NGHIÊN CỨU ÁP DỤNG KỸ THUẬT ĐỌ CHÉO BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TẾ BÀO DÒNG CHẢY TRÊN BỆNH NHÂN GHÉP THẬN

NGHIÊN CỨU ÁP DỤNG KỸ THUẬT ĐỌ CHÉO BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TẾ BÀO DÒNG CHẢY TRÊN BỆNH NHÂN GHÉP THẬN

1. ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ÁP DỤNG KỸ THUẬT ĐỌ CHÉO BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TẾ BÀO DÒNG CHẢY TRÊN BỆNH NHÂN GHÉP THẬN   Chuyên ngành : Miễn dịch học Học viên : Lê Thị Ngọc Thư CH29

2. Đặt vấn đề

3. Tại Việt Nam, có khoảng 6 triệu người bị suy thận mạn ( chiếm 6,73% dân số ), trong đó 80.000 người đã chuyển sang giai đoạn cuối , có 90% bệnh nhân suy thận mạn tử vong do không được điều trị .

4. Tìm cách để khắc phục cứu vãn chức năng sinh lý của thận

5. Đọ chéo dòng tế bào

6. Mục tiêu việc Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật đọ chéo bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy trên bệnh nhân ghép thận 1. Thiết lập quy trình đọ chéo bằng phương pháp tế bào dòng chảy (FCXM). 2. Đánh giá kết quả đọ chéo bằng phương pháp phân tích bào dòng chảy FCXM trên bệnh nhân ghép thận tại bệnh viện quân y 103

7. Tổng quan đề tài 1.1. Tổng quan về ghép thận 1.2. Cơ sở miễn dịch học và cơ chế phản ứng Thải ghép 1.3. Biện pháp ngăn ngừa và kiểm soát phản ứng thải ghép 1.4. Kỹ thuật phân tích tế bào dòng chảy FCXM

8. Tổng quan ghép thận Ở Việt Nam, ghép thận bắt đầu từ năm 1992 Và từ năm 2010 đến 2015 cả nước đã ghép được 900 ca thận Tiêu chuẩn người cho thận phải đảm bảo được xét nghiệm hòa hợp mô tương đồng : nhóm máu ABO, Rh, phản ứng chéo , kháng nguyên hòa hợp mô của bạch cầu HLA đáp ứng yêu cầu ; thận của người cho có chức năng và hình thái bình thường , không bị các bệnh lý thận trong tiền sử hoặc hiện tại ; tiền sử gia đình không có bố mẹ đẻ , anh chị em ruột bị bệnh thận đa nang . 3 nguyên nhân thích hợp nhất cho ghép thận : viêm cầu thận mạn , bệnh thận do bệnh đái tháo đường , bệnh thận do tăng huyết áp . : ung thư hoặc huyết thanh HIV dương tính . Chống chỉ định tạm thời : bệnh lý ung thư , nhồi máu cơ tim , tai biến mạch máu não , nhiễm trùng cấp tính ; Bệnh lao đang tồn tại , nhiễm siêu vi (HIV, viêm gan siêu vi, CMV….) 

9. Cơ sở miễn dịch học ghép thận và cơ chế thải ghép Ghép tạng ? thủ thuật chuyển các tế bào , mô hoặc cơ quan từ một vị trí này sang một vị trí khác . Ghép tự thân ( autograft ) Ghép cùng gien ( isograft Ghép khác gien cùng loài (allograft Ghép khác loài ( xenograft PƯ thải ghép

10. Cơ chế thải ghép Thải ghép : là phản ứng của cơ thể nhận ghép chống lại các kháng nguyên có trên các tế bào nằm trong mảnh ghép . - Thải ghép tối cấp : diễn ra sớm sau ghép , thường là ngay sau phẫu thuật ghép - Thải ghép cấp : Thải ghép cấp là một phản ứng viêm đặc trưng bởi sự thâm nhiễm dày đặc các tế bào bạch cầu , chủ yếu là đại thực bào và tế bào lympho , cùng với tổn thương mao mạch máu trong mảnh ghép - Thải ghép mạn : Thải ghép mạn diễn ra ở thời điểm nhiều tháng cho đến nhiều năm sau ghép , sau khi đã xuất hiện các đợt thải ghép cấp

11. Đọ kháng nguyên Đọ chéo Sử dụng các biện pháp ức chế miễn dịch trên người nhận ghép Biện pháp ngăn ngừa và kiểm soát phản ứng thải ghép

