Materi 6_Teknik Mempelajari Selllll.pptx

Teknik Mempelajari Sel

1. TEKNIK MEMPELAJARI SEL FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA 2020 Dr. Puji Sari, MS Departemen Biologi Kedokteran Program Magister Ilmu Biomedik

2. 01 02 OVERVIEW PENDAHULUAN TEKNIK-TEKNIK MEMPELAJARI SEL Teknik Mikroskopi Teknik Biokimia Biakan In-vitro

3. Sel merupakan unit kehidupan paling sederhana , unit yang membentuk dasar semua struktur , fungsi , pertumbuhan dan reproduksi . Mengetahui struktur dan fungsi unit terkecil kehidupan . Mempelajari sel PENDAHULUAN

4. Teknik Mikroskopi Teknik Biokimia Biakan In-Vitro TEKNIK-TEKNIK MEMPELAJARI SEL

5. TEKNIK MIKROSKOPI Teknik Mikroskopi Mikroskop Cahaya SEM TEM Mikroskop Elektron Mikroskop Binokuler Mikroskop Fase Kontras Mikroskop Flouresens

6. TEKNIK MIKROSKOPI Mikroskop Cahaya Mikroskop Fase Kontras Menggunakan kondensor khusus untuk membantu membuang cahaya keluar dari fase . Umumnya digunakan untuk melihat sel di keadaan hidup . Mikroskop Flouresens Target spesifik dilabel dengan zat berpendar . Umumnya digunakan untuk melihat struktur spesifik di dalam sel , misalnya kromosom . Mikroskop Binokuler Menggunakan dua lensa okuler . Sering disebut mikroskop konvensional karena masih menggunakan matahari sebagai sumber cahaya .

7. TEKNIK MIKROSKOPI Mikroskop Elektron SEM TEM Sampel disiapkan sangat tipis sehingga elektron dapat menembus sampel , kemudian hasil dari tembusan elektron tersebut diolah menjadi gambar . Sampel tidak ditembus oleh elektron sehingga hanya pendaran hasil dari tumbukan elektron dengan sampel yang ditangkap oleh detektor dan diolah .

8. TEKNIK MIKROSKOPI Bagian-bagian Mikroskop Binokuler

9. TEKNIK MIKROSKOPI Mikroskop Flouresens Mikroskop Fase Kontras

10. TEKNIK MIKROSKOPI SEM TEM

11. TEKNIK BIOKIMIA Bertujuan untuk mempelajari sel secara analitik yakni menganalisa organisasi molekuler sel dan peran molekul tertentu dalam sel ( metabolisme ). Pada eukariot umumnya molekul yang akan dipelajari diisolasi dan dianalisis sifat fisik , kimia dan biologi sehingga dapat diinterpretasikan fenomena kehidupan sel seperti organisasi sel , metabolisme , reproduksi , motilitas , dsb . Pada prokariot umumnya dilakukan uji biokimiawi untuk menilai aspek metabolisme dan gerak bakteri .

12. Contoh Teknik Biokimia : FRAKSINASI SEL SEL Homogenat Sentrifugasi Supernatan Pelet Sentrifugasi dengan kecepatan lebih tinggi Supernatan Pelet T erdiri atas struktur-struktur lebih besar yang terkumpul di bagian bawah tabung sentrifuge P elet yang lebih ringan atau kecil daripada pelet pertama T erdiri atas bagian-bagian sel yang lebih kecil yang tersuspensi dalam cairan di atas pellet

13. FRAKSINASI SEL Sel dihomogenisasi terlebih dahulu untuk membuat bagian-bagian sel menjadi halus . Sel kemudian disentrifugasi . Setiap organel sel dapat mengendap secara bertahap berdasarkan beratnya .

14. Contoh Teknik Biokimia : KROMATOGRAFI

15. TEKNIK BIAKAN IN-VITRO Proses perpindahan sel dari suatu makhluk hidup ke dalam medium terkontrol yang sesuai untuk pertumbuhan sel tersebut . KULTUR SEL IN-VITRO “di dalam kaca ” Bertujuan untuk mengetahui pertumbuhan sel , diferensiasi , fisiologi dan biokimia serta proses penuaan dan kematian sel. Pada teknik ini digunakan pendekatan sedemikian rupa sehingga dihasilkan biakan yang sama atau mendekati kondisi aslinya (in-vivo).

