Nghiên cứu begomovirus trên ớt và cà chua ở khu vực Miền Trung và Miền Nam Việt Nam

1

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình làm thực tập ngoài nỗ lực của bản thân tôi đã nhận được rất nhiều sự
giúp đỡ tận tình từ các cá nhân và tổ chức.
Trước tiên, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới TS. Hà Viết Cường – Giám độc trung tâm nghiên
cứu Bệnh cây nhiệt đới – trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Phó khoa Nông học đã trực tiếp
hướng dẫn, dẫn dắt, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành báo cáo này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến cán bộ, công nhân viên thuộc Trung tâm Bệnh
cây nhiệt đới - Trường Đại học Nộng nghiệp Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho
tôi làm việc trong suốt quá trình thực tập tại Trung tâm.
Đồng thời tôi cũng xin bày tỏ sự biết ơn chân thành tới các Thầy giáo, Cô giáo trong bộ môn
Công nghệ sinh học thực vật cũng như các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học, trường Đại
học Nông nghiệp Hà Nội đã nhiệt tình dạy dỗ, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian tôi học tập ở
trường.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn tới gia đình, người thân các anh chị em và bạn bè đã giúp đỡ,
động viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như hoàn thành báo cáo tốt nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

https://tailieu.xyz/

2

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Ký hiệu Từ viết tắt
A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
AS Acetosyringone
ATP Adenosine triphosphate
Bb Base pair
CP Capsid protein
CTAB Cetryl Ammonium Bromide
ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP Deoxynucleoside triphosphate
dsDNA Double strand DNA
E.coli Escherichia coli
EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid
ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses
IR Itergenic region
Kb Kilo base
LB Luria and Bertani
ORF Open reading frame
PCR Polymerase Chain Reaction
RCA Rolling circle ampliﬁcation
RE Restriction enzyme
Rep Replication protein
RNA Ribonucleic acid
Rnase Ribonuclease
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
SsDNA Singe strand DNA
TAE Tris – acetate – EDTA
Taq Thermus aquatic
Vir Virulence region
β- ME Beta- Mercaptoethanol

https://tailieu.xyz/

3

TÓM TẮT
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nhân dòng và giải trình tự toàn bộ bộ gen của
mộtbipartite begomovirus, được cho là chưa từng được phát hiện ở Việt Nam gây hại trên cây ớt
đã được Nguyễn Đức Anh phân lập năm 2013. Kết quả là toàn bộ bộ gen của mẫu begomovirus
đã được nhân dòng thành công vào tế bào E.coli chủng XL1-Blue. Chúng tôi cũng đã giải trình
tự và thu được toàn bộ bộ gen của mẫu virus với kích thước khoảng 2.7 kb.
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu về begomovirus trên ớt và cà chua ở miền Trung và miền
Nam Việt Nam, begomovirus mới gây bệnh xoăn vàng lá trên ớt ở hai vùng này. Nhân dòng
thành công và giải được bộ gen DNA-A của virus này, thông qua phân tích trình tự, đặc trưng
phân tử và phả hệ cho thấy đây là 1 loài mới thuộc chi Begomovirus gây hại trên ớt và được
chúng tôi đặt tên là Chilli leaf curl virus (CLCV).

https://tailieu.xyz/

4

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Giới thiệu
Họ Geminiviridae là họ virus thực vật lớn nhất, có khoảng 200 loài(Fauquet và Stanley,
2005).Trong đó begomovirus là chi lớn nhất và quan trọng nhất trong họ Geminiviridae cả về số
lượng loài và bệnh do chúng gây ra với cây trồng.Begomovirus(được đặt tên từ Bean golden
mosaic virus) có hình thái phân tử dạng hình cầu kép (hình chùy) và bộ gen DNA sợi vòng đơn,
kích thước khoảng 2,7 kb (Fauquet và Stanley, 2005), lan truyền trên đồng ruộng bằng bọ phấn
(Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn.
Begomovirus có thể có bộ gen đơn (gồm một phân tử DNA-A) hoặc có bộ gen kép (gồm hai phân
tử DNA-A và DNA-B). Ở một số loại cây chỉ cần phân tử DNA-A đã gây triệu chứng điển hình,
còn ở một số loại cấy khác thì cần có cả phân tử DNA-A và DNA-B mới gây ra triệu chứng bệnh.
Gần đây, một loại phân tử DNA vòng đơn nữa, có kích thước khoảng 1 nửa bộ gen begomovirus
thường được phát hiện thấy có liên quan với nhiều bệnh do begomovirus gây ra và được gọi là
các DNA-β. Các phân tử DNA-β này phụ thuộc vào begomovirus để nhân lên và do đó được xem
là các phần tử vệ tinh của begomovirus. Vai trò của phân tử DNA-β trong hình thành triệu chứng
bệnh không thống nhất, một số begomovirus chỉ có thể tạo ra triệu chứng bệnh với sự có mặt của
phân tử DNA-β trong khi các loài khác lại không cần. Do đó việc phòng trừ bệnh xoăn vàng lá
càng trở nên khó khăn hơn.
Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng được xác định là do begomovirus gây ra như bệnh xoăn
vàng lá cà chua – một bệnh được xem là nguy hiểm nhất trên cà chua khắp thế giới(Moriones và
cộng sự, 2007). Hiện nay, có tới 50 begomovirusphân lập từ cà chua (có từ tomato ở đầu tên
virus) đã được công bố trên thế giới (Fauquet và cộng sự, 2008). Trên cây cà chua, các
begomovirus tạo triệu chứng giống nhau, điển hình là: cuốn lá (cong lại hình thìa); mép lá (đặc
biệt ở lá non) biến vàng; lá nhỏ hẹp; cây nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh tính
virus chỉ có thể được xác định dựa vào các phân tích phân tử (Moriones và Navas-Castillo, 2000).
Việt Nam được chứng minh là trung tâm đa dạng quan trọng của begomovirus(Ha, 2007).
Mặc dù vậy số lượng loài begomovirus xác định trên thực vật của Việt Nam vẫn còn ít chỉ gồm
19 loài được phân lập từ nhiều loài cây, trong đó có nhiều cây dại(Green và cộng sự, 2001),(Ha,
2007).Theo điều tra hiện nay, bệnh do begomovirus gây hại trên diện rộng và không chỉ gây bệnh
trên cà chua, chúng còn gây bệnh trên nhiều loài cây khác như ớt, họ đậu đỗ, đu đủ, bầu bí.... https://tailieu.xyz/

5

Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu begomovirus trên ớt và cà chua ở khu
vực Miền Trung và Miền Nam Việt Nam”

2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
2.1. Mục tiêu
- Giải trình tự mẫu virus mới được phân lập
- Phân tích đặc trưng phân tử của các mẫu virus trên ớt và cà chua ở miền Trung và miền
Nam Việt Nam.
2.2. Yêu cầu
- Nhân dòng, giải trình tự và phân tích các đặc trưng phân tử mẫu virus đã được Nguyễn
Đức Anh phân lập trên ớt ở Đà Nẵng năm 2013.
- Đánh giá tính gây bệnh thông qua lây nhiễm nhân tạo nhờ vi khuẩn A. tumefaciens
(Agroinoculation).
- Chuẩn đoán begomovirus trên ớt và cà chuavới các mẫu thu được tại khu vực miền Trung
và miền Nam Việt Nam sử dụng cặp mồi chung phát hiện begomovirus là BegoA-For1 và
BegoA-Rev1.
- Chọn lọc các mẫu dương với BegoA để kiểm tra với các mồi đặc hiệu đã được xác định
như mồi ToLVHnV (F1/R2); TB101 (F1/ R2); VB65 (F1/R1); TY (F4/R4);To (F4/R4);
To100(F1/R1); TYKa-A (F1/R1), VNP93A (F1/R1), VNP93B (F1/R1)
- Nhân dòng và giải trình tự các mẫu virus trên ớt và cà chua đã được chọn, bước đầu định
danh các virus.

https://tailieu.xyz/

6

II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Những nghiên cứu nước ngoài
2.1.1. Tầm quan trọng của ớt và cà chua
Ớt là một loại quả của các cây thuộc chi Capsicum của họ Cà (Solanaceae). Ớt có nguồn gốc
từ châu Mỹ, ngày nay nó được trồng khắp nơi trên thế giới và được sử dụng làm gia vị, rau,
và thuốc. Hiện nay, Ấn Độ là nước sản xuất ớt lớn nhất thế giới với khoảng 1 triệu tấn mỗi năm,
nơi chỉ riêng Chợ Guntur (lớn nhất châu Á) có 1 triệu bao ớt.
Cà chua (S.lycopersicum) có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nó được người Tây Ban Nha lan truyền
tới Pilippine, Đông Nam Á và toàn bộ Châu Á, cuối cùng là Châu Âu. Cà chua là loài trái cây
vườn phổ biến nhất ở Hoa Kỳ. Khoảng 150 triệu tấn cà chua đã được sản xuất ra trên Thế giới
trong năm 2009. Trung Quốc là nước sản xuất cà chua lớn nhất, chiếm khoảng một phần tư sản
lượng toàn cầu, tiếp theo là Hoa Kỳ và Ấn Độ. Các khu vực chế biến tại California chiếm 90%
lượng sản xuất ở Mỹ và 35% lượng sản xuất thế giới (Hartz và cộng sự, 1997).
2.1.2. Những nghiên cứu về bệnh virus hại cây họ cà
Lịch sử bệnh xoăn vàng lá cà chua
Bệnh xoăn lá cà chua được ghi nhận đầu tiên trên thế giới từ cuối những năm 40 tại Israel. Các
vụ dịch bệnh đã xuất hiện rải rác vào những năm 60, trở thành nghiêm trọng vào đầu những năm
70 khi thiệt hại năng suất có thể đạt 100 %. Vào cuối những năm 70, tất cả các vùng trồng cà
chua tại Trung Đông đã bị nhiễm bệnh.
Bệnh đã được báo cáo tại vùng Đông Nam Á (Thái Lan và Đài Loan) châu Phi và Châu Âu vào
những năm 80. Bệnh lần đầu tiên được công bố tại Châu Mỹ vào năm 1993. Hiện nay, bệnh xoăn
vàng lá đã trở thành bệnh virus quan trọng nhất trên cây cà chua khắp thế giới(Picó và cộng sự,
1996; Ghanim và cộng sự, 2001; Moriones và cộng sự, 2007).
2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh xoăn vàng lá
2.3. Đặc điểm của Begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá
2.3.1. Phân loại chi Begomovirus
Việc phân loại virus gây bệnh được chẩn đoán theo Uỷ ban Quốc tế về Phân loại Virus
(International Committee on Taxonomy of Viruses – ICTV) dựa vào đặc điểm cấu tạo, hình thái
của virus cũng như mối quan hệ huyết thanh và các đặc tính khác như đặc điểm lan truyền, lây https://tailieu.xyz/

7

nhiễm, phạm vi kí chủ đặc biệt là các đặc điểm của DNA. Tên gọi của virus hại thực vật quy
định dùng tiếng Anh bao gồm tên của cây kí chủ chính, triệu chứng bệnh trên cây kí chủ đó và
cuối cùng là từ virus. Ví dụ: virus gây bệnh khảm thuốc lá - Tobacco mosaic virus - viết tắt là
TMV.
Nghiên cứu hệ thống phát sinh có thể chia begomovirus ra làm hai nhóm chính là nhóm Tân thế
giới (New world) bao gồm Châu Mỹ và nhóm Cựu thế giới (Old world) là khu vực bán cầu đông
bao gồm châu Âu, châu Phi, châu Á(Rybicki, 1994; Padidam và cộng sự, 1999).
Các begomovirus của hai nhóm tân thế giới và cựu thế giới được phân biệt nhau bởi đặc điểm bộ
gen. Tất cả các begomovirus ở cụm Tân thế giới đều có bộ gen kép, trong khi đó các begomovirus
ở cụm Cựu thế giới có cả bộ gen đơn và kép, thêm vào đó tất cả các begomovirus của cụm Cựu
thế giới có thêm một gen AV2 trên DNA-A, gen này không tồn tại ở các virus của cụm Tân thế
giới (Rybicki, 1994). Begomovirus ở cụm Tân thế giới có chuỗi PWRsmaGT ở đầu N trong vỏ
protein (CP) mã hóa bởi gen AV1, chuỗi này không có mặt ở begomovirus của cụm Cựu thế giới
(Harrison và cộng sự, 2002).
Rybicki (1994) dự đoán rằng bọ phấn di chuyển từ Châu Á sang châu Mỹ có thể đã mang tổ tiên
virus của cụm Tân thế giới mà chúng ta quan sát thấy ngày nay. Các virus này sau đó tiến hóa
theo một hướng khác với các virus ở cụm Cựu thế giới.
Gần đây dựa trên phân tích hệ thống phát sinh phát hiện ra rằng CoYVV ở Việt Nam không có
ORF AV2 và có chuỗi PWRsmaGT ở đầu N trong protein vỏ (CP), virus này giống với cụm Tân
thế giới hơn là cụm Cựu thế giới. Sự có mặt của CoYVV ở Việt Nam đã đưa ra giả thuyết rằng
virus giống với cụm Tân thế giới có thể đã có mặt ở Cựu thế giới trước khi bị phân chia ở kỷ
Gondwana (Ha và cộng sự, 2008).
Hiện nay, việc phân loại begomovirus chủ yếu dựa trên so sánh trình tự của chuỗi phân tử DNA-
A. Theo Fauquet et al.,2008, việc phân loại loài trong chi begomovirus tuân thủ một số tiêu chuẩn
sau:
(i) Thành phần của genome có hay không có DNA-B
(ii) Tổ chức bộ gen có hay không có gen AV2
(iii) Protein Rep không có khả năng tái bản trans trong thành phần bộ gen thì có thể ghi
nhận loài mới. Tuy nhiên cần lưu ý rằng chỉ một thay đổi nhỏ ở vị trí liên kết với Rep có thể ngăn
cản sự tương tác chức năng và sự tái tổ hợp của virus. https://tailieu.xyz/

8

(iv) Đặc điểm của protein vỏ. Mức độ tương đồng của trình tự aminoacid <90% thì ghi
nhận là loài mới, tuy nhiên mức độ tương đồng nucleotide của toàn bộ bộ gen vẫn là cần thiết
cho việc xác nhận phân loại virus
2.3.2. Hình thái của Begomovirus
Các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà
chua nói riêng và begomovirrus nói chung
thuộc chi Begomovirus (họ Geminivirus).
Các Geminivirus đều có cấu trúc phân tử
(virion) tương tự nhau bao gồm 2 hình cầu 20
mặt (icosahedron), mỗi mặt là 1 tam giác đều
với số đơn vị tam giác (T) trên mỗihình cầu
đa diện kép (gemini). Do nối với nhau nên 2
hình cầu này không
2.1Hinh thái của begomovirus
(http://www.rothamsted.bbsrc.ac.uk)
hoàn thiện dẫn tới trên mỗi hình cầu chỉ có 55 tiểu phần protein (protein vỏ) được xắp xếp thành
11 đơn vị hình thái, mỗi đơn vị gồm 5 tiểu phần protein (pentameric capsomer). Kết quả là toàn
bộ phân tử có 110 tiểu phần và 22 đơn vị hình thái(Gafni và Epel, 2002; Zhang và cộng sự, 2010).
2.3.3. Cấu trúc genome của Begomovirus
Begomovirus có bộ gen đơn có phân tử DNA-A hoặc bộ gen kép bao gồm hai phân tử DNA-A và
DNA-B. Cấu trúc của DNA-A là tương tự nhau ở hai nhóm virus này.
2.3.3.1. Cấu trúc của phân tử DNA-A
Cấu trúc của một DNA-A điển hình gồm có 6 ORF được sắp xếp theo hai chiều ngược nhau.
Theo chiều kim đồng hồ có hai gen AV1 và AV2. Gen AV1(CP) mã hóa vỏ protein có chức năng
lan truyền Begomovirus qua vector và nhập nhân tế bào. Gen AV2 mã hóa Protein có chức năng
cảm ứng triệu chứng, di chuyển hệ thống và tích lũy DNA của virus. Ngược chiều kim đồng hồ
gồm có 4 gen AC1, AC2, AC3, AC4. Trong đó, gen AC1(rep) mã hóa protein tái bản (Rep
protein) có chức năng tái sinh và tương tác với Protein của ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào. Gen
AC2 (TrAP) mã hóa Protein hoạt hóa phiên mã có chức năng ức chế phản ứng phòng thủ cuả
cây. Gen AC4 (Ren) mã hóa protein tăng cường tái sinh có chức năng tương tác với protein ký
chủ điều khiển chu kỳ tế bào. Gen AC4 mã hóa protein có chức năng cảm ứng triệu chứng và di
chuyển hệ thống (Ha và cộng sự, 2008). https://tailieu.xyz/

9

(v)
Hình 2.2. Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus
(http://wcrc.confex.com)
2.3.3.2. Cấu trúc của phân tử DNA-B.
DNA-B của các begomovirus kép mã hóa cho 2 protein BV1 và BC1 cả hai protein này đều liên
quan trong việc di chuyển của virus.
BV1 là một protein con thoi:BV1 có chức năng như là một protein con thoi, nó có chức năng vận
chuyển virus vào và ra khỏi tế bào, tuy vậy nó không liên quan đến việc nhập nhân của virus trong
lúc xâm nhiễm, chức năng này được kiểm soát bởi CP.
BV1 tương tác với BC1 trong việc di chuyển giữa các tế bào:Bắt đầu từ nhân BV1 tạo một phức hợp
với ssDNA, phức hợp này đi ra tế bào chất và kết hợp với BC1 tạo thành phức hợp BV1 : ssDNA :
BC1 sau đó di chuyển đến sợi liên bào và chuyển sang tế bào khác(Gafni và Epel, 2002).Vùng C
cuối của BV1 Squash leaf curl virus (SqLCV) được xác định là yếu tố cần thiết cho sự tương tác
với BC1.
BC1 là một protein vận chuyển.Chức năng của BV1 giống như là một protein vận chuyển đã
được làm rõ trong hai trường hợp sau: (1) BV1 của virus Bean dwarf mosaic virus (BDMV) đã
làm tăng size exclusion limit (SEL) của sợi liên bào (Tice và cộng sự, 2000); (2) BV1 của Squash
leaf curl virus (SqLCV) đã kích thích tạo ra các cấu trúc dạng ống bắt nguồn từ luới nội chất, các
ống này làm cho virus dễ dàng di chuyển giữa các tế bào (VARMA và Malathi, 2003). Như đã
được đề cập ở trên, BC1 tương tác với BV1 thông qua phức hợp BV1:BC1:ssDNA để vận chuyển
virus giữa các tế bào (Gafni và Epel, 2002).
BC1 có liên quan trong tính gây bệnh.Sự kết hợp của BC1 trong tính gây bệnh đã được chứng
minh thông qua thí nghiệm chuyển gen. Thuốc lá và cà chua đã được chuyển gen BC1 của Tomato https://tailieu.xyz/

10

mottle virus (TMoV) và BDMV, lần lượt những đặc điểm điển hình của virus xâm nhiễm đã
được nhận thấy.

