Microscopia

Practica de Laboratorio

1. Instituto de Fsica, Universidad de Antioquia
Informe practica de Microscopa:
Iluminador de Kholer
Alejandro Correa Lopez
a*
, Vctor Moreno-Marn
a**
.
a
Universidad de Antioquia.
24 octubre de 2012
Resumen
La microscopa es el conjunto de tecnicas y metodos destinados a hacer visible los
objetos de estudio que, por su peque~nez, estan fuera del rango de resolucion del ojo
humano. Si bien el microscopio es el elemento centra de la microscopa, para producir
las imagenes adecuadas se requiere ademas de todo un conjunto de metodos y tecnicas
anes pero extrnsecas al aparato. Algunas de ellas son tecnicas de preparacion y
manejo de los objetos de estudio, tecnica de salida, procesamiento, interpretacion
y registro de imagenes, etc. Exceptuando tecnicas especiales como las utilizadas en
microscopio de fuerza atomica, microscopio de iones en campo y microscopio de efecto
tunel, la microscopa generalmente implica la difraccion, reexion o refraccion de
algun tipo de radiacion incidente en el sujeto de estudio.
Palabras Claves:Microscopio, diafragmas de apertura y de campo, pupilas de
entrada y de salida, ventanas de entrada y de salida, objeto, imagen, aumento.
*
[email protected]
**
[email protected]
1

2. Laboratorio deOptica

Optica Geometrica: el Microscopio
1. Introduccion
En microscopa optica, la iluminacion es el
mecanismo mediante el cual se hace incidir luz
sobre el plano del especimen en observacion.
Para la microscopa optica de transmision, la
iluminacion puede lograrse por mecanismos que
van desde la obtencion de un campo iluminado
de manera homogenea, o por la proyeccion de
una imagen de la fuente de luz sobre la mues-
tra. Otro metodo conocido como iluminacion de
campo oscuro consiste en obtener iluminacion
indirecta sobre el plano de la muestra median-
te la obstruccion del camino optico entre la
fuente luz y el plano de la muestra. La inuencia
del factor iluminacion en microscopa optica es
subestimada frecuentemente por el usuario del
microscopio, sobretodo el papel del condensador
en la resolucion de las imagenes obtenidas en el
microscopio, debido a que existe una creencia
popularizada por Zernicke de que la resolucion
de las imagenes es independiente de la correc-
cion introducida por el condensador. Anterior-
mente, el metodo de iluminacion de preferencia
era el de iluminacion crtica el cual consiste en
proyectar una imagen ntida de la fuente sobre
el plano de la muestra con mayor intensidad so-
bre el centro del campo. Este metodo permite
obtener el mayor brillo posible a partir de la
fuente de iluminacion empleada, sin embargo el
metodo posee la desventaja de proporcionar una
iluminacion dispareja sobre el campo. En el a~no
1893, Aughust Kohler del instituto Carl Zeiss
introdujo un metodo de iluminacion que lleva
su nombre. El metodo de Kohler, ademas de
brindar el mayor brillo posible a partir de la
fuente de iluminacion, soluciona el problema de
la homogeneidad de la misma sobre el campo,
pues, en lugar de proyectar una imagen de la
fuente sobre el plano de la muestra, proyecta la
imagen del diafragma de apertura del conden-
sador. As, se obtiene una iluminacion brillante,
homogenea y con alto grado de coherencia sobre
el un campo. Por sus caractersticas la ilumi-
nacion Kohler tambien es conocida como ilumi-
nacion coherente, y constituye uno de los meto-
dos de iluminacion mas utilizado en microscopa
optica.
2. Marco Teorico
A continuacion se expondran los conceptos
basicos de la

Optica Geometrica que se uti-
lizaron en esta experiencia de laboratorio.
2.1. Condensador
En microscopa optica, un condensador es un
sistema de lentes que concentra los haces de luz
por debajo de la muestra que se desea observar
[2].
2.2. Diafragma de Apertura y Di-
afragma de Campo
El diafragma de apertura (D.A.) es el diafrag-
ma que limita la cantidad de rayos emergentes
de un punto axial en el objeto. Usualmente se
identica por su cercana a las lentes. Este di-
afragma limita el brillo de la imagen. Por otro
lado, el diafragma de campo (D.C.) es el diafrag-
ma que limita la cantidad de luz que ingresa al
campo, usualmente se ubica cerca del plano de
observacion limitando la porcion del objeto que
puede verse a traves del sistema.
2