12. Kỹ thuật đọ chéo bằng đếm tế bào dòng chảy FCXM trong ghép thận

13. Cơ chế Kháng nguyên là HLA Kháng thể kháng HLA Có gắn các hạt Phức hợp

14. Tế bào lympho người hiến + HT người nhận

15. CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Đối tượng 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Mẫu bệnh phẩm 2.2.2. Hóa chất và kháng thể 2.2.3. Xử lý tách tế bào bạch cầu đơn nhân máu ngoại vi (PBMCs) và huyết thanh 2.2.4. Tiến hành 12

16. Đối tượng Các cặp ghép tạng được bác sĩ tại bệnh viện Quân y 103 chỉ định . Huyết thanh mẫu chứng âm chuẩn : Lựa chọn mẫu đối chứng âm lấy máu trên đối tượng Nam có nhóm máu AB+; tiền sử chưa từng được truyền máu , không phát hiện thấy kháng thể kháng HLA lớp I/I , chưa ghép tạng . Tế bào bạch cầu lympho của khoảng trên 30 n gười khoẻ mạnh

17. Hóa chất và vật liệu nghiên cứu , kháng thể đĩa Terasaki , nước muối sinh lý , dung dịch PBS 1x (Sigma), albumin huyết thanh bò (BSA, Sigma). Kháng thể : Kháng thể kháng CD45 gắn PerCP , CD3 gắn FITC, CD19 gắn APC, kháng IgG người gắn PE và Kháng thể đồng dạng gắn PE ( Biolegends ).

18. Phương pháp nghiên cứu Xử lý tách bạch cầu và huyết thanh Các tế bào bạch cầu ngoại vi (PBMCs) được tách từ máu chống đông thông qua phương pháp tách tế bào theo tỷ trọng bằng Ficoll máu không chống đông của người hiến và người nhận tạng được giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ và ly tâm ở tốc độ 13000 g trong 20 phút . Khi ly tâm , hồng cầu và bạch cầu hạt lắng xuống đáy ống ly tâm , còn bạch cầu lympho và bạch cầu đơn nhân khác nằm ở trên lớp Ficoll

19. 2. Tách tế bào lympho T và B bằng kít MACsprep ( Miltenyi Biotec ) 2.1. Chuẩn bị hóa chất : Thu 4 ml máu chống đông EDTA của người hiến (donor). . Hoàn nguyên lọ beat đông khô bằng 1,25 ml dung dịch buffer A, pipet 4 lần để trộn hóa chất áp dụng cho kit tách tế bào T và B tạm ký hiệu là lọ T-bead và và B-bead. Chuẩn bị hai ống eppendort 1,5 ml để tách T&B, ghi nhãn “T” và “ B”. Đối với ống T cho 125 mcl dung dịch lọ T-Bead và 125 mcl dung dịch buffer B của bộ kit tách T. Đối với ống B cho 125 mcl dung dịch lọ B-bead và 125 mcl dung dịch buffer B của bộ kit tách B.

20. 2.2. Tiến hành Cho 500mcl thể tích máu toàn phần chống đông ( của người hiến ) vào ống “T”; 500mcl vào trong ống “B” đã chuẩn bị ở trên , lắc úp ngược 4 lần . Đặt cố định ống “T” và “B” trong máy quay Maxmix Tube Rotator, quay với tốc độ khoảng 12 vòng / phút , tại nhiệt độ phòng trong 15 phút . Đặt 2 ống “T”, “B” lên khay từ tính Macxpres Separator trong khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng . Để cố định 2 ống “T”, “B” tại khay từ và hút phần dịch nổi trong chứa tế bào từ 2 ống này sang các ống eppendort 1,5ml mới ghi nhãn “T+”, “B+”. Ống “T” hút khoảng 400mcl, ống “B” hút khoảng 300mcl. Khi hút để đầu pipet theo hướng tránh va chạm vào thành ống chứa hạt bead, hoặc tránh chạm đáy chứa tế bào hồng cầu - tiểu cầu . Đem ly tâm 2 ống “T+”, “B+”, tốc độ 2000 vòng trong 3 phút ở 4  C ( hoặc 25  C). Loại bỏ dịch nổi , hoàn nguyên bằng dung dịch nước muối sinh lý cho ống T là 75mcl, ống B là 30mcl. Lấy 10mcl thể tích ống T+ và 10mcl thể tích ống B+ chuyển sang làm đánh giá độ tinh sạch trên máy flow. Phần còn lại của 2 ống T+ và B+ được dùng làm cho phản ứng đọ chéo CDC thông thường .