Hình 2.3: Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus(Ha và cộng sự, 2008)
2.3.3.3. Đặc điểm của vùng IR
Các đơn vị sao chép ngược nhau trên phân tử DNA-A và DNA-B cách nhau bởi vùng liên gen
(itergenic region (IR)), ở hầu hết các trường hợp chúng chia sẻ 1 vùng lặp cao xấp xỉ 200 nucleotide,
gọi là vùng chung (common region (CR)). Vùng CR có chứa một điểm bắt đầu tái bản (ori) có tổ
chức bao gồm một cấu trúc thòng lọng (Stem-loop), cấu trúc này chứa một trình tự nuleotide bất
biến ngắn TAATATTAC, tại vị trí T
7
-C
8
cần cho việc cắt và nối DNA của virus trong quá trình
tái bản. IR có một cấu trúc nhận biết đặc hiệu của virus đã được xác định nằm dưới cấu trúc stem-
loop, nó chứa một motif được gọi là Interon(Argüello-Astorga và Ruiz-Medrano, 2001), cần thiết
cho nhận biết và bám vào sợi DNA của virus để bắt đầu tái bản. Sự tái tổ hợp của virus phụ thuộc
vào motif này. Các virus có chung motif ở vùng IR có khả năng tái tổ hợp với nhau. Mỗi một motif
sẽ tương ứng với một trình tự đặc trưng trên đầu N (Interon related domain – IRD) của protein REP.

2.3.3.4. Cấu trúc của phân tửDNA-β.
Một phân tử vệ tinh DNA dạng vòng đơn (DNA-β) đã được tìm thấy kết hợp với các
begomovirus có bộ gen đơn xâm nhiễm trên các cây trồng và cây dại bao gồm bông (cotton), mướp
tây (okar), dâm bụt (hibiscus), cây thục quỳ (hollyhock), cây đay cẩm quỳ (malvaceae), cây kim
ngân (Caprifoliaceae), cây cà chua (tomato), cây thuốc lá (tobacco), và cây ớt (solanaceae),
BV1 (NSP)
DNA-B
~2.7kb
CR
CR=Common
BC1 (MPB) https://tailieu.xyz/

11

squash (Cucurbitaceae), cây hoa cúc và ageratum (Asteraceae)(Briddon, 2003)(Zhou et al.,
2003). Phân tử DNA-β đã thu hút được sự chú ý kể từ khi (Briddon, 2003)chứng minh rằng triệu
chứng điển hình trên cây ageratum (bệnh vàng gân trên cây ageratum) và cây bông (bệnh cuốn lá
bông) chỉ có thể hình thành khi Ageratum yellow vein virus (AYVV) và Cotton leaf curl virus
(CLCV) cũng được lây nhiễm với một phân tử DNA – β tương ứng. Phân tử DNA-β có bộ gen sợi
vòng đơn với kích thước xấp xỉ 1350 nucleotide mang 3 vùng đặc trưng (Briddon, 2003).
Vùng bảo thủ của vệ tinh (Satellite conserved region (SCR): Vùng này khoảng 200 nucleotide
bao quanh cấu trúc stem-loop có mang một chuỗi trình tự ngắn TAT/ATATTAC đặc trưng của
Nanovuruses và Geminiviruses và một vùng bảo thủ cao với trên 100 nucleotide đã được xác
định nằm ở phía bên phải của đầu 5’ của stem-loop. Vùng bảo thủ này có rất nhiều GC xấp xỉ
khoảng 70% (Briddon, 2003)
Vùng giàu A (A rich region): Phân tử DNA-β chứa một vùng giàu A (đặc trưng 160-180 nucleotide
có khoảng 60 % A) (Briddon, 2003). Vị trí được xác định nằm giữa nucleotide ±700 và ±1000
(Zhou et al., 2003). Có ý kiến rằng vùng giàu A này đã được thêm vào nhằm tăng thêm kích
thước của chúng để trở thành có kích thước xấp xỉ kích thước ½ kích thước của bộ gen virus
(Mansoor et al., 2003). Bằng cách này phân tử DNA-β có thể lắp ráp được thông qua cơ chế chọn
lọc kích thước nghiêm ngặt trong phân tử virus.
Vùng ngược nghĩa mã hóa: Phân tử DNA-β mang một khung đọc mở βC1 trên sợi phía
bên phải của genome. Khung đọc mở này mã hóa 1 protein với kích thước đặc trưng (điển hình)
118 amino acids. Thông qua phân tích đột biến (Zhou et al., 2003) đã chứng minh sản phẩm βC1
có chức năng trong biểu hiện triệu chứng. Gần đây protein vệ tinh βC1 (Y10β) của virus Tomato
yellow leaf curl China virus chủng Y10 (TYLCCNV-Y10) đã được chứng minh là có khả năng
ngăn chặn phản ứng phòng thủ của cây (Cui et al., 2005).
SCR=Satellite Conserved Region https://tailieu.xyz/

12

Hình 2.4: Cấu trúc của phân tử DNA-β
(http://wcrc.confex.com)
2.3.4. Tái sinh của Begomovirus
Begomovirus tái sinh theo cơ chế vòng lăn (rolling circular mechanism). Cơ chế vòng lăn có thể
được chia làm 2 pha và được thực hiện trong nhân tế bào ký chủ (Picó và cộng sự, 1996)P
(1) Pha tổng hợp sợi DNA vòng đơn (bộ gen có mặt trong phân tử virus) thành sợi DNA vòng
kép khi bộ gen virus được chuyển vào nhân tế bào. Như vậy sợi kép sẽ gồm một sợi virus và một
sợi tương đồng virus. Pha này vẫn chưa được hiểu rõ.
(2) Pha tái sinh theo cơ chế vòng lăn: Protein Rep (sau khi được tổng hợp) sẽ cắt sợi virus tại
chuỗi bảo toàn TATATTAC. Nhờ vật liệu cũng như enzyme DNA polymearase của tế bào, sợi
virus được tổng hợp liên tục trên sợi tương đồng virus. Protein Rep lại tiếp tục cắt sợi virus mới
được tổng hợp tại chuỗi TATATTAC (cũng vừa mới được tổng hơp) thành một sợi virus hoàn
chỉnh dưới dạng sợi đơn mạch thẳng. Protein Rep sau đó sẽ nối 2 đầu của mạch thẳng để tạo ra
bộ gen virus sợi đơn mạch vòng hoàn chỉnh.
2.3.5. Tương tác và tái tổ hơp của Begomovirus
Cây trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thường bị nhiễm hai hoặc nhiều geminivirus
(Harrison và cộng sự, 2002; Ribeiro và cộng sự, 2006; Briddon và cộng sự, 2008)(Harrison và
cộng sự, 2002; Briddon, 2003; Ribeiro và cộng sự, 2006). Trong cây virus tương tác với nhau
tạo ra phức hợp bệnh (complex disease) (Moriones và Navas-Castillo, 2000; Chakraborty và
cộng sự, 2003). Kiểu tương tác đồng nhiễm bệnh của các virus (co-infection virus) tạo ra triệu
chứng rõ rệt hơn khi quan sát ở cây bị từng loại virus riêng. Tương tác có thể là sự bổ trợ
(complementation) hoặc tái tổ hợp.
Tác dụng phối hợp giữa hai Geminivirus tái tổ hợp mới có thể xảy ra, và tạo ra nhiều triệu chứng
hơn. Ví dụ như ở Cameroon, tái tổ hợp kép (double recombinant) được tạo thành khi đồng xâm
nhiễm các isolate của African cassava mosaic virus, đã tạo ra nhiều triệu chứng hơn so với cây
bị nhiễm từng isolate riêng. Một ví dụ khác là sự tái tổ hợp tự nhiên giữa hai begomovirus là
TYLCSV và TYLCV (Tây Ban Nha), đã tạo ra virus khỏe hơn hai virus ban đầu (Moriones và
Navas-Castillo, 2000).
Tái tổ hợp được cho là đóng vai trò quyết định tới sự tiến hóa của virus, đặc biệt là ở quần thể
Geminivirus, góp phần tạo nên sự đa dạng di truyền(Sarkar và Kulshreshtha, 1978). Tái tổ hợp https://tailieu.xyz/

13

của begomovirus có thể xảy ra ở mức độ chủng loài (Markham và cộng sự, 1996; Briddon, 2003)
chi, và ngay trong cùng một họ (Jones, 2003)

2.3.6. Triệu chứng bệnh
Bệnh xoăn vàng lá xuất hiện triệu chứng trong vòng 2-4 tuần sau khi nhiễm bệnh và phát triển
đầy đủ triệu chứng trong vòng 2 tháng. Triệu chứng có thể thay đổi theo điều kiện môi trường,
giai đoạn sinh trưởng và điều kiện sinh lý của cây tại thời điểm nhiễm bệnh(Picó và cộng sự,
1996). Do phải dựa hoàn to
àn vào vật chất của tế bào thực vật để sinh sản, các virus đã phát triển mạnh trên cây non và tế
bào non trong một cây. Ở các cây già cỗi, quá trình này sẽ chậm lại hay hầu như ngừng hẳn.
Chính vì vậy, tuổi cây non và phần non của cây là nơi virus sinh sản rất mạnh. Các điều kiện
ngoại cảnh như: nhiệt độ quá cao, thấp, độ pH của môi trường, ánh sáng, chế độ dinh dưỡng,
chăm sóc. Một chất được nhiều nhà khoa học xác nhận có bản chất protein tan là interferon có
thể sản sinh ra ở tế bào ký chủ khi virus xâm nhập. Với nồng độ thấp khoảng một phần triệu
gram đã có khả năng ức chế sinh sản của virus. Chính vì những lý do trên bệnh virus không gây
được tác hại huỷ diệt ngay mà thường gây thoái hoá. Sự huỷ diệt chỉ xảy ra khi điều kiện môi
trường và cây bệnh thuận lợi cho virus sinh sản và lây nhiễm, như trong các trận dịch của bệnh
lúa vàng lụi ở nước ta những năm 1960.
Triệu chứng sớm nhất là lá cong xuống dưới vào phía bên trong. Về sau, lá không có hình dạng,
nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chót lá lan vào giữa gân; lá cuốn cong lên phía trên thành hình
thuyền; lá non biến vàng mạnh, giòn và nhỏ hẹp. Cuống lá có thể xoắn vặn. Cây lùn còi cọc,
mọc nhiều cành nhánh nhỏ, đốt thân ngắn. Cây nhiễm sớm thường không ra quả do hoa bị rụng
(Picó và cộng sự, 1996). Bệnh thường xuất hiện vào các vụ có thời tiết nóng như hè thu và xuân
hè. https://tailieu.xyz/

14

Hình 2.6. Triệu chứng do Begomovirus gây ra trên ớt và cà chua
(httpwww.avrdc.org)
2.3.7. Lan truyền của Begomovirus
Virus lây lan bằng dịch cây, bằng tiếp xúc cơ giới
và chủ yếu là do bọ phấn Bemisia tabaci chích hút
từ cây bệnh rồi truyền sang cây khỏe theo kiểu bền
vững tuần hoàn. Mật độ bọ phấn càng cao thì tỷ lệ
cây bị bệnh xoăn lá càng nhiều. Bọ phấn dùng vòi
chọc vào mô mạch dẫn để hút dịch cây từ mạch
phloem. Virus được hút qua vòi, tới diều, thấm qua
màng ruột vào xoang cơ thể, đạt tới tuyến nước bọt
và cuối cùng vào ống nước bọt.
Hình 2.7. Bọ phấn Bemisia tabaci

2.3.8. Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra
Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng đã được xác định là do begomovirus gây ra như bệnh
bệnh xoăn vàng lá (ngọn) cà chua, một bệnh được xem là bệnh virus nguy hiểm nhất trên cà chua
khắp thế giới (Moriones và Navas-Castillo, 2000)Các bệnh nguy hiểm tương tự là bệnh khảm lá
sắn (Legg và Fauquet, 2004), bệnh cuốn lá bông (Briddon, 2003). Trong đó gây thiệt hại lớn nhất
là bệnh xoăn vàng lá ngọn cà chua.
Bệnh xoăn vàng lá cà chua gây thiệt hại lớn cả về năng suất và chất lượng. Bệnh đã trở thành
bệnh virus quan trọng nhất trên cây cà chua khắp Thế Giới, đặc biệt vùng nhiệt đới và cận nhiệt
đới (Picó và cộng sự, 1996). https://tailieu.xyz/

15

2.3.9. Biện pháp phòng trừ
Cho tới nay, người ta chưa phát hiện thấy gen kháng R chống lại begomovirus trên cây cà chua
trồng (Lycopersicon esculentum). Tuy nhiên một số gen kháng chống lại begomovirus đã được
phát hiện thấy trên một số giống cà chua dại. Như gen Ty1 được phân lập từ cây cà chua dại
(Lycopersicon chilense) và là một gen kháng trội không hoàn toàn (Ha và cộng sự, 2008).
Những năm gần đây công nghệ gen bước đầu được ứng dụng trong việc sản xuất giống kháng
bệnh bằng biện pháp bắn gen, chuyển gen. Chương trình sản xuất giống cà chua kháng bệnh đã
được bắt đầu từ cuối năm 1960 và được phát triển mạnh sau đó. Cơ sở của chương trình này là
việc lai để chuyển gen kháng bệnh từ các loài cà chua dại sang loài cà chua trồng. Có từ 1-5 gen
kháng bao gồm cả gen trội và gen lặn đã được công bố bởi (Picó và cộng sự, 1996). Năm 1998,
Vidavski & Czosnek cho biết tính chịu được quyết định chủ yếu bởi gen trội còn tính kháng được
quyết định bởi từ 2-3 gen lặn.
Cơ chế RNA slencing cũng đã được ứng dụng để tạo ra giống kháng được begomovirus. Ở Việt
Nam hiện nay Viện Di truyền Nông nghiệp đang tiến hành đề tài nghiên cứu về vấn đề này. Tuy
nhiên, có một vấn đề gặp phải là RNA silencing là một cơ chế của cây chống lại virus thì virus
cũng có cơ chế để chống lại sự silencing của cây. Người ta đã chứng minh bằng thực nghiệm
rằng AC4 của begomovirrus có thể ức chế đường hướng RNA silencing của cây ký chủ trong tế
bào chất.
Biện pháp đang đươc áp dụng hiện tại để phòng bệnh do begomovirus gây ra là diệt trừ bọ phấn, biện
pháp canh tác và sản xuất giống kháng bệnh.Sử dụng thuốc hoá học để trừ bọ phấn là một biện pháp
đã được tiến hành và cho hiệu quả cao. Tuy nhiên việc sử dụng thuốc không chỉ gây ô nhiễm môi
trường sống mà còn làm tăng tính kháng thuốc của bọ phấn.Chúng ta cũng có thể sử dụng biện pháp
dùng bẫy dính màu vàng để thu hút bọ phấn trắng.
2.4. Phương pháp RCA (rolling circle ampliﬁcation )
Là phương pháp dùng để nhân một lượng lớn DNA dưới dạng các polymer theo cơ chế vòng lăn
(tương tự như quá trình tái sinh của virus) nhờ một đoạn mồi ngẫu nhiên (Random hexamer), và
enzyme phi 29 DNA polymerase hoạt động ở nhiệt độ 30
0
C trong vòng 18 giờ để tổng hợp và
kéo dài sợi mới có kích thước lên tới 10kb. Các sợi mới được hình thành lại trở thành đoạn khuôn
để tổng hợp các sợi tiếp theo.
2.5. Kỹ thuật xác định trình tự https://tailieu.xyz/