16. Keuntungan : 1. Lingkungan pertumbuhan dapat dikontrol agar keseragaman sampel . 2. Karakteristik sel dapat dipertahankan hingga beberapa generasi menyebabkan reproduksi berlangsung baik . 3. Kultur sel dapat di treatment dengan reagen , radio- kimia , dan obat - obatan . 4. Menghindari masalah etik hewan coba . Kekurangan : 1. Harus mengembangkan teknik standar untuk menjaga sel-sel sehat direproduksi untuk eksperimen 2. Membutuhkan waktu untuk mempelajari teknik aseptik 3. Jumlah material terbatas 4. Dediferensiasi dan seleksi dapat terjadi sehingga banyak mekanisme selular asli dapat hilang .

17. Jenis kultur 1.Kultur Organ Kultur dari jaringan undisaggregated untuk mempertahankan beberapa atau semua fitur dari jaringan in vivo, 2. Kultur Sel Sel tunggal , tidak lagi sebagai jaringan . Berasal dari sel-sel tersebar diambil dari jaringan asli , misalnya kultur whole blood,BMP , 3. Kultur Sel Primer Berasal dari eksplan , langsung dari jaringan hewan / manusia . Membutuhkan media kultur in vitro dengan komposisi dasar : sumber energi ( Karbohidrat , lipid), Building block ( nukleotida , peptida ), kofaktor (vitamin, ion-ion anorganik lain), GF (serum), Stimulator ( hormon ).

18. Syarat Biakan sel Sterilitas : sterilisasi peralatan dan bahan , teknik aseptik , Suhu : 37C pH : 7,2-7,4 bufer Tekanan osmotik  medium, tergantung pada jenis sel Tekanan gas  15-75 mm Hg, 95% udara+5% CO2 Media kultur : Growth Factor : FBS, CS Mitogen (PHA, PWM) Kandungan nutrisi & glukosa yang optimal Plating density

19. Sterilitas Sterilisasi ruang : radiasi UV, fumigasi formalin tablet Sterilisasi alat Panas : basah-autoklaf , rebus, kering  oven, bakar . Sterilisasi bahan Tahan panas : autoklaf , filtrasi Tidak tahan panas : filtrasi  saringan /filter bakteri (0,2 – 0,45 µm Biosafety cabinet  laminar airflow

20. Teknik aseptik Tangan  sabun bakterisidal , alkohol 70%. Rambut diikat / topi khusus Perhiasan : - Meja biakan : biakan sel  desinfektan , alkohol 70% Di dalam ruang kultur : pakai masker, sarung tangan , Labjas , sandal khusus , waterbat

21. Teknik aseptik Semua alat dan bahan sudah dipersiapkan sebelumnya Jika menggunakan spesimen yang berbeda , alat juga beda Tidak diperkenan : banyak bicara , batuk , bersin . Kerja sampai selesai , jangan ditunda . Tidak boleh keluar-masuk ruang . Jika sedang kultur , tidak boleh banyak orang keluar masuk ruang

22. Peralatan Alat penyimpanan : Freezer : -20, -80ºC, kulkas , tabung liquid nitrogen. Alat besar : laminar flow, inkubator CO2, mikroskop inversi , pH meter dll Tempat bahan habis pakai : Baker glass,Botol Duran,

23. Bahan Habis Pakai Tempat biakan : flask, petri disk, multi well Spesimen Medium, aditif , bufer Mitogen : PHA, PWM Antibiotika : Penisilin-Streptomisin . Antikoagulasi , medium separasi , enzim ( tripsin , colagenasi Anti fungisida

24. BAHAN-BAHAN YANG DIGUNAKAN : Pada waktu kultur : a. Medium dasar : RPMI 1640, GMEM, EMEM,DMEM b. Growth Factor : Fetal Bovine Serum (FBS), Platelet Rich Plasma (PRP) c. Media suplemen : penisilin , streptomisin a. Pada waktu sub kultur : Tripsin , kolagenase +EDTA b. Pencucian : PBS

25. Persiapan kultur : a. Ruang atau area untuk kultur dipapar ultraviolet (UV) untuk mempertahankan sterilitas . b. Laminar airflow horizontal. c. Incubator CO2. d. Autoclave d. Mikroskop inverted.

