Medios de cultivo y siembra

MEDIOS DE CULTIVO Y SIEMBRA

1. UNIVERSIDAD DE CUENCA


FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
POSTGRADO DE PERIODONCIA
Microbiología

MEDIOS DE CULTIVO Y SIEMBRA




Cuenca, enero del 2016

2. MEDIOS DE CULTIVO Y SIEMBRA
MEDIOS DE CULTIVO
Es una solución equilibrada de los nutrientes y factores de crecimiento
necesarios para la multiplicación y desarrollo de los microorganismos en el
laboratorio. Con el objetivo de aislar e identificar las diferentes especies o levar
a cabo estudios complementario.
No existe un medio de cultivo universal para todas ellas, pues los
microorganismos presenta gran diversidad metabólica y mientras hay
microorganismos capases de crecer en cualquier medio, otros requieren medios
especiales, en tanto que otros no cresen en ningún medio.
CONDICIONES QUE DEBE CUMPLIR
Los medios de cultivo deben cumplir con ciertos requisitos:
1. Nutrientes adecuados
2. Humedad suficiente
3. Un pH ajustado
4. Estar estéril inicialmente

La mayoría de medios de cultivos traen sus componentes previamente
mesclados que tan solo requiere adición de agua.
CONSTITUYENTES HABITUALES
Agua: componente básico, es utilizado para disolver los demás constituyentes,
generalmente se la emplea destilada o desionizada y no debe contener cloro,
plomo o detergente.
Extractos: pulverizados de órganos o tejidos animales o vegetales, como
cerebro, carne o semillas, que proporcionan los hidratos de carbono,
compuestos nitrogenados, vitaminas hidrosolubles, compuestos azufrados y
sales.
Peptona: producto de la digestión de sustancias proteicas, usado como fuente
de carbono, nitrógeno y energía.

3. Hidratos de carbono: otorga energía, oxigeno nitrógeno y carbono. El más
usado es la glucosa pero puede ser usado también fructosa, sacarosa, lactosa y
almidón.
Cloruro de sodio: no es imprescindible, pero regula las propiedades osmóticas,
con el fin de evitar fenómeno de plasmólisis.
Líquidos corporales: sangre entera plasma o suero sanguíneo tanto de origen
animal como humano, usados para aporte de factores de crecimiento.
Sistemas amortiguadores: sales como fosfato bisodico o potásico, mantiene el
pH dentro del espectro de crecimiento microbiano, y como fuente de fosforo.
Iniciadores de pH: usados para dar prueba visual de las variaciones del pH.
Agentes reductores: tales como la cisteína y el tioglicolato de sodio; crean
atmosfera atractiva para el crecimiento de microorganismo anaerobios aerobios
facultativos y estrictos.
Agentes selectivos: cristal violeta, sales biliares, el telurio de potasio, los
antibióticos. Que agregados los convierten en selectivos para determinados
microorganismos.
Agar: al 1- 2 % otorga solides, a los medios de cultivo y es obtenido de ciertas
algas marinas, insoluble en agua fría y funde a los 80 – 100°C y se mantiene en
este estado hasta los 45°C y por debajo de esta temperatura comienza a
solidificarse.


CLASIFICACIÓN:
A. POR SU ESTADO FÍSICO:
1.- LÍQUIDOS: denominado caldos, constituidos por nutrientes en solución
acuosa, se los utiliza para el mantenimiento de los microorganismos. (Caldo
nutritivo, infusión cerebro corazón, mitis salivarius Gold)
2.- SOLIDOS: Llamados agar, se obtiene
añadiendo a un medio de cultivo liquido una
sustancia gelidificante como en agar al 1.5-
al 2 %, y debe colocarse en cajas Petri o
tubos de ensayo, en este último se puede
colocar el tubo inclinado para obtener
mayor superficie de siembra ( agar
inclinado, pico de flauta o slant) o dejar
enfriar en posición vertical (agar columna.)
se utilizan para aislar e individualizar
microorganismos.