16

Những phương pháp xác định trình tự axit nucleic đang được sử dụng ngày nay đều dựa trên
phương pháp của Frederick Sanger (1977), có cải tiến. Phương pháp này còn được gọi là phương pháp
enzyme học hay phương pháp dideoxy.
Trong phương pháp này, người ta sử dụng các nhân tố kết thúc đặc hiệu quá trình kéo dài AND
khi tổng hợp. Nhân tố kết thúc là các 2,3 dideoxynucleosid triphosphat (ddNTP). Các ddNTP có
thể kết hợp vào chuỗi DNA đang tổng hợp qua nhóm 5 triphosphat nhưng lại không thể tiếp tục
kết hợp được với phân tử desoxynucleosid triphosphat tiếp theo. Do đó khi trộn lẫn lượng nhỏ
dideoxynucleosid triphosphat với 4 loại desoxynucleosid triphosphat rồi tiến hành tổng hợp DNA
nhờ DNA polymerase thì sẽ thu được một loạt các đoạn DNA được kết thúc đặc hiệu bởi gốc
dideoxy nucleotit. Tiến hành 4 thí nghiệm tách rời, mỗi phản ứng bổ sung 1 loại dideoxy nucleotit
khác nhau sẽ thu được các đoạn DNA có kết thúc bằng các dideoxy nucleotit khác nhau và hơn
kém nhau 1 nucleotit. Chạy điện di các đoạn này rồi hiện hình chúng, ta có thể xác định trình tự
của chuỗi DNA quan tâm.
https://tailieu.xyz/

17

2.6. Kỹ thuật agroinoculation
Kỹ thuật chuyển cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào cây nhờ vi khuẩn A.tumerfaciens được gọi là
agroinoculation. Kỹ thuật agroinoculation đòi hỏi phải thiết kế 1 cấu trúc xâm nhiễm bao gồm
bộ gen virus (hoặc vệ tinh) được thiết kế chứa 2 nguồn gốc tái sinh (ori) ở 2 đầu và được nối vào
1 vị trí nằm giữa bờ trái và bờ phải của 1 vector nhị nguyên. Cấu trúc xâm nhiễm sẽ được biến
nạp vào tế bào vi khuẩn A. tumerfaciens. Khi lây nhiễm, tế bào vi khuẩn sẽ tiếp xúc với tế bào
cây ký chủ và các protein chức năng (nằm trên Ti plasmid) sẽ chuyển toàn bộ phần DNA nằm
giữa bờ trái và bờ phải của cấu trúc xâm nhiễm vào nhân tế bào cây ký chủ và tổng hợp phần
DNA này vào bộ gen tế bào cây ký chủ. Trong tế bào chuyển gen, gen Rep của virus sẽ được
biểu hiện thành protein Rep. Protein Rep sẽ cắt bộ gen virus khỏi bộ gen tế bào cây tại vị trí đặc
hiệu trên chuỗi ori và nối lại thành bộ gen virus nguyên vẹn. Bộ gen virus nguyên vẹn này sẽ
thực hiện chức năng sinh học và gây bệnh.
A: Agrobacterium tumefaciens. B: Agrobacterium genome. C: Ti Plasmid : a: T-DNA , b: Vir
genes , c: Replication origin , d: Opines catabolism genes. D: Plant cell. E: Mitochondria. F:
Chloroplast. G: Nucleus
Có 3 kỹ thuật agroinoculation chính là: (i) thấm chân không (lá cây được nhúng trong dung dịch
vi khuẩn, được xử lý chân không để hút khí trong gian bào; vi khuẩn sẽ dễ dàng xâm nhập vào
trong mô qua khí khổng khi áp suất trở lại bình thường); (ii) tiêm trực tiếp vi khuẩn vào mô; và
(iii) tưới trực tiếp dịch vi khuẩn vào đất
2.7. Kỹ thuật RCA (Rolling Circle Amplification)
Gần đây, một phương pháp nhân bản DNA mới dùng kỹ thuật RCA (Rolling Circle
Amplification) đã được sử dụng để nhân các bộ gen DNA dạng mạch vòng. Kỹ thuật RCA dùng https://tailieu.xyz/

18

enzyme DNA polymerase của thực khuẩn thể Φ29, một enzyme có hoạt tính chuyển mạch
(strand-displacement) rất cao, và mồi hexamer để nhân các phân tử DNA mạch vòng thành các
multimer mạch thẳng (gồm nhiều bộ gen virus liên tiếp) (Hình 2.10) Sản phẩm RCA sẽ được cắt
bằng enzyme cắt giới hạn thích hợp và được dòng hóa trong các vector dòng hóa thông thường.
Đây là kỹ thuật hiện đang rất thông dụng trong nghiên cứu các virus có bộ gen DNA mạch vòng
kể cả các begomovirus và vệ tinh (Inoue-Nagata và cộng sự, 2004; Haible và cộng sự, 2006;
Knierim và Maiss, 2007).

Hình 2.10. Cơ chế tái bản các phân tử DNA mạch vòng bằng kỹ thuật RCA (Rolling Circle
Amplification) dùng hexamer và Φ29 polymerase DNA (Fujii và cộng sự, 2006)
Kỹ thuật RCA đã được ứng dụng để thiết kế các cấu trúc xâm nhiễm của begomovirus. Sản phẩm
RCA dạng multimers được cắt đơn bằng enzyme cắt giới hạn thích hợp trong điều kiện không
triệt để để tạo ra nhiều sản phẩm monomer (1 bộ gen), dimer (2 bộ gen) và multimer (nhiều bộ
gen). Chỉ các sản phẩm dimer được tinh chiết khỏi gel agarose và nối vào vector nhị nguyên
Bằng cách đơn giản này, các cấu trúc xâm nhiễm của begomovirus có thể được tạo ra khá nhanh https://tailieu.xyz/

19

chóng (Inoue-Nagata và cộng sự, 2004; Knierim và Maiss, 2007; Ferreira và cộng sự, 2008; Wu
và cộng sự, 2008; Wyant và cộng sự, 2011)
https://tailieu.xyz/

20

III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU
3.1.Địa điểm, thời gian, đối tượng và vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Bảng 3.1: Các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá ớt được thu ở miền Trung Việt Nam.
Ký hiệu Địa điểm, khu vực thu mẫu Đối tượng Triệu chứng
VNP624 Túy Loan – Đà Nẵng ớt Begomovirus điển hình
VNP626 Túy Loan – Đà Nẵng ớt Khảm vàng
VNP628 Túy Loan – Đà Nẵng ớt Begomovirus điển hình
VNP635 Điện Bàn – Quảng Nam ớt Begomovirus nhẹ
VNP722 Vinh – Nghệ An ớt Cuốn lá ngọn
VNP867 Túy Loan – Đà Nẵng ớt Begomovirus nhẹ
VNP868 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Khảm
VNP869 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Khảm
VNP870 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Khảm
VNP871 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Khảm
VNP872 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Khảm
VNP873 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Khảm
VNP874 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Khảm
VNP875 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Lá nhăn nhỏ, già
VNP876 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Khảm
VNP877 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Khảm
VNP878 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Lá nhăn
VNP879 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Khảm
VNP880 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Khảm
VNP883 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Khảm
VNP884 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Khảm
VNP885 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Khảm
VNP886 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Khảm
VNP887 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Khảm https://tailieu.xyz/

21

VNP888 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Khảm
VNP889 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Lá khảm, hơi nhăn
VNP890 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Khảm
VNP891 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Khảm
VNP892 Hòa Vang – Đà Nẵng ớt Khảm , nhăn lá
VNP907 Túy Loan – Đà Nẵng ớt Khảm vàng từ trong ra
VNP908 Túy Loan – Đà Nẵng ớt Khảm
VNP909 Túy Loan – Đà Nẵng ớt Khảm, xoăn lá
VNP910 Túy Loan – Đà Nẵng ớt Khảm, xoăn lá
VNP911 Túy Loan – Đà Nẵng ớt Khảm từ trong ra, xoăn lá

Bảng 3.2: Các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá ớt được thu ở miền Nam Việt Nam
Ký hiệu Địa điểm, khu vực thu mẫu Đối tượng Triệu chứng
VNP313 Châu Thành – An Giang ớt Khảm
VNP319 Châu Thành – An Giang ớt Xoăn lá
VNP323 Châu Thành – An Giang ớt Xoăn lá
VNP641 Phú Mỹ - Bình Định ớt Begomovirus, lá nhỏ cuốn
VNP646 Phù Cát – Bình Định ớt begomovirus
VNP650 Phù Cát – Bình Định ớt begomovirus
VNP673 Châu Thành – An Giang ớt begomovirus
VNP675 Cao Lãnh – Đồng Tháp ớt begomovirus
VNP683 Thanh Bình – Đồng Tháp ớt begomovirus
VNP687 Thanh Bình – Đồng Tháp ớt Khảm vàng
VNP701 Châu Thành – An Giang ớt Khảm vàng
VNP704 Châu Thành – An Giang ớt Begomovirus
VNP717 Bình Thủy – Cần Thơ ớt Lá nhỏ, cứng, vàng
VNP718 Ô Môn – Cần Thơ ớt Xoăn vàng lá điển hình
VNP826 Đan Dương – Lâm Đồng ớt Khảm nặng
VNP827 Đan Dương – Lâm Đồng ớt Khảm vàng, lá nhăn https://tailieu.xyz/

22

VNP828 Đan Dương – Lâm Đồng ớt Khảm vàng, lá nhỏ
VNP829 Đan Dương – Lâm Đồng ớt Lá đốm,vàng rõ
VNP831 Đan Dương – Lâm Đồng ớt Lá nhăn, vàng rõ
VNP854 Playku – Gia Lai ớt begomovirus
VNP855 Playku – Gia Lai ớt begomovirus
VNP856 Playku – Gia Lai ớt Begomovirus

Bảng 3.3: Các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua được thu ở miền Trung Việt Nam
Ký hiệu Địa điểm, khu vực thu mẫu Đối tượng Triệu chứng
VNP436 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá
VNP441 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá
VNP725 Vinh – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá
VNP727 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá
VNP893 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá
VNP894 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Khảm vàng
VNP895 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn chết hoại, đốm
VNP896 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Vàng, chết hoại gân, cuống lá
VNP897 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá
VNP898 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Đốm vàng. Chết hoại gân
VNP899 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá
VNO900 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá
VNP901 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Đốm xanh, chết hoại
VNP902 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá
VNP903 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá
VNP904 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xanh đốm, chết hoại
VNP905 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá
VNP906 Diễn Châu – Nghệ An Cà chua Xoăn vàng lá

https://tailieu.xyz/

23

Bảng 3.4: Các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua được thu ở miền Nam Việt Nam
Ký hiệu Địa điểm, khu vực thu mẫu Đối tượng Triệu chứng
VNP310 Long Xuyên – An Giang Cà chua Begomovirus điển hình
VNP326 Long Xuyên – An Giang Cà chua Nhăn tím, chết hoại gân
VNP820 Đan Dương – Lâm Đồng Cà chua Nhăn lá, không khảm
VNP821 Đan Dương – Lâm Đồng Cà chua Xoăn lá nhỏ, ko khảm
VNP822 Đan Dương – Lâm Đồng Cà chua Xoăn, cuộn lá
VNP823 Đan Dương – Lâm Đồng Cà chua Xoăn, lá nhỏ
VNP843 Buôn ma thuật – Đăk Lăk Cà chua Khảm vàng, lá nhăn nhỏ
VNP844 Buôn ma thuật – Đăk Lăk Cà chua Khảm vàng, lá không nhăn
VNP845 Buôn ma thuật – Đăk Lăk Cà chua Xoăn, lá nhăn, bé
VNP846 Buôn ma thuật – Đăk Lăk Cà chua Vàng lá ngọn, như bạch tạng
VNP847 Buôn ma thuật – Đăk Lăk Cà chua Vàng lá ngọn
VNP848 Buôn ma thuật – Đăk Lăk Cà chua Lá khảm, vàng, xoăn nhỏ
VNP857 Playku – Gia Lai Cà chua Đốm chết hoại
VNP862 Playku – Gia Lai Cà chua Xoăn vàng ngọn nhẹ
VNP863 Playku – Gia Lai Cà chua Mép lá xoăn ngược lên phía trên
VNP864 Playku – Gia Lai Cà chua Lá xoăn, vàng nhăn
VNP865 Playku – Gia Lai Cà chua Xoăn ngọn mạnh
VNP866 Playku – Gia Lai Cà chua Xoăn ngọn, chùn ngọn

3.1.2. Địa điểm nghiên cứu
Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội
3.1.3. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 6/2013 đến tháng 12/2013
3.1.4. Vật liệu nghiên cứu
3.1.4.1. Chất kháng sinh
Các kháng sinh được sử dụng trong nghiên cứu gồm: Rifampicin, kanamycin, streptomycin,
tetracylin. Các kháng sinh được chuẩn bị dưới dạng dung dịch gốc như sau:
- Rifampicin 34 μg/μl: hòa 0,034 g trong 1 ml Methanol
- Kanamycin 100 μg/μl: hòa 0,1 g trong 1 ml nước cất hai lần
- Streptomycin 50 μg/μl: hòa 0,05 g trong 1 ml nước cất hai lần
- Tetracylin 12,5 μg/μl: hòa 0,012 g trong 1 ml ethanol 70 %
Các kháng sinh được bảo quản ở tủ lạnh sâu – 20
0
C, trong đó rifampicin và kanamycin được bọc
kín bằng giấy bạc. https://tailieu.xyz/

24

3.1.4.2. Cấu trúc xâm nhiễm
Các cấu trúc xâm nhiễm gồm toàn bộ bộ gen virus (hoặc DNA-β) được nối vào một vector nhị
nguyên pCAMBIA-2300 mang gen kháng kanamycin đối với cả chọn lọc thực vật và chọn lọc
vi khuẩn. Đây đây là một vector nhị nguyên thuộc nhóm vector pCAMBIA được tạo ra bởi viện
CAMBIA (http://www.cambia.org/daisy/cambia/home.html). pCAMBIA-2300 là vector tối
thiểu cho chuyển gen thực vật và được sử dụng tốt trong thí nghiệm agroinoculation.
Phần gen virus (hoặc DNA-β) được xây dựng sao cho toàn bộ bộ gen virus (hoặc DNA-β) có 2
vùng nguồn gốc tái sinh (ori) ở 2 đầu.
Các chủng vi khuẩn sử dụng
Chủng vi khuẩn A. Tumefaciens khả biến
Chủng vi khuẩn A.tumefaciens được sử dụng là LBA4404. Chủng này chứa Ti plasmid pAL4404.
Gen kháng Rifampicin nằm trên bộ genome vi khuẩn còn gen kháng streptomycin nằm trên Ti
plasmid pAL4404.
Hình 3.2: Hinh thái vi khuẩn A..tumefaciens
Chủng vi khuẩn E. Coli khả biến
Chủng vi khuẩn E.coli được sử dụng là chủng XL1-Blue. Chủng này chứa gen kháng Tetracylin
nằm trên bộ gen của vi khuẩn

https://tailieu.xyz/

25

3.1.4.3. Thành phần cho phản ứng PCR, RCA, Điện di
Cặp mồi chung DNA-A của Begomovirus là BegoA-ReV1 & Bego-AFor1 (Ha Viet Cuong et
al., 2006).
BegoA-ReV1: 5’- ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC
*
-3’
BegoA-For1 : 5’- TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC
*
-3’
* Y (C / T), R (G / A), H (A / C / T), M (A / C), B (C / G / T), D (A / G / T), K (G / T)
và i = inosine.

