíciente para deslocar
uma membrana carreadora contendo as
micropartículas cobertas com DNA;
Arroz, algodão, feijão, soja, milho, trigo,cevada, aveia .

10.  Agrobacterium
Bactéria existente no solo, foi o primeiro
vetor utilizado na transformação genética
de plantas.
 No meio natural esta bactéria provoca a
formação de tumores. Estes tumores
mantêm a capacidade de crescerem
mesmo depois de a bactéria ser
eliminada, capacidade resultante da
transferência à célula vegetal de um
fragmento de DNA localizado numa
molécula circular (plasmídio),
independente do seu cromossoma

11. Penetração da bactéria no tecido vegetal através de uma lesão
sofrida;
As bactérias são atraídas pelas moléculas-sinal;(compostos
fenólicos, açúcares eaminoácidos);
As moléculas-sinal vão também ativar genes – plasmídeo Ti;
Proteínas codificadas pelos genes vir vão promover a transferência -
plasmídio Ti da bactéria para a célula vegetal;
Denominada T-DNA; Duas seqüências repetidas de 25 pb;
No núcleo da célula, o T-DNA é integrado, de forma estável, no
genoma vegetal;
No genoma vegetal, - oncogenes, são transcritos, codificando
enzimas - na via de biossíntese de hormônios vegetais (citocininas e
auxinas);
células transformadas proliferam desordenada, levando à formação
de um tumor, - galha-da-coroa.

13. A hibridização in situ é uma técnica
baseada na detecção de pequenos
segmentos de DNA ou RNA a partir de
"sondas" específicas. 

14. As sondas são seqüências de nucleotídeos
complementares desenvolvidas a partir de
segmentos conhecidos do DNA ou RNA que se
deseja identificar. 
Para permitir a visualização da reação entre as
moléculas de DNA ou RNA em estudo e as sondas,
estas podem ser associadas a moléculas
radioativas, fluorescentes ou biotiniladas (esta
última de forma semelhante à técnica de imuno-
histoquímica).