3. Instituto de Fsica Universidad de Antioquia
2.3. Pupilas y Ventanas
Cuando se utilizan diafragmas tipo iris en un
montaje optico, estos deben ir centrados a largo
del eje optico del sistema. Si bien fsicamente
los diafragmas limitan el ancho de los rayos
que cruzan determinada seccion transversal de
area del sistema optico, es preciso considerar
que a cada diafragma corresponde una imagen
que tambien inuye en el comportamiento del
montaje y nos permite obtener mas informa-
cion sobre el adecuado funcionamiento del mis-
mo. Aqu introducimos los conceptos depupila
de entradaypupila de salida. Para un sistema
simple compuesto por una lente y un diafrag-
ma, al diafragma le corresponde una pupila de
entrada y una de salida, sin embargo cuando el
sistema es compuesto existe un criterio asociado
al angulo subtendido por el radio del diafragma.
Las pupilas pueden ubicarse en cualquier parte
del eje del sistema, excepto que ellas no pueden
coincidir con el objeto o la imagen [2].
2.3.1. Pupila de entrada
Es la imagen del diafragma de apertura forma-
da por todas las lentes que le preceden, vista
desde el punto de vista del objeto. En presencia
de varios diafragmas y lentes la pupila de entra-
da del sistema sera la que subtienda el menor
angulo desde el punto de vista del objeto.
2.3.2. Pupila de salida
Es la imagen del diafragma de campo formada
por todas las lentes que le siguen, vista desde
el punto de vista de la imagen. En presencia de
varios diafragmas y lentes la pupila de salida del
sistema sera la que subtienda el menor angulo
desde el punto de vista de la imagen.
2.4. Determinacion de los Dia-
fragmas de Apertura y de
Campo
Establezcamos las reglas que se han de seguir
para determinar cual diafragma es el de abertu-
ra y cual es el de campo.
1.
pueden tener de los diafragmas desdeun
punto objetosobre el eje optico (punto ax-
ial), esto es, las imagenes que de los di-
afragmas forman los elementos opticos que
3

4. Laboratorio deOptica

Optica Geometrica: el Microscopio
preceden a cada uno de ellos. Por elemen-
tos que le anteceden se entienden los ele-
mentos opticos que se hallan entre el pun-
to objeto axial y el diafragma bajo consi-
deracion. La imagen que interesa es la que
forma el diafragma en el campo objeto.
2. Pupila de Entradacorresponde a la im-
agen del diafragma que subtiende el menor
angulo desde el punto axial. El diafragma,
del cual es imagen, se denominaDiafrag-
ma de Abertura.
3. Ventana de Entradasera la imagen del
diafragma que subtiende el menor angu-
lo a partir del centro de la Pupila de En-
trada. El diafragma del cual es imagen se
denominaDiafragma de Campo.
Las imagenes de los diafragmas de Abertura y
de Campo formadas por los elementos opticos
que le suceden (que estan entre el diafragma y
el espacio imagen) se denominanPupila de Sa-
lidayVentana de Salida, respectivamente. En
un instrumento optico formador de imagenes se
suele construir de modo que la Ventana de Sal-
ida coincida con el plano imagen del sistema.
As ocurre, por ejemplo, en el ojo y en la camara
fotograca. El analisis puede iniciarse en el es-
pacio imagen a partir del punto imagen axial. Es
evidente e importante saber que un diafragma,
sea de apertura o de campo, en un instrumento
optico, depende de la posicion relativa del obje-
to con respecto al instrumento [2,]
Todo lo anterior viene ilustrado en la secuen-
cia que se presenta en la gura anterior para un
tpico instrumento optico (ojo, camara fotogra-
ca o CCD). La gura (a) muestra un esquema
del instrumento. En la gura (b) se presentan
los diafragmas o imagenes de ellos, tal y como
se ven desde el punto objeto axial; igualmente
se indican la pupila y la ventana de entrada.
La gura (c) muestra como son vistos, desde el
punto imagen, los diafragmas; ademas, cual es
la pupila de salida y la ventana de salida [4].
2.5. Microscopio de campo os-
curo
El microscopio de campo oscuro utiliza un haz
enfocado de luz muy intensa en forma de un
cono hueco concentrado sobre el especimen.
El objeto iluminado dispersa la luz y se hace
as visible contra el fondo oscuro que tiene de-
tras, como las partculas de polvo iluminadas
por un rayo de sol que se cuela en una habitacion
cerrada. Por ello las porciones transparentes del
especimen quedan oscuras, mientras que las su-
percies y partculas se ven brillantes, por la
4