Các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng
Bảng 3.5 : Các mồi đặc hiệu
Các mồi Trình tự mồi Kích thước sản phẩm Phát hiện virus
ToLCHnV-F1 TCAGTTATTCGTGCTAAGGAC 1260 bp Tomato leaf Curl
Hainam virus ToLCHnV-
R2
CAACGCCAAGAAAGCAACG
TB101- F1 CGAGTTGGTAAACGTTTCTGC 320bp Tomato Leaf Curl
ChinaVirus (ToLCCNV) TB101- R1 TCCTGGTGATTGTACACTACG
VB65 –F1 TCCTCCGTCGAATTGGTCTC 780bp VB
VB65 –R1 GAAGGCAAATTCATCTGCACG
TY –F4 AAGAGCCTCCGACTTACTGC 330bp Tomato Yellow Leaf Curl
Vietnam Virus
(TYLCVNV)
TY –R4 CAAAACCTAAACACCCCAACG
(CEGPCKVQS) (IPT/A/SIF/VLCNP)
AV1
AV2
AC3
AC2
AC1
AC4
BegoAFor
1
BegoARev
1
~ 1.2 kb
DNA-A
Hình 3.3: Sơ đồ tổ chức bộ gen DNA-A (biểu diễn dưới dạng mạch thẳng) của
begomovirus và vị trí tương đối của cặp mồi BegoA-For1 và BegoA-Rev1. Mũi tên
dạng hộp biểu diễn vị trí và hướng của các ORF. Dãy chữ trong 2 ngoặc kép là các
chuỗi axit amin bảo thủ tương ứng với 2 mồi BegoAFor1 và BegoARev1. https://tailieu.xyz/

26

To –F4 CGTTTTCAAGTTCTTCGTCGA 530bp ToLCVV
To –R4 AAAACAGGCCCTTCCTATCG
To100 –F1 CTTCTGTATCAATTGTGCCTTC 150bp Tomato leaf curl Hanoi
VirusToLCHanV To100 –R1 GTTTTCTAATCTGCCGAGTTTG
TYKa-A –F1 CCTTTTCCAGAGAGTTTGCAC 680bp Tomato Yellow Leaf Curl
Kachanaburi Virus TYKa-A –R1 GATGCTGAGAAACGATGAAGC

3.2. PHƯƠNG PHÁP
3.2.1. Chiết DNA tổng số
DNA tổng số từ mô lá được chiết theo các phương pháp:
+ Phương pháp chiết nhanh nhanh bằng NaOH (Wang et al., 1993):
Cho khoảng 50 mg mô lá mẫu bệnh vào tube 1,5 mL, cho tiếp 500 µl dung dịch NaOH 0,5 M vào
tube 1,5mL, dùng chày nhựa chuyên dụng để nghiền nhuyễn mẫu lá. Lấy 100 µl dung dịch đệm Tris
0,1 M, pH = 8 vào tube 1,5mL, sau khi nghiền mẫu xong lấy 2 µl dịch nghiền cho vào tube 1,5mL
chứa dung dịch đệm Tris 0,1M, pH = 8. Dịch hòa loãng này được dùng để chạy PCR.
+ Phương pháp chiết DNA bằng dung dịch đệm CTAB (Cetryl Ammonium Bromide ) theo mô tả
của Doyle & Doyle (1987), Wang et al., 1993 như sau:
Nghiền khoảng 0.1g mẫu tươi trong 500µl đệm CTAB (đã bổ xung Beta- mercaptalthanol). Sau
đó, dung dịch mẫu được chiết 2 lần bằng hỗn hợp Chlorofom : isoamyl alcohol 24:1. DNA tổng số
được tủa bằng Propanol 100%, rửa cặn DNA 2 lần bằng 700µl Etanol 70% và để khô cặn DNA
trong không khí ít nhất 30 phút. Hoà cặn DNA trong 100µl nước cất hai lần đã hấp vô trùng, bảo
quản DNA ở -20
0
C.
https://tailieu.xyz/

27

3.2.2. Phản ứng RCA (rolling circle ampliﬁcation )
Phản ứng được tiến hành với tổng thể tích là 20 μL trong đó có
dd H2O 4.75 μl
DNA 2.5 μl
dNTPs (10 mM each) : 1.0 μl
20X Exo-Hexamer (500 μM, Fermentas) 0.25 μl
10XPhi29 buffer (Fermentas) 1.0 μl
Phi29 enzyme (10 U/μL, Fermentas) 0.25 μl
Pyrophosphate (0.1U/μL, Fermentas) 0.25 μl
Phản ứng được ủ ở 30
o
C trong 18h sau đó ủ ở 65
o
C để bất hoạt enzyme.
Thực hiện phản ứng cắt sản phẩm RCA bằng BamHI với tổng thể tích là 10 μL với các thành
phần phản ứng như sau:
H2O 6 μL
React 3 X 10 1 μL
BamHI (10u/ μL) 1 μL
Sản phẩm RCA 2 μL
Trộn đều và ủ tube ở 37
0
C trong 5phút và bất hoạt enzyme bằng 0.5 μL EDTA 0.5M. Điện di
sản phẩm cắt trên agarose gel 1 % và chứa 0.5 mg/mL ethidium bromide.
https://tailieu.xyz/

28

3.2.3.Tiến hành phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) và điện di sản phẩm PCR.
3.2.3.1. Chu trình phản ứng PCR.
Bảng 3.6.Thành phần của mỗi phản ứng PCR
H2O 18.75l
Buffer 2.5l
dNTPs 0.5l
Mồi F 0.5l
Mồi R 0.5l
MgCl2 1.5l
Taq (Fermantas) 0.25l
DNA 0.5l
Tổng thể tích 25l

Quy trình thực hiện phản ứng PCR
94
o
C 4 phút x 1
94
o
C 35 giây
52
o
C 35 giây x 35
72
o
C 1 phút
72
o
C 5 phút
3.2.3.2. Điện di sản phẩm PCR.
- Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1 % được chuẩn bị bằng đệm TAE và chứa 0.5
mg/mL ethidium bromide. https://tailieu.xyz/

29

- Gel được chạy trên thiết bị điện di là Mini-Sub Cell (Biorad) với đệm TAE ở điện thế 100V
trong 30 - 40 phút.
- Bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại và được chụp lại bằng máy chụp chuyên dụng
hoặc máy ảnh kỹ thuật số.
3.2.4. Tinh chiết sản phẩm điện di
Sử dụng bộ kit tinh chiết của BioNeer - Accuprep Gel Purification Kit. Các bước
tinh chiết thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
3.2.5. Xây dựng cấu trúc xâm nhiễm
- Mở vector pCAMBIA2300 bằng BamHI
DNA plasmid 10 μL
BamHI (10u/ μL) 2 μL
10X React 3 2 μL
H2O hấp vô trùng 6 μL
Ủ ở 37
0
C trong một giờ sau đó điện di và tinh chiết DNA plasmid từ gel agarose bằng kit
Accuprep gel purification kit (Bioneer)
Dephosphorylation vector pCAMBIA-2300 sau khi được mở vòng bằng BamHI
pCAMBIA (cắt bằng BamHI, purified) 30
10X Alkaline Phosphatase buffer (Roche) 4
Alkaline Phosphatase (Roche) 6
Sau đó ủ ở 37
0
C trong một giờ và tinh sạch bằng kit Purelink PCR purification kit (Invitrogen)
Nối vector pCAMBIA (dephosphorylated, purified) and Dimeric (gel purified)
spCAMBIA-2300 3μL
Dimer 13 μL
T4 ligation buffer 2 μL
T4 ligase (5U/ μL) 2 μL https://tailieu.xyz/

30

Sau đó ủ ở 22
o
C trong 2h và để ở 4
o
C qua đêm
3.2.6. Chuẩn bị E.coli chủng X1 Blue khả biến
Tế bào E.coli X1Blue khả biến được chuẩn bị theo An và cs. (1988)
Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn trong 5 ml môi trường LB lỏng, để qua đêm ở nhiệt độ 37
0
C
trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm).
Bước 2: Chuyển 2 ml dịch vi khuẩn ở bước 1 sang 50 ml môi trường LB lỏng đựng trong
lọ định mức ở 500 ml. Ủ trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm / 37
0
C) cho tới khi mật độ quang
OD600 đạt 0,5 - 1,0.
Bước 3: Làm lạnh vi khuẩn bằng để bình trong đá khoảng 5 phút. Cho toàn bộ dung dịch
chứa vi khuẩn ly tâm với tốc độ 3000 g trong vòng 5 phút ở 4
0
C.
Bước 4: Loại bỏ dịch trên tủa (dùng pipes hút hết dịch trên tủa). Hoà cặn vi khuẩn với 1
ml dung dịch CaCl2 100 mM đã được làm lạnh trước trong đá. Sau đó phân phối cứ 0,1 ml dịch
vi khuẩn thì cho vào 1 tube Eppendorf loại 1,5 ml được làm lạnh trước trong đá. Hoá đông vi
khuẩn khả biến và bảo quản trong tủ lạnh sâu - 80
0
C.
3.2.7. Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn E.coli khả biến bằng phương
pháp sốc nhiệt
- Đầu tiên lấy tube chứa XL1–Blue compentent cell (ở tủ -80
o
C ) cho lên khay đá vụn để
tan đông trong 20 – 30 phút (để trong box cấy).
- Cho máy lắc vào trong tủ ầm và đặt nhiệt độ 37
o
C, chuẩn bị 4 đĩa LB đặc.
- Cho 150 μL vi khuẩn dã đông vào tube 1.5 ml đã đặt trên đá trước đó. Cho 10 μL sản
phẩm nối vào tube chứa vi khuẩn, ủ trên đá ít nhất 30 phút.
- Sốc nhiệt ở 42
o
C trong 1 phút rồi để trên đá lạnh 5 phút, spin nhẹ.
- Thêm 600 μL SOC vào mỗi tube, nuôi lắc 1 giờ ở 37
o
C
- Ly tâm 3-5 phút, loại bỏ dịch trên tủa để lại 100 μL.
Cấy dịch vi khuẩn trên đĩa LB agar + Kanamycin + Tetracylin .
- Nuôi qua đêm ở 37
o
C trong tủ binder, kiểm tra số khuẩn lạc mọc. https://tailieu.xyz/

31

3.2.8. Phản ứng PCR kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc
Nuôi cấy từng khuẩn lạc mọc trong 3 ml môi trường LB lỏng (chứa hai loại kháng sinh) ở 37
o
C,
lắc 250 vòng/ phút qua đêm. Ly tâm dịch vi khuẩn sau đó rửa cặn vi khuẩn hai lần bằng nước vô
trùng. Hút 50 μL nước vô trùng và hòa tan cặn vi khuẩn và để trong tủ -20
o
C ít nhất 30 phút.
Lấy tube ra thả vào nước sôi 10 phút, đảo đều tube và đem dịch vi khuẩn đi chạy PCR
3.2.9. Tinh chiết plasmid
DNA plasmid được chiết từ tế vi khuẩn theo kỹ thuật chiết plasmid (miniprep) của Sambrook và
cs. (1989).
Bước 1: Lấy 1,5 ml dịch vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường LB lỏng chứa kháng sinh
cho vào mỗi tube Eppendorf loại 1,5 ml.
Bước 2: Ly tâm 3 phút ở máy ly tâm để bàn để lắng cặn vi khuẩn. Loại bỏ dịch trong để
nguyên cặn trong tube.
Bước 3: Cho tiếp 1,5 ml dịch vi khuẩn vào tube và lặp lại bước 2.
Bước 4: Ly tâm 3 phút để lắng cặn vi khuẩn, loại bỏ dịch trong để nguyên cặn trong tube.
Dùng pipes hút hết dịch trên tủa. Để tube trên đá khoảng 3 phút.
Bước 5: Cho 100 μl dung dịch I đã được để lạnh trên đá vào tube. Cho tiếp 2 μl RNAse
A (dung dịch gốc 10 mg/mL). Votex để hòa tan vi khuẩn.
Bước 6: Cho 200 μl dung dịch II vào tube (cần kiểm tra xem SDS có bị kết tủa không nếu
có cần làm ấm dung dịch để hoà tan SDS). Ở bước này không cần trộn tube và phải để tube trên
đá và không được để dịch tan quá 2 phút vì plasmid dễ bị biến tính ở nồng độ kiềm cao. Bước
này là bước phá huỷ vách tế bào giải phóng DNA genom và DNA plasmid nên dịch tan trở nên
rất nhầy.
Bước 7: Cho 150 μl dung dịch III đã để lạnh trước trên đá vào tube, trộn đều bằng lắc
tube nhiều lần. Đây là bước trung hoà, toàn bộ protein và DNA genom (vì có kích thước lớn) sẽ
bị kết tủa còn DNA plasmid (vì có kích thước nhỏ) nên vẫn hoà tan trong dung dịch. Để tube
trên đá khoảng 3 phút. https://tailieu.xyz/

32

Bước 8: Ly tâm dung dịch 5 phút để kết tủa prtein và DNA genomic. Chuyển dịch trên
tủa (khoảng 400 μl) có chứa DNA plasmid sang một tube mới, loại bỏ tube cũ và cặn bên trong
tube.
Bước 9: Cho một thể tích tương đương (khoảng 400 μl) isopropanol vào tube. Trộn đều
bằng đảo tube nhiều lần. Để tube ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút. Trong bước này isopropanol
sẽ làm kết tủa DNA plasmid.
Bước 10: Ly tâm 5 phút để kết tủa DNA plasmid. Loại bỏ dịch trong giữ lại cặn DNA
plasmid. Ly tâm nhanh để lắng tất cả dịch bám trên thành tube xuống dưới và dùng pipes hút hết
dịch
Bước 11: Cho 500 μl cồn 70 % vào tube để rửa cặn, loại bỏ cồn (trong bước này rửa cồn
càng nhiều lần càng tốt). Để loại bỏ hết cồn ra khỏi tube, thì sau khi đổ hết cồn ra ly tâm ngắn
khoảng vài giây để lắng tất cả cồn bám trên thành tube xuống dưới và dùng pipes hút hết cồn.
Bước 12: Để khô cặn DNA trong không khí khoảng 30 phút.
Bước 13: Hoà cặn DNA plasmid với 50 μl dd H2O vô trùng hoặc đệm TE (pH = 8). Dịch
DNA bây giờ có thể được dùng cho các phản ứng enzyme hoặc bảo quản ở -20
0
C.
3.2.10. Chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens khả biến (competent cells)
Tế bào A. tumefaciens khả biến được chuẩn bị theo An và cs. (1988)
Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn trong 5 ml môi trường LB lỏng, để qua đêm ở nhiệt độ 28
o
C
trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm).
Bước 2: Chuyển 2 ml dịch vi khuẩn ở bước 1 sang 50 ml môi trường LB lỏng đựng trong
lọ định mức ở 500 ml. Ủ trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm / 28
o
C) cho tới khi mật độ quang
OD600 đạt 0,5 - 1,0.
Bước 3: Làm lạnh vi khuẩn bằng để bình trong đá khoảng 5 phút. Cho toàn bộ dung dịch
chứa vi khuẩn ly tâm với tốc độ 3000 g trong vòng 5 phút ở 4
o
C.
Bước 4: Loại bỏ dịch trên tủa (dùng pipes hút hết dịch trên tủa). Hoà cặn vi khuẩn với 1
ml dung dịch CaCl2 20 mM đã được làm lạnh trước trong đá. Sau đó phân phối cứ 0,1 ml dịch https://tailieu.xyz/

33

vi khuẩn thì cho vào 1 tube Eppendorf loại 1,5 ml được làm lạnh trước trong đá. Hoá đông vi
khuẩn khả biến và bảo quản trong tủ lạnh sâu – 80
o
C.
3.2.11. Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens khả biến
Các cấu trúc xâm nhiễm vừa được thiết kế được biến nạp vào tế bào vi khuẩn khả biến
theo phương pháp đông tan (Hofgen & Willmitzer, 1988). Trong điều kiện phòng thí nghiệm,
bước đông tan được thưc hiện với tủ lạnh sâu – 80
o
C thay vì bằng nitơ lỏng. Các bước cụ thể là:
Bước 1: Lấy tế bào A. tumefaciens từ tủ lạnh - 80
o
C. Để vi khuẩn tan đông trong đá.
Bước 2: Lấy 10 μl dịch DNA của mỗi cấu trúc cho vào tube tế bào vi khuẩn và trộn đều.
Bước 3: Để hỗn hợp dịch vi khuẩn và DNA vào tủ lạnh sâu – 80
o
C trong vòng 15 phút.
Bước 4: Để hỗn hợp dịch vi khuẩn và DNA vào block nhiệt 37
o
C trong vòng 5 phút.
Bước 5: Cho dịch vi khuẩn đã được transfomation vào ống nghiệm chứa 1 ml môi trường
LB lỏng, ủ ống nghiệm trong tủ ấm có lắc ở 28
o
C trong 1giờ.
Bước 6: Chuyển dịch vi khuẩn vào tube 1,5 ml.
Bước 7: Ly tâm trong 3 phút, lấy phần dịch trên tủa, loại cặn, sau đó cho tiếp 100 μl môi
trường LB lỏng.
Bước 8: Dịch vi khuẩn ở bước 8 được cấy trên đĩa môi trường LB - agar có 3 loại kháng
sinh (Streptomicin 200 μg/mL, rifampicin 34 μg/mL và kanamycin 100 μg/mL).
Bước 9: Các đĩa petri được ủ ở 28
o
C trong vòng 2 ngày. Kiểm tra sự hình thành khuẩn
lạc
Bước 10: Dùng tăm nhọn đã được hấp khử trùng lấy một ít vi khuẩn ở mỗi khuẩn lạc rồi
thả vào trong ống nghiệm chứa 4 mL môi trường LB lỏng chứa 3 kháng sinh ở trên.
Bước 11: Các ống nghiệm được ủ 24 giờ trong tủ ấm có lắc (200 rpm / 28
o
C).
Bước 12: Kiểm tra đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn trong môi trường LB lỏng và kiểm
tra sự có mặt của cấu trúc xâm nhiễm trong vi khuẩn bằng PCR sau khi chiết DNA plasmid https://tailieu.xyz/

34

3.2.12.Xác định trình tự gen và xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng
Phản ứng sequence được chúng tôi gửi sang Macrogen (Hàn Quốc) để tiến hành giải trình
tự các mẫu.Sử dụng 5µl sản phẩm cộng với 5µl mồi.
Kết quả giải trình tự gen được phân tích trên máy tính bằng các phần mềm: Chương trình
BLAST ( NCBI ), BioEdit 7.0.9, DNAstar 7.1 (Lasergene), Vecter NTI Advance 11.5
(Invitrogene), ClustalX 2.0 và Mega 4.0., Sequencing Analysis 5.2, Seqscape 2.5 và so sánh với
trình tự của đoạn DNA với trình tự chuẩn.
3.2.9. Lây nhiễm nhân tạo sử dụng kỹ thuật agroinoculation
Sử dụng kỹ thuật tiêm trực tiếp dịch vi khuẩn vào cây (Kheyr-Pour et al., 1991; Navot et
al., 1991). Các bước thực hiện như sau :
Nuôi cấy dòng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm trong 200 ml môi trường LB lỏng chứa
3 loại kháng sinh (streptomicin 200 μg/mL, rifampicin 34 μg/mL và kanamycin 100 μg/mL)
trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm / 28°C/ 2 ngày). Ly tâm dịch vi khuẩn (3000G/ 5 phút ) rồi hòa
cặn vi khuẩn với 5 ml môi trường LB lỏng chứa 3 loại kháng sinh như trên. Dùng kim tiêm 18
gauge (đường kính 1.02362 mm) tiêm dịch vi khuẩn vào lá, chồi và 4 nách lá tiếp theo; mỗi vị
trí tiêm 10 µl. Trong các công thức lây nhiễm hỗn hợp, các dòng vi khuẩn sẽ được trộn với thể
tích tương đương.
Bảng 3.6:Thí nghiệm lây nhiễm được thực hiện với các công thức
STT CÔNG THỨC ĐỐI TƯỢNG
CT1 Tiêm dòng vi khuẩn có chứa cấu trúc xâm nhiễm của
VNP93-5-4 (DNA-A)
Cà chua
CT2 Tiêm dòng vi khuẩn có chứa cấu trúc xâm nhiễm của
VNP93-5-4 (DNA-A) và VNP93-5-8 (DNA-B)
Cà chua
CT3 Tiêm dòng vi khuẩn có chứa cấu trúc xâm nhiễm của
VNP93-5-4 (DNA-A)
ớt
CT4 Tiêm dòng vi khuẩn có chứa cấu trúc xâm nhiễm của
VNP93-5-4 (DNA-A) và VNP93-5-8 (DNA-B)
ớt
CT5 Cây đối chứng không tiêm Cà chua và ớt
https://tailieu.xyz/