4. 3.- SEMISÓLIDOS: medios líquidos con agar al 0,3 – 0,5%, usado para
determinar la motilidad de los microorganismos.

B. POR SU ORIGEN
1.- MEDIOS NATURALES: se obtiene a partir de sustancias naturales animales
o vegetales, como suero leche o papa, no es constante
2.- MEDIOS SINTÉTICOS O ARTIFICIALES: como el agar nutritivo que contiene
nutrientes que permiten el desarrollo de la mayoría de microorganismos no
exigentes sin ofrecer ventaja a ninguno.
3.- MEDIOS SEMISINTETICOS O COMPLEJOS: a los medios sintéticos se les
agrega factores de crecimiento tales como extracto de levadura, carne o
vegetales, se lo utiliza para el cultivo de la mayoría de microorganismos (agar y
caldo BHI)
C.- POR SU UTILIDAD
1.- MEDIOS GENERALES O COMUNES: contiene sustancias nutritivas mínimas
para el crecimiento de microorganismos no exigentes, y puede ser líquidos o
sólidos.
2.-MEDIOS ENRIQUEC IDOS: para los requerimientos nutritivos de
microorganismos exigentes, lleva agregado de suero líquido ascítico, sangre
glucosa o factores esenciales, como por ejemplos sangre -agar para
estreptococos, agar-sangre con hemina y medaniona para bacilos
gramnegativos del biofilm de la placa subgingival.
3.- MEDIOS SELECTIVOS: para el crecimiento de determinados
microorganismos mientras inhibe el crecimiento de otros, y esto se logra por:
a) por agregado de compuestos químicos, como inhibidores colorantes o
antibióticos. Como por ejemplo el SS (con verde brillante y sales biliares). Para
el desarrollo de la Salmonella shigella, el mitis salivarius (con cristal violeta, azul
tripan y telurio de potasio) para el crecimiento de estreptococos bucales, y el
medio de Sabouraud con cloranfenicol para el aislamiento de hongos.
b) por ajuste del pH: como el medio de rogosa con pH 5,4 para el crecimiento de
lactobacilos.
c) por ajuste osmótico: con medios de cultivo con alto contenido de cloruro de
sodio, como el medio manitol-sal, para aislar e identificar estafilococo.
4.- MEDIOS DIFERENCIALES: para diferenciar microorganismos semejantes,
sobre la base de alguna propiedad bioquímica, por ejemplo los medios que
contiene azúcar y colorantes, como indicador de pH, si el microorganismo
produce ácidos a partir de hidratos de carbono producirá el consiguiente viraje
de color, un ejemplo es el medio base rojo fenol para identificar distintas
especies de estreptococos.

5. 5.- MEDIOS DE TRANSPORTE: aseguran la viabilidad de los microorganismos
desde el momento de la toma hasta su procesamiento, son medios pocos
nutritivos, líquidos o semisólidos, que no favorece el crecimiento de los
microorganismos. Otros pueden inhibir la acción enzimática de autodestrucción
o efectos letales de la oxidación. Como ejemplos tenemos caldo tioglicolato,
solución de Ringer, medio de Stuart.
Para el transporte de origen periodontal se puede utilizar, el medio de transporte
VMGA III, (Viability Medium Goteborg Anaerobically). Para el transporte de virus
se utilizan suplementos de proteína para estabilizar virus frágiles y antibióticos
para reducir contaminación bacteriana.