26. Biosafety dan Pembuangan limbah 1. Semua material dari sel hewan ataupun sel manusia yang potensial infeksius , diperlakukan dengan hatii-hati . 2. Semua limbah harus diautoklaf . 3. Pipet , termos , wadah lain dan sarung tangan yang digunakan , sudah steril . 4. Sampah dimasukkan dalam kantong di sisi laminar air flow. 5. Limbah cair dimasukkan ke dalam botol , harus diautoklaf . Botol-botol ini mengandung disinfektan berbasis klorin

27. Proses Pembuatan biakan sel Sel akan berproliferasi membentuk lapisan monolayer. Jika 2 sel yang berdekatan saling bersinggungan ( membentuk contact inhibition )  pertumbuhan akan terhenti & kultur menjadi stabil . Sel dari suatu kultur dapat dipindahkan ke media kultur baru  Proses replating / sub kultur . Proses subkultur dapat berlangsung berkali -kali  Kultur Sekunder . Satu kali subkultur = satu kali pasasi /passage. Siklus pasasi bergantung pada : spesies , umur jaringan , tingkat diferensiasi , contoh pada jaringan kultur embrio manusia berusia 4 bulan , dapat dilakukan pasasi 50 kali, kultur sel jaringan manusia dewasa berusia 40 thn  dapat dilakukan 20 kali.

28. Proses Pembuatan biakan sel Jika satu sel dari suatu kultur disubkultur beberapakali - diperoleh populasi sel identik , disebut KLON . Klon yang disubkultur dari kultur sel yang sudah dipatenkan ( teridentifikasi secara legal) disebut Established cell line. Sel yang sudah konfluen, dapat disimpan dengan terlebih dulu dikriopreservasi. Pada kultur mesenkimal stem cell umumnya menggunakan 1 mL medium pembekuan terdiri 0,9 mL suspensi sel + 0,1 mL bahan krioprotektan berupa DMSO dalam cryovial. Cryovial  -80 C selama 24 jam, kemudian ke dalam liquid nitrogen -196 C.

29. Contoh Penerapan Teknik Biakan Sel Kultur Sel Punca ( Mesenchymal Stem Cells ) Isolasi Sel dari Jaringan Propagasi Sel pada Wadah Kultur Karakterisasi Sel Panen Sel Jaringan dicuci , dicacah , dan didigesti dengan enzim yang mendigesti matriks antarsel . Larutan hasil digesti disaring , disentrifugasi dan pellet diresuspensi dengan medium untuk ditanam . Karakterisasi sel dilakukan untuk mengetahui apakah sel yang telah diisolasi sesuai dengan yang diharapkan . Karakterisasi MSC dilakukan dengan identifikasi marka permukaan sel menggunakan alat flowcytometry . Sel yang telah mencapai konfluensi 90%, mediumnya disedot , dicuci PBS, dan diberi enzim Tryple Select untuk melepasnya dari wadah . Setelah sel berhasil lepas , sel disentrifugasi dan pelletnya diresuspen dengan medium. Sel sudah dapat diproses untuk perlakuan lanjutan . Sel dikultur pada medium komplit yang mengandung antibiotic, antifungi , asam amino, serum, dan medium basal. Sel ditumbuhkan dalam inkubator dengan suhu 37oC dan kadar CO2 5%.

30. Contoh Penerapan Teknik Biakan Sel Kultur Sel Punca ( Mesenchymal Stem Cells ) Isolasi sel dari jaringan . Dilakukan dalam kondisi steril di dalam Bio Safety Cabinet . Hasil karakterisasi marka permukaan sel menggunakan flowcytometry .

31. Contoh Penerapan Teknik Biakan Sel Kultur Sel Punca ( Mesenchymal Stem Cells ) Kultur sel dilakukan pada kondisi steril di dalam Bio Safety Cabinet . Morfologi sel punca mesenkimal diamati di bawah mikroskop inverted.

32. Video Kultur Sel In-Vitro PLAY VIDEO https://www.youtube.com/watch?v=CMRKKl9XSDU

33. TERIMA KASIH FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA 2020