35

3.2.10. Đánh giá tính gây bệnh
- Dựa vào triệu chứngcây bị bệnh có lá cong xuống dưới vào phía bên trong. Về sau, lá
không có hình dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chóp lá lan vào giữa gân; lá cuốn cong lên
phía trên thành hình thuyền; lá non biến vàng mạnh, giòn và nhỏ hẹp. Cuống lá có thể xoắn vặn.
Cây lùn còi cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ, đốt thân ngắn.
- Dựa vào phản ứng PCR để phát hiện sự có mặt của virus
Các phản ứng PCR được thực hiện trong tube 0.5 mL với tổng thể tích phản ứng 20 μL chứa 2.0
μL dung dịch đệm PCR X10 (Roche); 0.5 μL dNTPs (10mM mỗi loại A, T, G, C, Roche); 0.5
μL mỗi loại mồi đặc hiệu xuôi dòng và ngược dòng (đều đươc chuẩn bị ở nồng độ 20 μM); 0,5
μL Taq polymerase (Roche) và 0,5 μL khuôn DNA (DNA plasmid hoặc DNA chiết từ cây).
Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc.) với điều kiện sau:
khởi đầu biến tính ở 94
0
C trong 4 phút; tiếp theo là 35 chu trình PCR (biến tính ở 94
0
C trong 40
giây, gắn mồi ở 52
0
C trong 35 giây và tổng hợp sợi ở 72
0
C trong 1 phút 30 giây). Phản ứng được
kết thúc với 5 phút ở 72
0
C. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% đươc chuẩn bị bằng
đệm TAE X 0.5 và chứa 0.5 mg/mL ethidium bromide. Gel được chạy trên thiết bị điện di là
Mini-Sub Cell (Biorad) với đệm TAE 0.5X ở điện thế 100 V trong 25 - 30 phút. Bản gel được
kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại và được chup bằng phim Polaroid với máy ảnh Polaroid Gel
Cam (UK).
https://tailieu.xyz/

36

IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Nhân dòng và giải trình tự toàn bộ bộ gene của mẫu virus trên ớt
Trong năm 2013, Nguyễn Đức Anh (CNSH54B) đã phân lập được begomovirus chưa
từng được phát hiện ở Việt Nam gây hại trên cây ớt. Tác giả đã giải trình tự trực tiếp được một
phần bộ gen của virus này.
Vì danh tính và vị trí phân loại của begomovirus chỉ có thể được xác định chính xác dựa
trên toàn bộ trình tự của begomovirus nên mục tiêu của phần 4.1 của chúng tôi là giải trình tự
toàn bộ bộ gen củavirus này.

Hình 4.1. Triệu chứng của begomovirus gây hại trên ớt tại Đà Nẵng (mẫu VNP93) https://tailieu.xyz/

37

Chúng tôi tiến hành hồi phục lại nguồn E.coli chủng XL1 blue mang cấu trúc xâm nhiễm
của virus này được giữ ở -80
0
C. Sau đó tiến hành kiểm tra lại các clone bằng PCR và phản ứng
cắt.
4.2. Lây nhiễm nhân tạo Chilli Yellow Leaf Curl Virus (ChYLCV) nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation)
Mục đích và phương pháp:
Cà chua và ớt là những cây trồng quan trọng trong nền nông nghiệp hiện nay của nước ta.
Chilli yellow leaf curl virus là loài mới lần đầu tiên phát hiện ở Việt Nam và lần đầu tiên trên cây
ớt. Việc phát hiện ra loài này có ý nghĩa quan trong thực tiễn và khoa học.
Sau khi biến nạp thành công cấu trúc xâm nhiễm của Chilli Yellow Leaf Curl Virusvào vi
khuẩn Agrobacterium tumerfaciens thì chúng tôi tiến hành lây nhiễm nhân tạo nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation), từ đó có thể dễ dàng hơn trong việc đánh giá
tính gây bệnh, đặc trưng sinh học của virus này và có biện pháp phòng trừ phù hợp.
Các dòng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm bảo ở -80
0
C được phục hồi bằng cách cấy
trải trên môi trường LB agar chứa 3 loại kháng sinh (rifampicin – gen kháng nằm trên bộ gen vi
khuẩn A.tumerfaciens dòng LBA4404; streptomycin – gen kháng nằm trên Ti plasmid pAL4404
và kanamycin – gen kháng nằm trên vector nhị nguyên pCAMBIA-2300). Như vậy, về lý thuyết,
chỉ có tế bào vi khuẩn A. tumerfaciens dòng LBA4404 chứa Ti plasmid pAL4404 và các cấu trúc
xâm nhiễm mới có thể sống được trên môi trường chứa 3 loại kháng sinh trên. Sau khi các khuẩn
lạc đã mọc trên môi trường chúng tôi tiến hành nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ xung ba
loại kháng sinh trên ở nhiệt độ 37
0
C có lắc để nhân sinh khối vi khuẩn chuẩn bị cho lây nhiễm.
Dịch vi khuẩn thu được sau khi nuôi lỏng, lắc được mang đi li tâm lấy cặn vi khuẩn và
hòa tan cặn vi khuẩn bằng đệm MgCl2 cùng với 1 µl/ml acetonringone 0.1M giúp kích thích sự
phát triển của vi khuẩn trong tế bào ký chủ. Dịch vi khuẩn được sử dụng để lây nhiễm bằng cách
tiêm trực tiếp vào mô lá sử dụng kim tiêm 18 gauge (đường kính 1.02362mm). Các cây thí
nghiệm gồm cà chua HT7 và ớt sừng trâu đã được biết mẫn cảm với bệnh để thí nghiệm.
Kết quả thu được sau 15 ngày lây nhiễm:

4.3. Nghiên cứu begomovirus trên cà chua và ớt tại miền Trung và miền Nam Việt Nam. https://tailieu.xyz/

38

4.3.1. Begomovirs trên ớt tại miền Trung và miền Nam Việt Nam
4.3.1.1. Kết quả chuẩn đoán begomovirus trên ớt bằng phản ứng PCR
Mục đích:Chúng tôi tiến hành kiểm tra các mẫu ớt thu thập được tại miền Trung và miền
Nambằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi chung phát hiện begomovirus là BegoA-F1 và BegoA-
R1
Bảng 4.2: Các mẫu ớt ở miền Trung
STT Ký hiệu Địa điểm, khu vực thu mẫu Kết quả kiểm tra
Lần 1 Lần 2
1 VNP624 Túy Loan – Đà Nẵng + +
2 VNP626 Túy Loan – Đà Nẵng + +
3 VNP628 Túy Loan – Đà Nẵng + + (mờ)
4 VNP635 Điện Bàn – Quảng Nam + +
5 VNP722 Vinh – Nghệ An + +
6 VNP867 Túy Loan – Đà Nẵng - -
7 VNP868 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
8 VNP869 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
9 VNP870 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
10 VNP871 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
11 VNP872 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
12 VNP873 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
13 VNP874 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
14 VNP875 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
15 VNP876 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
16 VNP877 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
17 VNP878 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
18 VNP879 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
19 VNP880 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
20 VNP883 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
21 VNP884 Hòa Vang – Đà Nẵng - - https://tailieu.xyz/

39

22 VNP885 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
23 VNP886 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
24 VNP887 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
25 VNP888 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
26 VNP889 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
27 VNP890 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
28 VNP891 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
29 VNP892 Hòa Vang – Đà Nẵng - -
30 VNP907 Túy Loan – Đà Nẵng + +
31 VNP908 Túy Loan – Đà Nẵng - -
32 VNP909 Túy Loan – Đà Nẵng - -
33 VNP910 Túy Loan – Đà Nẵng - -
34 VNP911 Túy Loan – Đà Nẵng - -

Hình 4.1: kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi BegoA của các mẫu ớt ở miền Trung
Marker → VNP624→ VNP626→ VNP628 →VNP867→VNP635→ VNP722→ VNP907
(ladder: 1kb)

Bảng 4.3: Các mẫu ớt ở miền Nam
STT Ký hiệu Địa điểm, khu vực thu mẫu Kết quả kiểm tra https://tailieu.xyz/

40

Lần 1 Lần 2
1 VNP313 Châu Thành – An Giang + + (mờ)
2 VNP319 Châu Thành – An Giang + + (mờ)
3 VNP323 Châu Thành – An Giang + + (mờ)
4 VNP641 Phú Mỹ - Bình Định + +
5 VNP646 Phù Cát – Bình Định + + (mờ)
6 VNP650 Phù Cát – Bình Định + +
7 VNP673 Châu Thành – An Giang + +
8 VNP675 Cao Lãnh – Đồng Tháp + (mờ) +
9 VNP683 Thanh Bình – Đồng Tháp - -
10 VNP687 Thanh Bình – Đồng Tháp + + (mờ)
11 VNP701 Châu Thành – An Giang + +
12 VNP704 Châu Thành – An Giang - -
13 VNP717 Bình Thủy – Cần Thơ - -
14 VNP718 Ô Môn – Cần Thơ + +
15 VNP826 Đan Dương – Lâm Đồng - -
16 VNP827 Đan Dương – Lâm Đồng - -
17 VNP828 Đan Dương – Lâm Đồng - -
18 VNP829 Đan Dương – Lâm Đồng - -
19 VNP831 Đan Dương – Lâm Đồng - -
20 VNP854 Playku – Gia Lai - -
21 VNP855 Playku – Gia Lai - +
22 VNP856 Playku – Gia Lai - -

https://tailieu.xyz/

41

Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi begoA của các mẫu ớt miền Nam
M→ VNP650→ VNP683 →VNP675→ VNP704→ VNP831→ VNP854→ VNP673→
VNP717→ VNP718 (ladder 1kb)

Hình 4.3. Triệu chứng của begomovirus trên ớt tại Quảng Nam và Cần Thơ

4.3.1.2. Kết quả kiểm tra các mẫu ớt sử dụng các mồi đặc hiệu với một số loại
begomovirus được phát hiện tại VN tính đến năm 2013
Mục đích và phương pháp:
Chúng tôi tiến hành kiểm tra các mẫu trên sử dụng các mồi đặc hiệu của một số
begomovirus được phát hiện tại VN bao gồmToLCHnV (F1/R1); TB101(F1/R1); VB65 (F1/R1);
TY (F4/R4); To (F4/R4); To100 (F1/R1); TYKa-A (F1/R1)nhằm xác định những virus này có thuộc
một trong những virus đã được phát hiện tại Việt Nam hay không. Kết quả kiểm tra được trình
bày ở bảng 4.4.

Bảng 4.4: kết quả chạy với các mồi đặc hiệu
STT ID Khu vực thu
mẫu
Đối
tượng
TYKa-A
(F1/R1)
ToLCHnV
(F1/R2)
TB101
(F1/R1)
VB65
(F1/R1)
TY
(F4/R4)
To
(F4/R4)
To100
(F1/R1)
1 VNP313 An Giang ớt - - - - - - -
2 VNP319 An Giang ớt - - - - - - - https://tailieu.xyz/

42

3 VNP323 An Giang ớt - - - - - - -
4 VNP624 Đà Nẵng ớt - - - - - - -
5 VNP626 Đà Nẵng ớt - - - - - - -
6 VNP628 Đà Nẵng ớt - - - - - - -
7 VNP635 Quảng Nam ớt - - - - - - -
8 VNP641 Bình Định ớt - - - - - - -
9 VNP646 Bình Định ớt - - - - - - +
10 VNP650 Bình Định ớt - - - - - - -
11 VNP673 An Giang ớt - - - - - - -
12 VNP675 Đồng Tháp ớt - - - - - - -
13 VNP683 Đồng Tháp ớt - - - - - - -
14 VNP687 Đồng Tháp ớt - - - - - - -
15 VNP698 Đồng Tháp ớt - - - - - - -
16 VNP701 An Giang ớt + (mờ) - - - - - -
17 VNP704 An Giang ớt - - - - - - -
18 VNP717 Cần Thơ ớt - - - - - - -
19 VNP718 Cần Thơ ớt - - - - - - +
20 VNP722 Nghệ An ớt - - - - - - -
21 VNP842 Lâm Đồng ớt - - - - - - -
22 VNP855 Gia Lai ớt - - - - - - -
23 VNP907 Đà Nẵng ớt - - - - - - -

Từ kết quả trên kết luận hầu hết các virus này đều không phải thuộc những loài đã từng
được phát hiện trước đây. Chúng tôi đưa ra dự đoán những mẫu này có thể loài begomovirus
mới. Để xác định chính xác begomovirus trên tại Đà Nẵng (ChYLCV) có đúng là chủng
begomovirus gây hại trên ớt tại miền Trung và miền Nam hay không hay là một loài mới, chúng
tôi thiếtkế cặp mồi đặc hiệu phát hiện ChYLCV làVNP93A(F1/R1) và VNP93/97B (F1/R1) để
phát hiện loài virus mới này.
· Mồi xuôi VNP93-A-F: CATGCTAGTAATCCAGTGTATGC (996 -1018) https://tailieu.xyz/

43

· Mồi ngược VNP93-A-R: ATCTGCCAACGACGCATATGC (2194 -2215)
Kích thước sản phẩm: 1,2kb
· VNP93/97-B-F: GTGATTCATGTTATACGCCTTCG (1363 -1385)
· VNP93/97-B-R: TCAATCGCTCTGCCTTCTCTC (2610 -2622)
Kích thước sản phẩm 1,2kb

Bảng 4.5: Kết quả kiểm tra với mồi VNP93A và VNP93/97B

STT ID Khu vực thu mẫu Đối tượng VNP93A (F1/R1) VNP93/97B (F1/R1)
2 VNP313 An Giang ớt - -
3 VNP319 An Giang ớt - -
4 VNP323 An Giang ớt - -
8 VNP624 Đà Nẵng ớt - -
9 VNP626 Đà Nẵng ớt - -
10 VNP628 Đà Nẵng ớt - -
11 VNP635 Quảng Nam ớt + +
12 VNP641 Bình Định ớt - -
13 VNP646 Bình Định ớt - -
14 VNP650 Bình Định ớt + +
15 VNP673 An Giang ớt + +
16 VNP675 Đồng Tháp ớt + +
17 VNP683 Đồng Tháp ớt - -
18 VNP687 Đồng Tháp ớt - -
19 VNP698 Đồng Tháp ớt + +
20 VNP701 An Giang ớt - -
21 VNP704 An Giang ớt - -
22 VNP717 Cần Thơ ớt - -
23 VNP718 Cần Thơ ớt - -
24 VNP722 Nghệ An ớt - -
27 VNP842 Lâm Đồng ớt + -
Commented [daxg1]: Cho vào cái bảng nhé https://tailieu.xyz/

44

29 VNP855 Gia Lai ớt - -
37 VNP907 Đà Nẵng ớt - -

Hình 4.5: Kết quả điện di chạy PCR với mồi VNP93A
VNP635 → VNP650 → VNP673 → VNP675 → VNP698 → VNP842 → M (ladder 1kb)

Hình 4.6: kết quả điện di chạy PCR với mồi VNP93/97B
M → VNP635 → VNP650 → VNP673 → VNP675 → VNP698 → VNP842 (ladder 1kb)
Từ kết quả trên cho thấy các mẫuthu được tại Lâm Đông, An Giang, Đồng Tháp, Quảng
Nam, Bình Định dương tính với 2 cặp mồi phát hiện ChYLCV, chứng tỏ loài virus gây hại trên
ớt tại những địa phương trên là giống với loài virus gây hại trên ớt tại Đà Nẵng. Tuy nhiên có
mẫu VNP842 chỉ bắt cặp với mồi VNP93A mà không bắt cặp với mồi VNP93B, điều này đặt ra
câu hỏi về vài trò của 2 phân tử DNA-A và DNA-B của virus này trong quá trình biểu hiện triệu
chứng. Cả 6 mẫu này sẽ được chúng tôi nhân dòng và giải trình tự để đưa ra kết luận chính xác.

4.3.2. Begomovirs trên cà chua tại miền Trung và miền Nam Việt Nam
4.3.2.1. Kết quả chuẩn đoán begomovirus trên cà chua bằng phản ứng PCR https://tailieu.xyz/

45

Mục đích:Chúng tôi tiến hành kiểm tra các mẫu cà chua thu thập được tại miền Trung và
miền Nambằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi chung phát hiện begomovirus là BegoA-F1 và
BegoA-R1. Kết quả được trình bày ở bảng 4.6.