CULTIVOS ANAERÓBICOS

Para el cultivo de bacterias anaerobias, todo proceso debe efectuarse en
ausencia de oxigeno desde la selección, recolección y trasporte de la muestra,
hasta los cultivos, ya que estos microorganismos pueden morir en exposición al
oxígeno. Y la alteración de algún paso puede conducir a resultados erróneos y
proporcionar información equivocada. La siembra será realizada
inmediatamente, algunos métodos consisten en la siembra en la profundidad de
la placa y en tubos con medio solido o liquido cubierto con capa de vaselina. O
en medios esterilizados en forma aerobia prerreducidos (PRAS)
Condiciones aerobias más estrictas como aquellas requeridas para la
incubación de microorganismos
relacionados con enfermedades
humanas son por ejemplo:
Jarra de evacuación-reemplazo: el aire
es eliminado y reemplazado por una
mescla de 85% de nitrógeno, 10% de
hidrogeno y 5% de dióxido de carbono.
Jarra anaerobia con generador de gas
desechable: se basa en el empleo de
un sobre con dos tabletas; una de
borohidrato sódico y otra de
bicarbonato de sodio y ácido cítrico, se
coloca la placas y tubos en la jarra
junto con los sobres y se agrega 10 ml
de agua, se cierra herméticamente con
la tapa donde se ubica el catalizador.
La combinación de agua y tabletas
generan dióxido de carbono e
hidrogeno, que en presencia del

6. paladio del catalizador reacciona con el oxígeno produciendo agua y
consumiendo este oxígeno.

La anaerobiosis se comprueba introduciendo indicadores de anaerobiosis que
son tiras embebidas en azul de metileno oxidado o resazurina, y se torna incolora
al desaparecer el oxígeno. En la actualidad se dispone de bolsas de plástico,
presentan un generador de gas d H2-CO2 al que se le agrega agua con
generador de gas desechable y un sistema indicador que emplea resazurina.
Cámara de anaerobiosis: permite procesar y realizar el aislamiento e
identificación de bacterias anaerobias. Puede ser construida de materiales
como acero, plástico acrílico o fibra de vidrio. La mescla gaseosa empleada para
eliminar el oxígeno contiene 85% de nitrógeno, 10% de hidrogeno, y 5 % de
dióxido de carbono.
Las bacterias con necesidades de dióxido de carbono distintas a las
atmosféricas, llamadas capnofilas, puede incubarse en un simple frasco con una
vela, esta vela consume la concentración de oxigeno hasta apagarse,
proporcionando una atmosfera con concentración del 3% de CO2.








CULTIVOS PARA HONGOS
Para el aislamiento debe emplearse un medio selectivo y orto no selectivo, los
medios utilizados para su aislamiento deben cumplir las siguientes
características:
 Medios enriquecidos
 Con y sin agregados de sangre
 Con y sin cicloeximida
 Con y sin agregados de agentes antibacterianos
Medios enriquecidos como el agar SABHI (agar dextrosa de sabouraud con
infusión cerebro corazón) usado para aislar hongos saprofitos y patógenos,
como los dermatofilos. Par aislar algunos microrganismos se requiere elementos
nutricionales especiales como medios de cultivo con 5-10% de sangre de
carnero para especies como histoplasma capsulatum.

7. Para evitar el sobre desarrollo de ciertos hongos filamentosos se empleara
cicloheximida, sin embargo no todos son inhibidos por esta como por ejemplo
Cryptococcus neoformans, Candida krusei, y especies de Aspergillus. Para la
eliminación de posible contaminación bacteriana se usara uno o más antibióticos
como penicilina, estreptomicina, gentamicina o cloranfenicol. El agar mycosel
posee ambos inhibidores y se indica su uso para aislamiento primario de
dermatófilos.
La identificación de los hongos filamentosos se basa en las características de las
colonias como textura color y velocidad de crecimiento, y el aspecto de las
esporas que pueden formarse, pero requiere tiempo para su producción.
Para los hongos levaduriformes se basa en el estudio delas características
morfológicas macroscópicas y microscópicas y patrones bioquímicos de
asimilación de azúcar, requiere de uno o más días para su correcta
interpretación. En los últimos años se ha facilitado el estudio de levaduras debido
a la introducción de cultivos cromógenos, que permiten aislamiento e
identificación simultánea al generarse colonias con diferente textura y color para
distintas especies.
Existen diversas marcas comerciales como Albicas ID y Candida ID- bioMerieux,
Francia; CHROMagar cándida- CHROMagar Company, Francia.