5. Instituto de Fsica Universidad de Antioquia
luz que reciben y dispersan en todas las direc-
ciones, incluida la del eje optico que conecta el
especimen con la pupila del observador. Esta
forma de iluminacion se utiliza para analizar ele-
mentos biologicos transparentes y sin pigmen-
tar, invisibles con iluminacion normal, sin jar
la muestra, es decir, sin matarla. Tambien es
bastante utilizado en la observacion de muestras
metalogracas para la observacion de detalles
en supercies con alta reectancia. El objetivo
recibe la luz dispersa o refractada por las estruc-
turas del especimen. Para lograrlo, el microsco-
pio de campo oscuro esta equipado con un con-
densador especial que ilumina la muestra con luz
fuerte indirecta. En consecuencia el campo visu-
al se observa detras de la muestra como un fondo
oscuro sobre el cual aparecen peque~nas partcu-
las brillantes de la muestra que reejan parte
de la luz hacia el objetivo. El efecto es similar
a las partculas de polvo que se ven en el haz
de luz emanado de un proyector de diapositivas
en una habitacion oscura. La luz reejada por
las partculas de polvo llegan hasta la retina del
ojo, lo que las hace visibles. La luz dispersa per-
mite incluso distinguir partculas mas peque~nas
que el poder separador del sistema optico usado
por transparencia [1].
3. Aspecto Experimental
3.1. Instrumentos
Para la realizacion de esta experiencia, se hizo
uso de los siguientes instrumentos opticos:
Bombilla como fuente de luz.
Lentes convergentes de 5 cm y 10 cm de
longitud focal.
Diafragmas tipo iris.
Jinetas y soportes.
Banco optico.
3.2. Montaje y Procedimiento
En la gura (3.2) tenemos que L1es la lente con
longitud focal de 5 cm;D1es el diafragma 1;D2
el diafragma 2 yL2es la lente con longitud fo-
cal de 10 cm. Ubicamos sobre el banco optico las
lentes y los diafragmas tal y como lo muestra la
gura (3.2
bombilla por la primera lente se formara en el
mismo plano del diafragmaD2, y que sobre la
pantalla la segunda lente formara la imagen de
la primera.
Con los diafragmas dispuestos en su maxima
abertura,D1= 310
2
m yD2= 2;8910
2
m,
y con base en la teora, se procedio a averiguar
cual de los elementos del montaje corresponde al
diafragma abertura, cual al diafragma de cam-
po, y cuales son las pupilas y ventanas. Para
hallar el diafragma de abertura calculamos los
angulos subtendidos desde la bombilla, desde la
lente desde las imagenes de los diafragmasD1y
D2y desde la lenteL2.
5

6. Laboratorio deOptica

Optica Geometrica: el Microscopio
Los angulos subtendidos fueron:
Angulo subtendido desde la bombil-
la a la lenteL1: tan1=CO=CA,
donde el cateto opuesto era la mitad del
diametro de la lente, es decir, 1;510
2
m, y el cateto adyacente era la distancia
a la bombilla, es decir, 710
2
m. As,
tan11= 0;214 .
Angulo subtendido desde la bombil-
la a la imagen deD1: Para calcular la
posicion de la imagen correspondiente a
D1y su respectivo aumento, hacemos uso
de las ecuaciones
1
p