Bảng 4.6: Các mẫu cà chua thu được ở miền Trung
STT Ký hiệu Địa điểm, khu vực thu mẫu Kết quả kiểm tra
Lần 1 Lần 2
1 VNP436 Diễn Châu – Nghệ An + +
2 VNP441 Diễn Châu – Nghệ An - -
3 VNP725 Vinh – Nghệ An + + (mờ)
4 VNP727 Diễn Châu – Nghệ An + (mờ) +
5 VNP893 Diễn Châu – Nghệ An - +
6 VNP894 Diễn Châu – Nghệ An - -
7 VNP895 Diễn Châu – Nghệ An - -
8 VNP896 Diễn Châu – Nghệ An - -
9 VNP897 Diễn Châu – Nghệ An + +
10 VNP898 Diễn Châu – Nghệ An - -
11 VNP899 Diễn Châu – Nghệ An + +
12 VNO900 Diễn Châu – Nghệ An + +
13 VNP901 Diễn Châu – Nghệ An - -
14 VNP902 Diễn Châu – Nghệ An - -
15 VNP903 Diễn Châu – Nghệ An - -
16 VNP904 Diễn Châu – Nghệ An - -
17 VNP905 Diễn Châu – Nghệ An + +
18 VNP906 Diễn Châu – Nghệ An - -
https://tailieu.xyz/

46

Hình 4.7: Kết quả chạy điện di sản phẩm PCR với mồi BegoA các mẫu cà chua miền Trung
M→ VNP425→VNP725→ VNP727→ VNP441→ VNP896→ VNP899→VNP900→
VNP906→ VNP893→ VNP905 (ladder 1kb)

Bảng 4.7: Các mẫu cà chua thu ở miền Nam
STT Ký hiệu Địa điểm, khu vực thu mẫu Kết quả kiểm tra
Lần 1 Lần 2
1 VNP310 Long Xuyên – An Giang + +
2 VNP326 Long Xuyên – An Giang - -
3 VNP820 Đan Dương – Lâm Đồng - -
4 VNP821 Đan Dương – Lâm Đồng - -
5 VNP822 Đan Dương – Lâm Đồng + +
6 VNP823 Đan Dương – Lâm Đồng - -
7 VNP843 Buôn ma thuật – Đăk Lăk + +
8 VNP844 Buôn ma thuật – Đăk Lăk + +
9 VNP845 Buôn ma thuật – Đăk Lăk - -
10 VNP846 Buôn ma thuật – Đăk Lăk - -
11 VNP847 Buôn ma thuật – Đăk Lăk - -
12 VNP848 Buôn ma thuật – Đăk Lăk - -
13 VNP857 Playku – Gia Lai - -
14 VNP862 Playku – Gia Lai + +
15 VNP863 Playku – Gia Lai - -
16 VNP864 Playku – Gia Lai - - https://tailieu.xyz/

47

17 VNP865 Playku – Gia Lai - -
18 VNP866 Playku – Gia Lai - -

Hình 4.8: Kết quả chạy điện di sản phẩm PCR với mồi BegoA các mẫu cà chua miền Nam
M1→ VNP901→ VNP902→ VNP903→ VNP822→ VNP823→VNP843→VNP844→
VNP845→ VNP846→ VNP847→VNP848→ VNP857→ VNP863→ VNP864→ VNP865→
VNP866→ VNP821→ VNP310→ VNP326→ VNP862→ VNP820→ VNP895→VNP895→
VNP896→ M2 (ladder 1kb)
Phải có ảnh triệu chứng
4.3.1.2. Kết quả kiểm tra các mẫu cà chua sử dụng các mồi đặc hiệu với một số loại
begomovirus được phát hiện tại VN tính đến năm 2013
Mục đích và phương pháp:
Chúng tôi tiến hành kiểm tra các mẫu trên sử dụng các mồi đặc hiệu của một số
begomovirus được phát hiện tại VN bao gồm ToLCHnV (F1/R1); TB101(F1/R1); VB65 (F1/R1);
TY (F4/R4); To (F4/R4); To100 (F1/R1); TYKa-A (F1/R1)nhằm xác định những virus này có thuộc
một trong những virus đã được phát hiện tại Việt Nam hay không. Kết quả kiểm tra được trình
bày ở bảng 4.8.

Bảng 4.8: Kết quả kiểm tra các mẫu cà chua với các cặp mồi đặc hiệu https://tailieu.xyz/

48

STT ID Khu vực thu
mẫu
Đối
tượng
TYKa-A
(F1/R1)
ToLCHnV
(F1/R2)
TB101
(F1/R1)
VB65
(F1/R1)
TY
(F4/R4)
To
(F4/R4)
To100
(F1/R1)
1 VNP310 An Giang Cà chua - - - - - - +
2 VNP326 An Giang Cà chua - - - - - - -
3 VNP436 Nghệ An Cà chua - - - - - - -
4 VNP441 Nghệ An Cà chua - - - - - - -
5 VNP725 Nghệ An Cà chua - - - - - - -
6 VNP827 Nghệ An Cà chua - - - - - - -
7 VNP843 Đăk Lăk Cà chua + (rõ) - - - - - +
8 VNP857 Gia Lai Cà chua - - - - - - -
9 VNP862 Gia Lai Cà chua + (mờ) - - - - - -
10 VNP893 Nghệ An Cà chua - - - - - - -
11 VNP897 Nghệ An Cà chua - - - - - - -
12 VNP899 Nghệ An Cà chua - - - - - - -
13 VNP900 Nghệ An Cà chua - - - - - - -
14 VNP905 Nghệ An Cà chua - - - - - - -

4.3.2.2. Kết quả kiểm tra các mẫKiểm tra với mồi VNP93A (F1/R1) và VNP93B (F1/R1)
Sau đó chúng tôi cũng tiến hành kiểm tra các mẫu này với cặp mồi mới được thiết kế
Bảng 4.9: Kết quả PCA các mẫu cà chua với mồi VNP93A và VNP93/97B

STT ID Khu vực thu mẫu Đối tượng VNP93A (F1/R1) VNP93/97B (F1/R1)
1 VNP310 An Giang Cà chua - -
2 VNP326 An Giang Cà chua - -
3 VNP436 Nghệ An Cà chua - -
4 VNP441 Nghệ An Cà chua - -
5 VNP725 Nghệ An Cà chua + -
6 VNP827 Nghệ An Cà chua - -
7 VNP843 Đăk Lăk Cà chua - -
8 VNP857 Gia Lai Cà chua - -
Commented [daxg2]: Cho vào 1 bảng thôi, k cần nhiều
bảng thế này đâu https://tailieu.xyz/

49

9 VNP862 Gia Lai Cà chua + -
10 VNP893 Nghệ An Cà chua - -
11 VNP897 Nghệ An Cà chua + -
12 VNP899 Nghệ An Cà chua - -
13 VNP900 Nghệ An Cà chua - -
14 VNP905 Nghệ An Cà chua - -

Từ kết quả trên cho thấy một số mẫu cà chua bắt cặp với mồi VNP93A mà không bắt cặp với
mồi VNP93B. Số còn lại thì không bắt 2 cặp mồi này.

4.3.3. Nhân dòng và giải trình tự các mẫu virus trên ớt
4.2.3.1.Chuẩn bị vector pCAMBIA2300
Vector nhị nguyên được sử dụng để làm cấu trúc xâm nhiễm là vector pCAMBIA2300
được tạo ra bởi viện CAMBIA.pCAMBIA-2300 là vector cho chuyển gen thực vật và được sử
dụng tốt trong thí nghiệm agroinoculation.

Hình 4.9.Sơ đồ vector pCAMBIA2300 https://tailieu.xyz/

50

Vector pCAMBIA2300 dạng khô được bảo quản ở tủ -80
o
Cđược hòa loãng với nước và
biến nạp vào E.coli chủng XL1-Blue sử dụng phương pháp sốc nhiệt và được cấy trải trên môi
trường LB với tetracyline và kanamycine để chọc lọc các dòng mang cấu trúc xâm nhiễm.
Sau khi ủ 18h ở 37
o
C thì có 200 khuẩn lạc đơn mọc trên môi trường LB với đặc điểm đặc trưng
của E.coli ( màu trắng sữa, có viền bao quanh, bề mặt trơn).
Một số khuẩn lạc đơn được chuyển qua nuôi lắc trong ống nghiệm, mỗi ống nghiệm có
5ml môi trường LB lỏng chứa tetracyline và kanamycine, nuôi lắc 200 rpm. Sau đó plasmid sẽ
được tinh chiết bằng Purelink quick plasmid miniprep kit (Invitrogen), một lượng nhỏ sản phẩm
minipreps sẽ được kiểm tra bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu của vector pCAMBIA2300 là
mồi pCAMseqF1 và pCAMseqR.
Phản ứng PCR được thực hiện với điều kiện sau: khởi đầu biến tính ở 94
0
C trong 4 phút;
tiếp theo là 35 chu trình PCR (biến tính ở 94
0
C trong 40 giây, gắn mồi ở 50
0
C trong 35 giây và
tổng hợp sợi ở 72
0
C trong 1 phút 30 giây). Phản ứng được kết thúc với 5 phút ở 72
0
C.

Hình 4.10. Điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid sử dụng cặp mồi pCAMseqF1/R
Vector pCAMBIA2300 sau khi được tinh chiết và kiểm tra sẽ được mở vòng bằng enzyme
Bam HI sau đó desphosphoryl hóa bằng alkaline phosphase và được tinh sạch bằng Purelink PCR
purification kit (Invitrogen).
https://tailieu.xyz/

51

Hình 4.11: Điện di sản phẩm khi mở vòngpCAMBIA 2300 bằng BamHI
4.2.3.3. Phản ứng RCA nhân lên toàn bộ bộ gen của virus
Chúng tôi tiến hành phản ứng RCA được thực hiện với 6 mẫu VNP635, VNP650,
VNP673, VNP675, VNP698, VNP842 để nhân toàn bộ bộ gen của begomovirus dạng multimer
sau đó xử lý sản phẩm để thu sản phẩm 3kb.
Sau khi đã tối ưu hóa việc xử lý các sản phẩm RCA, chúng tôi tiến hành cắt hoàn toàn 6
mẫu trên với cả 3 loại enzyme là BamHI, PstI và E.coRI (kết quả thu được bảng 4.10, hình
4.12,hình 4.13 và hình 4.14):

Bảng 4.10: kích thước sản phẩm thu được sau khi cắt
STT ID Địa điểm thu mẫu Kết quả cắt bằng các RE
Bam HI E.co RI PstI
1 VNP 635 Đại An, Điện Bàn, Quảng Nam 2,7 2,7 2,7 ; 2,3 ; 0,7
2 VNP 650 Cát Lâm, Phù Cát, Bình Định 2,2 ; 0,7 2,7 2,7
3 VNP 673 Hòa An, Châu Thành, An Giang 2,7 2,3 ; 0,5 2,7
4 VNP 675 Hòa An, cao Lãnh, Đồng Tháp 2,7 2,3 ; 0,5 2,7
5 VNP 698

Ấp Tần Thuận, TT thanh Bình, Thanh
Bình, Đồng Tháp
2,7 2,3 ; 0,5 2,7
6 VNP 842 Thạch Mỹ, Lâm Đồng 2,7 2,3 ; 0,7 2,3 ; 0,5

Commented [daxg3]: Thí nghiệm tối ưu hóa đâu, cho vào
đây chứ https://tailieu.xyz/

52

Hình 4.12: Cắt hoàn toàn sản phẩm RCA bằng EcoRI
VNP842→ VNP635→ VNP650→ VNP673→ VNP675→ VNP698→ M (ladder 1kb)

Hình 4.13: Cắt hoàn toàn sản phẩm RCA bằng BamHI
M→ VNP635→ VNP650→ VNP673→ VNP675→ VNP698→ VNP842 (ladder 1kb)

Hình 4.14: Cắt hoàn toàn sản phẩm RCA bằng PstI
M→ VNP635→ VNP650→ VNP673→ VNP675→ VNP698→ VNP842 (ladder 1kb)
https://tailieu.xyz/

53

Từ kết quả cắt hoàn toàn 6 mẫu bởi 3 loại enzyme chúng tôi chọn sử dụng enzyme BamHI
để cắt hoàn toàn
4.3.2.2. Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào E.coli chủng XL1-Blue khả biến
Cắt lại 6 mẫu trên bằng BamHI thu băng ~3kb, sau đó thì băng 3kb được cắt ra khỏi
bản gel agarose và tinh chiết bằng Accuprep gel purification kit (Bioneer) sau đó được nối vào
vector pCAMBIA 2300 đã được mở vòng bằng enzyme T4 ligase (Fermentas).Sản phẩm nối sau
đó sẽ được biến nạp vào E.coli XL1-Blue khả biến.
Bảng 4.9: số clone thu được sau lần biến nạp đầu tiên
Mẫu Số clone thu được trong lần biến nạp
đầu tiên
VNP635 3
VNP650 2
VNP673 3
VNP675 1
VNP698 4
VNP842 5

Sau khi đã thu được các clone thì chúng tôi tiến hành kiểm tra liệu đã có genome của virus
được nối vào trong vector hay chưa.Có 2 phương pháp để kiểm tra đó là: Phản ứng PCR với cặp
mồi BegoAFor1 và BegoARev1 hoặc là phản ứng cắt kiểm tra sản phẩm nối sử dụng enzyme cắt
BamHI.
Tất cả khuẩn lạc đơn sẽ được nuôi lắc 200 rpm trong 5ml LB lỏng cộng với kanamycine
và tetracycline.Sau đó tinh chiết plasmid bằng phương pháp minipreps (Sambrook và cs.).Sau
khi thu được plasmid chúng tôi tiến hành kiểm tra cả 14 clones bằng cách cắt bằng enzyme Bam
HI để chắc chắn rằng có sản phẩm nối trong vector pCAMBIA2300.

Commented [daxg4]: Lý do chọn https://tailieu.xyz/

54

Bảng4.10 : Kiểm tra vector tái tổ hợp (miniprep) bằng BamHI
Mẫu biến nạp
Dòng
(clone)
Sản phẩm cắt bằng
BamHi
Kết luận sản phẩm nối
VPN635
635-1 4.5 Do nối cả dimer vào vector
635-2 4.5 Do nối cả dimer vào vector
635-3 5.0 Do nối cả dimer vào vector
VNP698
689-1 2.7 Do nối cả dimer vào vector
689-2 5.0 Do nối cả dimer vào vector
689-3 2.7 Đúng
689-4 - Do quá trình tinh chiết
VNP650
650-1 - Tự nối
650-2 - Nhiễm tạp/tinh chiết?
VNP673
673-1 - Tự nối
673-2 - Nhiễm tạp
673-3 - Nhiễm tạp/tinh chiết
VNP675 675-1 - Do quá trình tinh chiết
VNP842
842-1 2.7 Đúng
842-2 2.7 Đúng
842-3 2.7 Đúng
842-4 - Tự nối
842-5 - Tự nối

Hình 4.14: Hình ảnh điện di sản phẩm cắt bằng BamHI của một số clone thu được sau khi biến
nạp và XL1-Blue
M→ VNP635(1)→ VNP635(2)→ VNP635(3)→ VNP698(1)→ VNP698(2)→ VNP698(4) https://tailieu.xyz/

55

Hình 4.15: Điện di sản phẩm cắt một số clone thu được bằng BamHI
M→VNP650(1)→ VNP650(2)→ VNP673(1)→ VNP673(2)→ VNP673(3)→ VNP675(1)→
VNP698(3)→ VNP842(1)→ VNP842(2)→ VNP842(3)→ VNP842(4)→ VNP842(5)
Từ kết quả trên chúng tôi quyết định chọn 2 clone VNP698(3) và VNP842(1) để giải trình
tự nhằm định danh chính xác loài begomovirus trên 2 mẫu VNP689 và VNP842.
Bảng 4.11: Bảng các clone và mồi sequencing
STT Mã sequencing ID Clone Mồi
1
13D1ZAB039 VNP698 VNP-698-3 (A) pCAMBIASeqF
2
13D1ZAB040 VNP698 VNP-698-3 (A) pCAMBIASeqR
3
13D1ZAB041 VNP698 VNP-698-3 (A) VNP93-A-F
4
13D1ZAB042 VNP698 VNP-698-3 (A) VNP93-A-R
5
13D1ZAB043 VNP842 VNP-842-1 (A) pCAMBIASeqF
6
13D1ZAB044 VNP842 VNP-842-1 (A) pCAMBIASeqR
7
13D1ZAB045 VNP842 VNP-842-1 (A) VNP93-A-F
8
13D1ZAB046 VNP842 VNP-842-1 (A) VNP93-A-R

https://tailieu.xyz/

56

https://tailieu.xyz/

57

TÀI LIỆU THAM KHẢO
❖ TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Hà Viết Cường (2010), Bệnh cây. NXB Đại học Nông nghiệp.
2. Hà Viết Cường (2010), Công nghệ sinh học trong bệnh cây.
3. Hà Viết Cường (2010), Virus. NXB Đại học Nông nghiệp.
4. Vũ Triệu Mân (2003), Chẩn đoán nhanh bệnh hại thực vật, NXB Nông Nghiệp.
5. Vũ Triệu Mân – Lê Lương Tề chủ biên (2001). Giáo trình Bệnh cây Nông Nghiệp. NXB Nông
Nghiệp.
6. Lê Lương Tề, Vũ Triệu Mân (1999), Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng. NXB Giáo dục, Hà
Nội.
7. Nguyễn Thị Hà Uyên (2012). Xác định và đánh giá khả năng gây bệnh của một số
begomovirus trên cây cà chua bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo dùng vi khuẩn
Agrobacterium tumerfaciens.
8. Trần Ngọc Tiệp (2010). Xác định và đặc trưng phân tử của một số virus thuộc chi
Begomovirus (họ Geminiviridae). Báo cáo thực tập tốp nghiệp, chuyên ngành CNSH.
9. Nguyễn Đức Anh (2012) .Nghiên cứu Mungbean yellow mosaic virus (MYMV) trên đậu
xanh và begomovirus trên ớt tại miền Trung Việt Nam.