CULTIVOS CELULARES
Algunas bacterias nunca han podido ser cultivadas como en el caso del bacilo
de la lepra (Micobacterium leprae) o la espiroqueta que causa la sífilis
(Treponema pallidum). Con excepciones, bacterias intracelulares obligadas
como las rikettsias y las clamidias tampoco proliferan en medios artificiales, los
virus solo crecerán en animales de experimentación, huevos embrionarios o
células vivas.
Para aislar y conservar virus el medio más antiguo es la inoculación en animales
de experimentación como ratones lactantes o adultos, cobayos, conejos y en
algunos casos primates. Pero debido al costo de mantenimiento, complejidad de
instalaciones, el riesgo de manipulación de animales infectados y presencia de
virus latentes se los ha ido reemplazando por cultivos celulares. Pero aún se
requiere el uso de animales, sobre todo para el estudio de la inmunidad de
enfermedades virales, ensayos de vacunas, estudios de virus oncogénicos,
antisueros y pruebas antimicrobianas.
SIEMBRA
Es la colocación de un microorganismo en un ambiente artificial apropiado, para
que lleve a cabo su metabolismo, desarrollo y reproducción. Las técnicas de
siembra varían según el estado físico de medio o necesidades gaseosas del
microorganismo.

8. Una condición básica de la siembra es que se realice bajo rigurosa asepsia para
evitar el crecimiento de microorganismos contaminantes, la siembra tiene como
finalidad el cultivo que es el crecimiento poblacional de microorganismos, en un
medio de cultivo bajo condiciones de laboratorio.
Una de las condiciones para el cultivo es la temperatura de incubación, la cual
debe brindar condiciones óptimas para el crecimiento de microorganismos, la
mayoría se desarrollan a 35°C de temperatura. Sin embargo las temperaturas
disgenesicas pueden ser altas como 60°C típico para el desarrollo de S.
faecalis o de 44°C para E, coli pero también pueden ser bajas como 4°C para
el cultivo de Listeria.
Para el desarrollo de aerobios basta con colocar la caja o tubo de siembra a
35°C en estufa para cultivo, cuya atmosfera es igual a la ambiental. La mayoría
de hongos cresen a 30°C sim embargo de pueden aislar a temperatura ambiente
o a 35°C. Los tiempos de incubación varían, para los hongos filamentosos será
de entre 15 a 30 días en cambio las levaduras al igual que muchas bacterias
entre 24 a 48 horas.
Las placas o tubos donde se sospeche la existencia de anaerobios, debe
incubarse al menos durante 48 horas a temperatura de entre 35 a 37°C y
reincubarse durante 2 a 4 días más para permitir el crecimiento lento de las
colonias.
Luego de la inoculación e incubación los microorganismos se multiplican
formando una masa macroscópicamente visible denominada colonia, que es un
clon procedente de un mismo germen y a partir del cual será posible realizar el
aislamiento y trasplante.

AISLAMIENTO
La siembra del material proveniente de una muestra clínica por lo general da
como resultado cultivos mixtos, del cual es imprescindible separar los distintos
tipos de colonias para obtener cultivos puros o axénicos, ya que los cultivos
mixtos proporcionaran información de poca utilidad o errónea. Solo los cultivos
puros permiten realizar p estudios sobre propiedades bioquímicas y sensibilidad
a antimicrobianos selectivos conocido como antibiograma.
Existe diversa técnicas de aislamiento, las más usadas se basan en un medio de
cultivo solido en el cual los microorganismos dan origen a colonias separadas,
como cada colonia procede de una sola célula se habla de unidad formadora de
colonias (UFC).
Los métodos de aislamiento más frecuente son:
Siembra por agotamiento por estrías: método rápido y simple de agotamiento
progresivo y continuo del inocuo (material microbiano usado para sembrar),
sobre un medio solido contenido en una capsula de Petri. A medida que se
realizan las estrías las bacterias pasan del asa al medio en un número cada