1
q
=
1
f
;M=
q
p
; (1)
dondeqes la distancia imagen,pes la
distancia objeto yfes la longitud fo-
cal de la lente [5]. Con p= 6;510
2
m yf= 510
2
m encontramos que
q=4;610
4
m. Es decir, la imagen
se forma al lado derecho de la imagen.
Luego, el aumentoMseraM=4;6
10
4
=6;510
2
= 7;0710
3
, lo cual sig-
nica que si el diametro deD1era 310
3
m, su imagen quedo con un diametro de
D
0
1= 210
4
m. As obtenemos los
siguientes datos:CO= 110
4
m y
CA= 710
2
4;610
4
= 6;910
2
m
porque obtenemos que tan22= 0;08.
Angulo subtendido desde la bombil-
la a la imagen deD2: Como el diafrag-
maD2fue ubicado de forma tal que en
ese mismo plano estuviera la imagen de la
bombilla debido a la lenteL1, y por la re-
versibilidad optica, la imagen deD2esta
en el mismo plano del objeto; es decir,3
tiende a innito.
Angulo subtendido desde la bombil-
la a la imagen deL2: Dicha imagen esta,
de manera similar que se calculo paraD1,
a 0;8310
2
m de la bombilla. El aumen-
to fue 0,0315, y puesto que el diametro
de ambas lentes era de 6;310
2
m, en-
tonces el diametro de la imagen fue de
0;210
2
m. As,CO= 0;110
2
m
yCA= 0;8310
2
m. Por lo tanto
tan44= 0;12.
De los anteriores calculos vemos que el diafrag-
maD1es el que subtiende el menor angulo,
luego se denomina diafragma de apertura y por
tanto su imagen debido aL1es la pupila de en-
trada, ya calculada, y su imagen debido aL2es
la denominada pupila de salida. Realizando los
calculos respectivos, se mostro que la pupila de
salida se encontro a 20 cm de la lenteL2con
M= 1.
Para hallar el diafragma de campo, nos ubi-
camos sobre la pupila de entrada y calculamos
hacia ambos lados, observando cual objeto sub-
tiende el angulo menor. Procediendo de igual
forma que para hallar el diafragma apertura,
encontramos queD2= 0;134,L1= 0;46 y
L2= 0;15. As, el diafragmaD2corresponde al
diafragma de campo. Con el diafragma de cam-
po determinado, procedimos a hallar las ven-
tanas de entrada y salida. La ventana de entra-
da coincidio en el plano de la bombilla, con un
tama~no de 1;210
2
m de diametro. La ventana
de salida, es decir, la imagen deD2debido aL2,
se encontro a 0,9 m deL2, con un diametro de
0,3 m.
Experimentalmente vimos que, efectivamente,
D1era el encargado del tama~no de la pupila de
salida, tal y como se esperaba ya que es el dia-
fragma de apertura. Observamos tambien que
D2era el encargado de aumentar o disminuir
la intensidad, es decir corresponde al diafrag-
ma de campo. A 0,2 m de la lenteL2encon-
6

7. Instituto de Fsica Universidad de Antioquia
tramos la imagen deD1, y vimos que, efecti-
vamente, el diametro de la pupila era exacta-
mente el diametro del diafragma tal y como lo
predicen los calculos realizados. Todo este mis-
mo montaje se repitio para una nueva posicion
del diafragmaD1, el cual se ubico mas cerca a la
lenteL1. Tal hecho se representa en la siguiente
gura.
De nuevo,D1sigue siendo el diafragma de
abertura yD2el diafragma de campo. Tanto
la ventana de entrada como la de salida per-
manecieron iguales. La diferencia radica en que
las pupilas cambiaron de ubicacion y tama~no,
en especial, la pupila de salida; empleando la
ecuacion (1), debera estar a 6 ;710
2
m de la
lenteL2en el lado opuesto a esta, y su aumen-
to sera 0,68, a diferencia del montaje anterior
donde el aumento era 1. Experimentalmente ob-
servamos, nuevamente, queD1limito el tama~no
de la pupila de salida;D2la intensidad, y en
efecto, a 16;810
2
m encontramos la imagen
deD1donde apreciamos que esta vez la pupila
de salida fue mas peque~na que el diametro del
diafragma abertura. A continuacion, mostramos
el trazado de los rayos para este ultimo montaje.
4. Conclusiones
1.
ga las veces deDA, va a limitar el tama~no
del haz que sale de dicho sistema.
2.
ga las veces deDC, va a limitar la inten-
sidad del haz que sale de dicho sistema.
3. DAen un sistema opti-
co que permanece estatico, altera unica-
mente el tama~no de las pupilas tanto de
entrada como de salida, siempre y cuando
dicho movimiento no sea tal que el angulo
subtendido desde el objeto a dicho diafrag-
ma sea mayor que el mismo angulo pero
para otro objeto.
Referencias
[1]
EnWikipedia, the Free Enciclopedia. Recu-
perado el 3 de Marzo de 2013 a las 16:30
dehttp://en.wikipedia.org/wiki/Dark_
field_microscopy.
[2] Wikipedia, the Free En-
ciclopedia.http://es.wikipedia.org/
wiki/Condensador.
[3] Optics. 4 ed., San Francisco,
Pearson Education, 2002, p. 171-173.
[4]

Optica Instrumental,
Barcelona, Ediciones UPC, 1996, p. 53-60.
[5] Fundamentos de

Optica, Madrid, Aguilar S. A. de Ediciones,
1964, p. 102-109.
[6] Fsica de las Ondas,
Medelln, Editorial Ude@, 2005, p. 222.
7

8. Laboratorio deOptica

Optica Geometrica: el Microscopio
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