❖ TÀI LIỆU TIẾNG ANH
10. G. Argüello-Astorga and R. Ruiz-Medrano (2001). An iteron-related domain is associated
to Motif 1 in the replication proteins of geminiviruses: identification of potential interacting
amino acid-base pairs by a comparative approach. Archives of Virology 146(8): 1465.

11. R. Briddon, J. Brown, E. Moriones, J. Stanley, M. Zerbini, X. Zhou and C. Fauquet
(2008). Recommendations for the classification and nomenclature of the DNA-β satellites of
begomoviruses. Archives of virology 153(4): 763.

12. R. W. Briddon (2003). Cotton leaf curl disease, a multicomponent begomovirus complex.
Molecular Plant Pathology 4(6): 427.

13. S. Chakraborty, P. Pandey, M. Banerjee, G. Kalloo and C. Fauquet (2003). Tomato leaf
curl Gujarat virus, a new begomovirus species causing a severe leaf curl disease of tomato in
Varanasi, India. Phytopathology 93(12): 1485.

14. C. Fauquet, R. Briddon, J. Brown, E. Moriones, J. Stanley, M. Zerbini and X. Zhou
(2008). Geminivirus strain demarcation and nomenclature. Archives of virology 153(4): 783.

15. C. Fauquet and J. Stanley (2005). Revising the way we conceive and name viruses below
the species level: a review of geminivirus taxonomy calls for new standardized isolate
descriptors. Archives of virology 150(10): 2151. https://tailieu.xyz/

58

16. P. T. Ferreira, T. O. Lemos, T. Nagata and A. K. Inoue-Nagata (2008). One-step cloning
approach for construction of agroinfectious begomovirus clones. J Virol Methods 147(2):
351.

17. R. Fujii, M. Kitaoka and K. Hayashi (2006). Error-prone rolling circle amplification: the
simplest random mutagenesis protocol. Nature protocols 1(5): 2493.

18. Y. Gafni and B. L. Epel (2002). The role of host and viral proteins in intra-and inter-
cellular trafficking of geminiviruses. Physiological and Molecular Plant Pathology 60(5):
231.

19. M. Ghanim, S. Morin and H. Czosnek (2001). Rate of Tomato yellow leaf curl virus
translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia
tabaci. Phytopathology 91(2): 188.

20. (2001). Molecular characterization of begomoviruses associated with leafcurl diseases of
tomato in Bangladesh, Laos, Malaysia, Myanmar, and Vietnam. Plant Disease 85(12): 1286.

21. C. Ha, S. Coombs, P. Revill, R. Harding, M. Vu and J. Dale (2008). Molecular
characterization of begomoviruses and DNA satellites from Vietnam: additional evidence that
the New World geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation.
Journal of General Virology 89(1): 312.

22. C. V. Ha (2007). Detection and identification of potyviruses and geminiviruses in
Vietnam.

23. D. Haible, S. Kober and H. Jeske (2006). Rolling circle amplification revolutionizes
diagnosis and genomics of geminiviruses. J Virol Methods 135(1): 9.

24. B. Harrison, M. Swanson and D. Fargette (2002). Begomovirus coat protein: serology,
variation and functions. Physiological and molecular plant pathology 60(5): 257.

25. T. Hartz, G. Miyao, J. Mickler, M. Le Strange, S. Stoddard, J. Nunez and B. Aegerter
(1997). Processing tomato production in California, UCANR Publications.

26. A. K. Inoue-Nagata, L. C. Albuquerque, W. B. Rocha and T. Nagata (2004). A simple
method for cloning the complete begomovirus genome using the bacteriophage phi29 DNA
polymerase. J Virol Methods 116(2): 209.

27. D. R. Jones (2003). Plant viruses transmitted by whiteflies. European Journal of Plant
Pathology 109(3): 195.
https://tailieu.xyz/

59

28. D. Knierim and E. Maiss (2007). Application of Phi29 DNA polymerase in identification
and full-length clone inoculation of tomato yellow leaf curl Thailand virus and tobacco leaf
curl Thailand virus. Arch Virol 152(5): 941.

29. P. Markham, I. Bedford, S. Liu, D. Frolich, R. Rosell and J. Brown (1996). transmission
of geminiviruses by biotypes of Bemisia tabaci (Gennadius). Bemisia: 1995, taxonomy,
biology, damage, control and management.

30. E. Moriones, S. García-Andrés and J. Navas-Castillo (2007). Recombination in the
TYLCV complex: a mechanism to increase genetic diversity. Implications for plant resistance
development. Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Springer: 119.

31. E. Moriones and J. Navas-Castillo (2000). Tomato yellow leaf curl virus, an emerging
virus complex causing epidemics worldwide. Virus Research 71(1): 123.

32. M. Padidam, S. Sawyer and C. M. Fauquet (1999). Possible emergence of new
geminiviruses by frequent recombination. Virology 265(2): 218.

33. B. Picó, M. J. Díez and F. Nuez (1996). Viral diseases causing the greatest economic
losses to the tomato crop. II. The Tomato yellow leaf curl virus—a review. Scientia
Horticulturae 67(3): 151.

34. S. Ribeiro, A. Inoue‐Nagata, J. Daniels and A. DeÁvila (2006). Potato deforming mosaic
disease is caused by an isolate of Tomato yellow vein streak virus. Plant Pathology 55(4):
569.

35. E. Rybicki (1994). A phylogenetic and evolutionary justification for three genera of
Geminiviridae. Archives of Virology 139(1-2): 49.

36. K. Sarkar and K. Kulshreshtha (1978). Crotalaria striata DC. a new natural host of bean
common mosaic virus. Current Science 47(7).

37. R. Tice, E. Agurell, D. Anderson, B. Burlinson, A. Hartmann, H. Kobayashi, Y.
Miyamae, E. Rojas, J. Ryu and Y. Sasaki (2000). Single cell gel/comet assay: guidelines for
in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environmental and molecular mutagenesis
35(3): 206.

38. A. VARMA and V. Malathi (2003). Emerging geminivirus problems: a serious threat to
crop production. Annals of Applied Biology 142(2): 145.

39. C. Y. Wu, Y. C. Lai, N. S. Lin, Y. H. Hsu, H. T. Tsai, J. Y. Liao and C. C. Hu (2008). A
simplified method of constructing infectious clones of begomovirus employing limited
restriction enzyme digestion of products of rolling circle amplification. J Virol Methods
147(2): 355.
https://tailieu.xyz/

60

40. P. S. Wyant, D. Gotthardt, B. Schafer, B. Krenz and H. Jeske (2011). The genomes of
four novel begomoviruses and a new Sida micrantha mosaic virus strain from Bolivian weeds.
Arch Virol 156(2): 347.

41. H. Zhang, G. Hu and X. Zhou (2010). Molecular characterization of Tomato leaf curl
Hainan virus, a new begomovirus, and evidence for recombination. Journal of
Phytopathology 158(11‐12): 829.

❖ CÁC TRANG WEB
http://www.avrdc.org
http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html
http://wcrc.confex.com
http://www.informaworld.com
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
http://www.rothamsted.bbsrc.ac.uk

PHỤ LỤC https://tailieu.xyz/

61

Phụ lục 1: Các môi trường
• Môi trường LB-agar: Trypton (10 g/L), yest extract (5 g/L), NaCl (5 g/L) và agar (15 g/L).
Các thành phần được hòa trong nước cất và môi trường được hấp khử trùng ở 121
0
C trong 30
phút. Để môi trường nguội khoảng 55
0
C rồi rót vào đĩa petri đương kính 9 cm. Các kháng sinh
cần thiết được bổ sung trước khi rót môi trường ra đĩa petri.
• Môi trường LB lỏng: được chuẩn bị như đối với môi trường LB-agar nhưng thiếu agar.
Phụ lục 2:Các dung dịch gốc và đệm
• EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5 M, pH = 8. EDTA được hòa trong nước cất và
pH được chỉnh với NaOH tinh thể ( khoảng 2g / 100 mL). Dung dịch được hấp khử trùng ở 121
0
C
trong vòng 30 phút. Chú ý: EDTA sẽ không tan cho tới khi PH ≈ 8.
• Tris - HCl 1M, pH = 8. Hòa Tris base (Tris kiềm) trong nước cất và chỉnh pH bằng HCl đặc
(khoảng 4,2 mL /100 mL). Dung dịch được hấp khử trùng ở 121
0
C trong vòng 30 phút.
• SDS (sodium dodecyl sulfate) 20 %. Hòa SDS trong nước cất.
• NaOH 1 M. Hòa NaOH trong nước cất.
• TE, pH = 8. Tris-Cl 10 mM và EDTA 1 mM. Dung dịch đệm được chuẩn bị từ dung dịch
EDTA 0,5 M (pH = 8) và Tris-Cl 10 mM (pH = 8) được hấp khử trùng ở 121
0
C trong vòng 30
phút và bảo quản trong tủ lạnh thường
• TAE (X1): 10 mM Tris-acetate chứa 0.5 mM EDTA (pH = 7.8). Đệm đậm đặc (5X) được
chuẩn bị từ Tris base (24,2 g/L), acid acetic băng (5.71 mL/L) và EDTA 0.5 M pH = 8 (10 mL /
L). Đệm được hấp khử trùng ở 121
0
C trong vòng 30 phút và bảo quản trong tủ lạnh thường.
Đệm được sử dụng để chạy điện di gel agarose.

Phụ lục 3:Trình tự toàn bộ bộ gen của VNP93, VNP698, VNP842
>VNP93-A-cg https://tailieu.xyz/

62

ACCGGATGGCCGCGATTTTTTTTTAACGTGGTCCCCGCACGCATGCCCG TCCAATC
ACAGCCATTCCTCAAAGCTTATTT ATGCAGTGGTCCCCCTATATAACTTAGTCTCCA
AGTACCCACATCAAAA CATGTGGGATCCTTTACTAAACGAGTTTCCT GAAACCGTG
CATGGTTTTAGGTGTATGTTAGCTATTAAGTATTTGCAAC AAGTAGAAAATACATA
CTCTCCCGATACATT AGGCTACGACCTAATACGTGATCTCATCTTGGTGATTCGTGC
TAGGGATTATGGCGAAGCGTCCCGCAGATATAGTCATT TCCACACCCGCCTCGAAG
GTTCGTCGCCGTCTGAACTTCGACAGCCCAT ATCTCAGCCGTGTTGCTGCCCCCACT
GTCCTCGTCACAAACAAAAAGAGGTCATGGGCCAATCGGCCCATGTACAGAAAG C
CCAGGATATACAGGATGTACAAAAGCCCTG ATGTTCCTCGGGGGTGTGAAGGCCC
ATGTAAGGTCCAGTCCTATGAACAACGGCATGATGTAGCCCATGTAGGTAAGGTA
ATATGTGTCTCTGATGTCACTCGAGGTAATGGGCTGACACATCGTGTTG GTAAGAG
GTTCTGTATCAAGTCTGTCTATGT ACTGGGCAAAATCTGGATGGATGAGAATATTA
AGACGAAGAACCATACC AATACTGTCATGTTCTTTTTAGTTCGTGATA GGAGACCA
TTTGGCACGCCACAGGATTTTGGTCAAGTGTTCAACATGTA TGATAATGAGCCCAG
TACTGCCACTGTGAAG AACGACAACAGAGATCGATTCCAAGTTCTTCGTCGTTTTC
AGGCAACTGTGACAGGTGGTCAATATGCAAGCAAGGAACA AGCCATAGTTAGGAA
ATTTATGAAGGTCAACAATCATGTGACCTACAAC CATCAAGAAGCTGCGAAGTAT
GACAATCACACGGAGAATGCTCTTTTATTGTATATGGCATGTACTCATGCTAGTAA
TCCAGTGTATGCGACCTTGAAGATCAGAATCTAT TTCTATGATTCAGTTCAAAATT
AATAAATATTAAATTTTATTATATCCG AAAGATGAGCATCAATTGTGCCCTCAAGT
ACATTGTACAATACATGTCGAATTGCCCGAATTACATTGTTGATACTAATCACT CCT
AAATGGTCTAAATACTTTATACATT GGTATTTAAATACTCGTAAGAAACGCGAGGT
CTGAGGACGTAAACGAGT CCAGATTTGGCAGATTAGGTAGCATTGGTGT AGTCCCA
ACACTCTCCTCAGGTTGTAGTTGAACTGGATCTGTACTGTGA TGATGTCGTGGTTCA
TCATGAATGGTCTCTC GCGGTGGTGGGTTATTTTGAAATATAGGGGATTGTTGACC
ATCCAGATATATACGCCATTCTCTG CCTGAGCTGCAGTGA TGCGTTCCCCTGTGCGT
GAATCCATGGTTGTGGCAACCTAGAGCGACGA AATACGAACAACCACAAGGGAGA
TCAACTCTTCTCCTTCTATTGGTCTTCTTGGCGATTCGGTGTTGCACCTTGATAGGT
ACCTGAGTAGAGTGGGCCTTGGAGGGTGATGAAGATTGCATTCTTCACAGCCCAAT
TTTTAAGTGCGGTGTTCTTTTCTTCCTGCAAGAACTCTTTATAACTGGAATGTGG https://tailieu.xyz/

63

TCCTGGATTGCAGAGGAAGATAGTGGGAATTCCCCCTTTAATTTGAACT GGTCGCC
CGTACTTGGTGTTGCTTTGCCAGT CTCTTTGGGCCCCCATAAACTCTTTAAAGTGCT
TTAAGTAATGCGGATC GACGTCATCAATGACGTTATACCAAGCAGCA TTACTGTAC
ACTTTTGGACTTAAGTCTAAATGACCACATAAGTAGTTAT GTGGTCCCAATGATCT
GGCCCACATTGTCTT CCCCGTACGACTACCGCCCTCTACCACTATGCTTATCGGTCT
TATTGGCCGCGCAGCGGCAGCACTCACATTCGCAGAAA CCCACTCTTCAAGTTCTT
CTGGAACTTGATCGAAAGAAGAAGACAAAAA AGGACAAACAAAAACCTCTAAAG
GAGGTGTAAAAATCCTATCTAAATTACTACTTAAATTATGAAACTGTAAAACAAAA
TCTTTGGGAGCCTTCTCCTTTAATATATTGAG GGCCGCTGCTTTGGACCCTGAATTG
ATTGCCTCGGCATATGCGTCGTTGGCAGATCGGCAACCTCCTCTAGCTGATCTTC
CATCGATCTGGAAAACTCCATGATCAAGCACGTCTCCGTCTTTTTCCAT GTATGCTT
TAACATCTGAAGAGCTCTTAGCT CCCTGAATGTTCGGATGGAAATGTGCTGACCTG
CTTGGAGAGTTGAGAT CGAAGAATCGGTTGTTTTGGCACTTGAATTT GCCTTCGAA
CTGGATGAGGACATGCAGGTGAGGAGACCCATCTTCGTGT AGCTCCCTGCAAATAC
GTATGAATAATTTAT TAGTCGGGGTTGATAAGCCTGAGATTTGGGAAAGTGCCTCT
TCTTTAGTAAGGGAGCAGTGTGGATAAGTGAGGAAATAA TTCTTGGCATTTATTAA
AAATTTTCTGGGCGGAGGCATATTGACTGGTC AATCAGGTCCTCTCAAACTTGGCT
ATGCAATCGGGGAATGGGTCCTTACTTATAGTTGAGGACCTAAATGGCATTATTGT
AATTTCTTAAAGAAATTCAAATTCCAAAAGC GGCCATCCGTATAATATT

>VNP93-B-cg
ACCGGATGGCCGCGATTTTTTTTTAACGTGGTCCCCGCACGCGTTTGTGACATTTTC
CTCATTTTGAACAATCGCATCCATTGAATCTGAACACGTGTTACGATCTTAAGGCA
GGAATGTTTCCATGTCTGTTTCTATATATTTGTCCTATGTATTTCCTCACTCATTTGT
AACTAAAAATGAGAGTTCCAATCCGGAGGATTTCAGGCTTCAATTCTGACCGTCGT
CCTTTCAATGGCTCAATCCACCGTTGGAA CTACCCATATTCCAGCTATTTTGGGAG
GAGGATTGGCAACCGTGTATACGGCATGCCATTCGGAAACCAACAAGGTCAACGA
CGTGAGTGTAAGCAAACTCAACGTCTTACCAAGACTGTTGAGCAAGTTGCATCTAG
GAGGAAGTGTATGAAGACGGTTGAGGAAATTCATGATGGTACTGACTACTTGCTGThttps://tailieu.xyz/