9. vez menor, de manera que las estrías iniciales proporcionan crecimiento
confluyente en tanto que a lo largo de las últimas estrías se conforman colonias
bien aisladas.
Siembra por diseminación en superficie: consiste en colocar 0,005ml (una
gota) de inoculo en el centro de una placa de Petri, con medio de cultivo. Se la
extiende con espátula de Drigalsky, hacia adelante y atrás mientras se hace
girar la placa, se tapa se invierte la placa y envía a incubación.


Siembra de difusión seriada: consiste en realizar diluciones sucesivas con el
objeto de sembrar cantidades conocidas de estas diluciones en las capsulas de
Petri, esto permitirá conocer el número de microorganismos viables. La viabilidad
en microorganismos se define como la capacidad del microorganismo para
multiplicarse en un medio de cultivo.

10. EXAMEN DE LAS CARACTERÍSTICAS DE UN CULTIVO
Los microorganismos ofrecen indicios de su identidad, la determinación de las
características generales de las colonias debe realizarse a través de la
inspección macroscópica de la superficie de la placa de agar. Se recomienda
iluminación adecuada y la utilización de una lupa.
El estudio de las colonias incluye determinar su tamaño, forma, elevación,
margen o bordes, color, superficie, densidad y consistencia. Se consideraran las
reacciones que se producen en el agar, como por ejemplo tipos de hemólisis en
agar sangre (alfa, beta, gamma y alfa prima), producción de pigmentos y cambios
en los medios diferenciales en los cuales los colorantes indicadores del y otros
ingredientes sirven como marcadores de actividad enzimática y ayudan a
identificar aislamientos microbianos.
TRASPLANTE
Consiste en sembrarlo en un nuevo medio de cultivo a fin de perpetuar la especie
aislada, como los trasplantes requieren de permanentes medios de cultivo,
tiempo y dinero, los laboratorios recurren a medios de preservación menos
costosos, efectivos y seguros.

Preservación de microorganismos aislados
Este tiene los siguientes propósitos:
1. Mantenimiento de sepas para la identificación definitiva por un
laboratorio de referencia.

11. 2. Realización de pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos no
habituales.
3. Fines didácticos.
4. Realización de trabajos de investigación.
5. Realización de estudios epidemiológicos en casos de brotes de
infecciones nosocomiales, en casos aislados de agentes nosocomiales o
agentes etiológicos raros o potencialmente patógenos.
Técnicas para la preservación:
Refrigeración: para conservar las sepas durante un plazo corto.
Cuando se requiere conservar durante un largo periodo de tiempo se dispone
de:
Criopreservación: congelamiento y almacenamiento de células a muy baja
temperatura, congelación de entre -20 a -40 °C , o a -70 a -90°C en ultra
congelación, así como -130 a -195°C en termos con nitrógeno líquido. Se les
adiciona los crioprotectores con el fin de evitar los daños de la congelación a la
célula, los más comunes son leche descremada, glicerol, sacarosa. La
temperatura para bacterias y hongos es de -60 a -70°C y su conservación
supera los 10 años.
Liofilización: consiste en la eliminación de agua y otros solventes a partir de
una solución congelada por el proceso de sublimación (paso de líquido
congelado a estado gaseoso sin pasar por la fase liquida). Permite conservar el
material a temperatura superior a las requeridas para mantener suspensiones
congeladas, y puede prescindirse las cadenas de frio. El resultado es un
producto estable y fácilmente rehidratable, con este método se logra periodos de
conservación de más de 20 años.

12. BIBLIOGRAFÍA:
NEGRONI, M; MICROBIOLOGÍA ESTOMATOLÓGICA fundamentos y guía práctica; 2° Edición;
Panamericana; Buenos Aires; 2009.