64

GCAGTAACACGTCTAAGGTGTCGTACATTAGCTACCCGCCTCTATCCGGCACTGAA
TATGGTAGCAGAGCGGAATCCTATATCAAAGTCTTGGGAGTCACTGTATCTGGGTC
TGCGGTGCTGAAGCAGACAGGCATGCGTGAAGCAGATGGGTCTCAAGGAATTCAT
GGGATATTTACCACAGTAATCGTTCGTGACAAGAGACCATGTCAGTTCTCTGCCGT
GGATCCTATTATCCCACTTGCGGAGCTGTTTGG ACAAGAGAAGAGAGCATGCTCCT
CATTACGTGTTAGAGAGTCTTATAAGAATCGATTTAGTGTTGTCTACCAGAAGAAA
CATGTAGTAAATAGTGCTCTGTCAACACATGTATTTAGGTATAATTTCAACGTTAA
ATTCTCTAGGTTTCCTTTCTGGGTATCTTTCAAAGACACCTGTAACGCAGATCCTAC
GGGGCGATATTCCAATGTCTCTAAGAACGCATTGATTGTGTATTACGTGTGGCTAT
GTGATTCAAATGTAACAGCCGAAGTGCACGTACAATATGATTTGAACTACATTGGA
TAAATAAAATTATATTTTTTTTACATTTGAGGATACATTACTCCCCTCCATACATAG
TTCAACAGTTTTTTTAATAATATTAATTACATCTTCATTCACTTTGTTGCTACCTGCA
ATAACCTCTGACGCCGAAGGGCCTGGATCTAGAGTTGCATCTTGTAGCTGATGCAA
ATGTCTATATGGGTGCTCTTCCATTTCATTGTTCCCC ACGGTGCTGGCCGAAGCCCA
AGTAAGCCCTTGTGGAATGGCATTTGTAGTGTATCTGGAAGACTGTGACCTCATTT
GTGTTAGGGCTTGCACTGGTTTTCGTGATACAGTTGATTGAGGCACATGCCAGAAA
TCGATGTGATTCATGTTATACGCCTTCGATAGTATTTCAATCTTAGGGGACTTAAAT
GTTATTTCCGAGGACTGTTTTGCAGAGGACATTTTTAACTTTCCTTGCATCCTGCAG
AAGTGAACAC CATTGATCACGTTAGTGTCGTCCACCCGGTACAGCACCCTCCATGG
GTTTGGGTCTTTGGGGGAGAAGTATGAGGATGAGTAGTAGTGTATATTGCAGTTGC
ACCCTATGGGTATTGTGAACTCAGCCTGCTTGGAGTCCCCTTCGAGCAACCTTGTG
TCGTGCATCTCTATGACCACATGGCCAGTTGCATTTCCAGGAACTTGGTTCCTGTAT
TGGAGGATTACGTGGTCAATCCTGAGACACTTTCCTAAAAG CATCGATAATTTTTG
GTCGACAGTTGATGGAAACAACAGAGTTACCTCTGTCTTTTCATTTGACAGCTGAA
ACTCAGTCCTAGCCGACGTCGTATAGGCAATATTGTTATTGCTGGATTCCATTATTG
AGTAAGCCATTAAAATAATAGTAATTCATCTTTTATAGACTTTTCAGAGTCTGTCA
GGATAGTGGAATGTGACTATTTGGGTCGTTGCCTTTAAATTCCACTATCTCAAAGC
ACCAGTGAGCGAAGTC CACGTATGTACTTGTACTGACAAGAGATAAGGTATATACT
TGGATGTGGTTCAGCCACGTCGCATAGTCGAAAATGGAAGACATCTGTCTTCCACT
AAATATTTTTGATATGTTTCGAAGTGTATTAATTTAATTAACAAGTAAATTAAACGThttps://tailieu.xyz/

65

TAGAAATAAATATATGTACTTCAGTACCACAAGTTAGGCGCTAATCTGGACAAGAT
ATTTGGCTCACCGAAAGAATTATTGGTTAAGCCTTATGAGTTGTCGTGTAATCGAC
AACCTAAACTAATATTTAACTGATCCAACAATCTAATTATGAGAAAACACACACAC
TTGAACATACTAATCTTGAGAAAATCAGGCCGCGCAGCGGCTATGTCCCCAAATTA
TTAAGTAATCCAGAAGTGCGAACCCCAATTTA TTATATTCAAATCGAAAAGGACTT
ATATGTAATCTGTATCAGTTGAAGGTATTTAGTAGCTGTAGCTAATATTATTAAAG
TTAACAACATTAATGCAATATAATTATTGCATATTTGAAGAAAATAGGGTGAATTA
AAGTTTTAGAGAGAGAAAGTCTAGAGAGAAGGCAGAGCGATTGACCAGTCAATTA
GGTCCTCTCAAACTTGGCTATGCAATCGGGGAATGGGTCCTTACTTATAGTTGAGG
ACCTAAATGGCATTATTGTAATTTCTTAAAGAAATTCAAATTCCAAAAGCGGCCAT
CCGTATAATATT
>VNP698-A-cg
ACCGGATGGCCGCGATTTTTTTTCAAGTGGTCCCCGCACGCATGCCTGT CCAATCCT
GGCCACTCCTCAAAGCTTAATTA TTTATGTGGTCCCCTATATAACTTAGTCTCCAAG
TACCCACATCAAAACATGTGGGATCCTTTACTAAACGAGT TTCCTGAAACCGTACA
TGGTTTTAGGTGTATGTTAGCTATTAAGTATTTGCAAGT AGTAGAAAATACATACT
CTCCCGATACACTA GGCTACGATCTAATACGTGATCTTATCCTGGTGATTCGTGCTA
GGGATTATGGCGAAGCGTCCCGCAGATATAGTCATTT CCACTCCCGCCTCGAAGGT
TCGTCGCCGTCTGAACTTCGACAGCCCATATCTCAGCCGTGCTGCTGCCCCCACTGT
CCTCGTCACAAACAAAAAGAGGTCGTGGGCCAATCGGCCCATGTACAGAAAGC CC
AGGATATACAGGATGTACAAAAGCCCTGA TGTTCCGCGGGGCTGTGAAGGCCCAT
GTAAGGTCCAGTCCTATGAACAACGTCATGACGTAGCCCATGTAGGTAAGGTAA
TTTGTGTTTCAGATGTCACCCGAGGTAATGGGCTCACACATCGTGTTGG TAAGAGG
TTCTGTATCAAGTCCGTGTATGTG TTGGGCAAAATCTGGATGGATGAGAATATCAA
GACAAAGAACCATACTA ATACGGTCATGTTCTTCTTAGTTCGTGATAG GAGACCAT
TTGGCACGCCACAGGATTTTGGGCAGGTGTTCAACATGTAT GATAATGAGCCTAGT
ACTGCCACTGTGAAGA ACGACAATAGAGATCGATTCCAAGTCCTTCGTCGTTTTCA
GGCAACTGTGACAGGTGGTCAATATGCAAGCAAGGAGCAA GCCATAGTTAGGAAA
TTCATGAAGGTGAACAACCATGTGACCTACAACC ATCAAGAAGCTGCGAAGTATGhttps://tailieu.xyz/

66

ACAACCACACGGAGAATGCCCTTTTATTGTATATGGCATGTACGCATGCCAGTAAT
CCAGTGTATGCGACCTTGAAGATCAGAATCTATT TCTATGATTCGGTTCAAAATTA
ATAAATATTGAATTTTATTATATCCGA AAGATGAGCATCTATTGTGCCCTCAAGTA
CATTGTACAATACATGTCTAATTGCTCTAATAACATTGTTGATGCTAATAA CTCCTA
AACGGTCTAAATACTTTATACATTG GTATCTAAATACTCTTAAGAAACGCAAGGTC
TGAGGACGTAAACGAGTC CAGATTTGGCAGATTAGAT GTCCCAACGCTTTCCTCAG
GTTGTAGTTGAACCGGATCTGCACTGTGAT TATGTCGTGGTTCATCATGAATGGTCT
CTCGCGGTGGTGGGTTATGTTGAAATAGAGGGGATTGTTGACCGTCCAGATATACA
CGCCATTCTCTGCCTGAGCTGCAGTGAT GCGTTCCCCTGTGCGTGAATCCATGGTTG
TGGCAACCTAGAGCGACGAA GTACGAACAACCACAAGGGAGATCAATTCTT CTCC
TTCTATTGGTCTTCTTGGCGATTCGGTGTTGCACCTTGATTGGTA CCTGAGTAGAGT
GGGCCTTGGAGGGTGACGA AGATTGCATTCTTTAAAGCCCAATGTTTTAGTGCGGT
GTTCTTTTCCTCTTCCAAGAACTCTTTATAGCTG GAATGTGGTCCTGGATTGCAGAG
GAAGATAGTTGGAATCCCGCCTTTAATTTGGACCG GTTTCCCGTACTTGGTGTTGCT
TTGCCAGTCTCTTTGGGCCCCCATGAACTCTTTAAAGTGCTTTAGATAATGCGGATC
GACGTCATCAATGACGTTATACCAAGCAGCAT TATTGAACACTTTAGGACTTAAGT
CTAAATGCCCACATAAGTAGTTATGTGGGCCCAACGACCTGGCCCACATTGTCTTC
CCTGTACGACTATCGCCCTCTAACACAATGCTTATCGGTCTTAATGGCCGCGCAGC
GGCACTAACAACGTTTCCGGCAACCCATTCATCAAGTTCCTCGGGAACTTGGTCAA
AAGAAGAAGACGAAAAAGGACAAACAAAAACCTCTAAAGGAGGTGCAAAAATCC
TATCTAAATTACTATGTAAATTATGAAACTGTAAAACAAAATC TTTGGGGGCCTTC
TCCTTTAATATATTGAGG GCCTCTGCTTTGGACCCTGAATTGATTGCCTCGGCATAT
GCGTCGTTGGCAGATCGGCAACCTCCTCTAGCTGATCTGCC ATCGATCTGGAAAAC
TCCATGATCAAGCACGTCTCCGTCTTTCTCCATG TATGCTTTAACATCTGAAGAGCT
CTTAGCTCCCTGAATGTTTGGATGGAAATGTGCTGACCTGGTTGGGGATCTGAGGT
CGAAGAACCTTTGATTTTTGCATTGGAATTTA CCTTGGAATTGGATGAGGACATGC
AAGTGAGGAGTCCCATCTTCGTGCAATTCCCTGCAAATCCTGATAAACAGTTTATT
TGTTGGTGTTTCTATGGCTTGAATTTGGGAAAGGGCCTCTTCTTTTGTG AGAGAGCA
GTGTGGGTATGTGAGGAAATAGT TTTTAGCATTTATTCTGAATTTGTTTGGAGGAG
CCATTGACCGGTCAAT CGGTGTCTCTCAACTTGGGCTATGTAATTGG TGTCTGGGGhttps://tailieu.xyz/

67

TCTTATTTATATGGAGACCCTAAATGGCATTATTGTAATT TCTTAAAGAAATTCAAA
TTCCAAAAGCGGCC ATCCGTATAATATT

>VNP842
ACCGGATGGCCGCGATTTTTTTTACATGGTCCCCACCACTAACAAATGT TCTCCACT
TAGAACGCTCCCTCAAAGCCTAT TTAATTCAAATCCATTATATATACTTGGTCCCCA
AGTACTCACTTTAAA ATATGTGGGATCCTTTACTGAATGAGTTTCC CGAAACCGTA
CACGGTTTTAGGTGTATGTTAGCGATTAAATATTTGCAA TTAGTAGAAAATACATA
CTCTCCTGATACAT TAGGGTACGATTTGCTTCGTGATTTAATTTCAGTTATTCGTGC
TAAGGACTATGTCGAAGCGTCCCGCAGATATAGTCAT TTCCACTCCCGCATCCAAG
GTGCGTCGCCGGCTGAATTTCGACAGCCCG TATGCCAGCCGTGCTGCTGCCCCCAC
TGTCCTCGTCACAAACAAAAGGAGGTCATGGGTGAATCGGCCCATGTACCGAAA G
CCCAGGATGTACAGAATGTACAAAAGCCCT GATGTTCCTCGAGGATGTGAAGGCC
CATGTAAGGTTCAGTCCTATGAACAGCGTCATGATGTAGCGCACGTAGGTAAAGT
CATTTGTGTGTCTGATGTTACTCGTGGTAACGGGTTGACTCATCGAGTG GGAAAGA
GGTTTTGTGTTAAGTCTGTTTATG TTTTGGGCAAGATATGGATGGATGAGAACATT
AAGACCAAGAATCACACTAATA CTGTGATGTTTTTTTTAGTGCGTGAT AGGAGACC
ATTTGGGACTCCACAGGATTTTGGTCAGGTGTTTAACATGTATGATAACGAGCCAA
GTACAGCCACGGTGAAGAACGACAACAGAGATCGCTTTCAAGTTCTACGGCGTTTT
CAGGCTACTGTTACTGGTGGTCAGTATGCAAGTAAGGAGCAAGCAATAGTTAGGA
AGTTTATGAAGGTGAACAACCATGTGACGTATAATCATCAAGAAGCTGCGAA GTA
TGACAATCACACAGAGAATGCTCTTTTGTTGTATATGGCATGTACTCATGCTAGTA
ATCCTGTGTATGCTACTTTGAAAATCAGAATCTA TTTCTATGATTCTGTTCAGAATT
AATAAAGATTGAATTTTATTATATTTGAATGTGTTACATATTCTGTTTTTTCCAATA
CATCCCATAATACATGATCACATGCTCTAATTACATTGTTAATACTAAT TACACCCA
AATTATCTAAATATTTCATACAT TGAACCCTAAATACTCTTAAGAAACGCCAAGTC
TGAGGACGTAAACGAG TCCAGATCTGGAAGATTAGAAAACATTGGTG TATTCCCA
ACGCTTTCCTCAGGTTGTAATTGAATTGGACTTGTATTGTG ATGATGTCGTTGTTCA
TCAGAAATGGTCTCT CGTCGTGGCTGATTATCTTGAAATATAGGGGATTTTTGACChttps://tailieu.xyz/

68

GTCCAGATATATACGCCACTCTCTGCTTGAGTTGCAGTG ATAGCTTCCCCTGTGCG
AGAATCCATGATTGTGACAGCCTAGTGCAATG AAGTATGAACAACCACAAGGGAG
ATCAACTCTCCGTCTCCTCGTTGCTTTCTTGGCGTTGCGGTGTTGCACTTTGATAGG
AACCTGAGTAGAGTGCGCCTTGGAGGGTGAC GAAGATCGCATTTTTTATTGCCCAG
TTTTTAAGTGCGCTGTTTTTATCTTCGTCCAAGAATTCTTTATAGCTTGAATTGG
GGCCGGGATTGCAGAGGAAGATAGTGGGAATTCCCCCTTTAATTTGAAC GGGTTTT
CCGTACTTTGTGTTGCTTTGCCAG TCCCTTTGGGCCCCCATGAATTCTTTAAAATGC
TTTAGGTAGTGCGGAT CAACGTCATCAATGACGTTGTACCAGGCATC ATTATTGTA
TACCTTCGGACTCAAATCAAGATGACCACACAAATAATTA TGTGGTCCTAATGACC
TAGCCCACATCGTCT TTCCCGTCCGACTATCGCCTTCGATAACTATACTTATCGGTC
TTAAAGGCCGCGCAGCGGCACTGACAACGTTCTCTGCA GCCCACTCTTCGAGTTCC
TCTGGAACTCGATCAAACGAAGAAGAAGAAA AAGGCGAAACATAAACCTCCATTG
GAGGAGTAAAAATCCTATCTAAATTATTATTTAAATTATGAAACTGTAAAACATAA
TCTTTAGGTGCCTTTTCCCTTAGTATATTGA GGGCCGAAGCTTTGGACCCTGAATTG
ATTGCCTCGGCATATGCGTCGTTGGCAGATTGGCAACCTCCTCTAGCCGATCTT
CCATCGATCTGGAAAAGTCCATGATCAAGCACGTCTCCGTCTTTGTCCA TATAGGA
CTTGACATCTGTTGAGCTTTTAGC TGCCTGAATGTTCGGATGGAAATGTGCTGACCT
GCTTGGGGATATGAGATCGAAGAATCTTTGGT TTTTACATTGGAATT TCCCTTCGA
ATTGGATGAGAACATGCAGGTGAGGAGTTCCATCTTCGTGGAATTCTCTGCAGATG
CGGATAAATAGTTTATTTACTGGGGTTTCTAGGTTTTTAAGTTGGGAAAGTGCTTCT
TCTTTAGTGAGAGAGCAGTGTGGATATGTGAGGAAATA ATTTTTGGCATTTATTCT
GAATTTATTAGGAGGAGCCATTGACTGGTCAATCGGTGTCTCATAAACTTGGCTAT
GCAATTGGTGTCTGGTGTCTTATTTATATGTGGACACCAAATGGCATTATCGTAA TT
CCCAAAAGAAATTCAAAATTCAAATTGGT AAAGCGGCCATCCGTATAATATT

https://tailieu.xyz/

Nghiên cứu begomovirus trên ớt và cà chua ở khu vực Miền Trung và Miền Nam Việt Nam

About This Presentation

Slide Content

Tags

Categories

Download

Quick Actions

Statistics

Related Slideshows

Nghiên cứu begomovirus trên ớt và cà chua ở khu vực Miền Trung và Miền Nam Việt Nam

About This Presentation

Slide Content

Slide 1

Slide 2

Slide 3

Slide 4

Slide 5

Slide 6

Slide 7

Slide 8

Slide 9

Slide 10

Slide 11

Slide 12

Slide 13

Slide 14

Slide 15

Slide 16

Slide 17

Slide 18

Slide 19

Slide 20

Slide 21

Slide 22

Slide 23

Slide 24

Slide 25

Slide 26

Slide 27

Slide 28

Slide 29

Slide 30

Slide 31

Slide 32

Slide 33

Slide 34

Slide 35

Slide 36

Slide 37

Slide 38

Slide 39

Slide 40

Slide 41

Slide 42

Slide 43

Slide 44

Slide 45

Slide 46

Slide 47

Slide 48

Slide 49

Slide 50

Slide 51

Slide 52

Slide 53

Slide 54

Slide 55

Slide 56

Slide 57

Slide 58

Slide 59

Slide 60

Slide 61

Slide 62

Slide 63

Slide 64

Slide 65

Slide 66

Slide 67

Slide 68

Tags

Categories

Download

Quick Actions

Statistics

Related Slideshows

Pray For The Peace Of Jerusalem and You Will Prosper

Don_t_Waste_Your_Life_God.....powerpoint

VILLASUR_FACTORS_TO_CONSIDER_IN_PLATING_SALAD_10-13.pdf