21. Kết quả tách tế bào Lympho B,T sfs

22. Đọ chéo bằng kỹ thuật đếm tế bào FCXM 1. Chuẩn bị mẫu : - Ống 1- mẫu chứng âm chuẩn : huyết thanh của đối tượng Nam có nhóm máu AB+; tiền sử chưa từng được truyền máu , không phát hiện thấy kháng thể kháng HLA lớp I/I , chưa ghép tạng . - Ống 2 - Mẫu chứng âm : Là huyết thanh của người hiến tạng - Ống 3 - Mẫu thử : HT của người nhận tạng - Ống 4 - mẫu gate: giống mẫu thử . - Ống 5 - Mẫu chứng dương ( tự sản xuất hoặc gộp mẫu HT của người có nồng độ KT kháng HLA lớp I/II cao ).

23. Thực hiện Cho 30 mcl dung dịch tế bào PBMCs vào mỗi ống mẫu đã chuẩn bị trên , đặt trên khay đá . Tapping ống 3 lần ( hoặc pump bằng pipet 3 lần ), sau đó đặt trên khay đá , ủ trong 30 phút .

24. Chia ống ST làm 2 ống : ống thứ 1(25mcl) và ống thứ 2( phần còn lại ) - ống thứ 1, trộn thêm dung dịch isotype control-PE tỷ lệ isotype control-PE: gate stain =1:100, ghi tên ống gate statin ống thứ 2 trộn thêm dung dịch anti IgG -PE tỷ lệ antiIgG -PE: total stain = 1:100, ghi tên ống total stain ủ lạnh 2 ống trên trong khoảng 15-20 phút . (ủ trong phòng tối tránh ánh sáng phân hủy hạt huỳnh quang ).   Rửa lần 1: Thêm 1ml dung dịch PBS1x-BSA 0.5% vào 5 ống đã ủ HT + TB ở bước 1, tapping đều ( lắc úp ngược 3 lần ). Đem hỗn hợp này chạy ly tâm 1780 vòng / 3 phút ở nhiệt độ 4  C. Loại bỏ tối đa dịch nổi phía trên bằng cách hất nhẹ dịch trong ống , pum đều phần tế bào lympho lắng đọng dưới đáy ống . Đánh tên lại các ống sau ly tâm là 1’,2’,3’,4’,5’. Cho 25mcl dung dịch ống total stain lần lượt vào các ống 1’,2’,3’,5’. Cho 25mcl dung dịch ống gate stain vào ống 4’. Tapping các hỗn hợp trên 3-5 lần , ủ ở 4  C, trong khoảng 20 phút .

25. Rửa lần 2: Thêm 1ml dung dịch PBS1x-BSA 0.5% lần lượt vào 5 ống trên . Đem hỗn hợp này chạy ly tâm 1780 vòng / 3 phút ở nhiệt độ 4  C. Loại bỏ dịch nổi phía trên và pum đều phần tế bào lympho lắng đọng dưới đáy ống . Đánh tên lại các ống sau ly tâm là 1’’,2’’,3’’,4’’,5’’. Hoàn nguyên từng ống 1’’,2’’,3’’,4’’,5’’ về 150mcl bằng dung dịch PBS1x-BSA 0.5% Đọc kết quả trên máy Flow

26. Đọ chéo bằng phương pháp độc tế bào phụ thuộc bổ thể CDC ( làm song song với FCXM): Chuẩn bị dụng cụ : Dụng cụ được hấp sấy vô trùng , khay giếng Terasaki , nhựa sạch . Chuẩn bị hóa chất : picol P = 1,077, pH = 7,2 RPMI pH= 7,2 Đệm PBS, NaCl 9%, pH= 7,2. Bổ thể thỏ Dầu parafin để tráng giếng nhựa Dung dịch xanhtrypăng 0,4% Tiến hành : Sau khi tách tế bào lympho T,B đem ủ tế bào với các mẫu HT trên khay Terasaki . Cho 1mcl tế bào lympho người nhận và 1mcl huyết thanh người cho lần lượt vào các giếng theo sơ đồ

27. Đem khaygiếng ủ ấm 37  C trong 60 phút . Nhỏ 5mcl bổ thể vào các giếng1,2,4 và 9,10,12. ủ tiếp trong tủ ấm 37  C trong 60 phút . Vẩy sạch bổ thể và huyết thanh trong các giếng , còn lại đáy giếng là tế bào lympho T, B. Cho vào mỗi giếng 1mcl dung dịch xanhtrypang , ủ trong 10 phút . Đọc kết quả dưới kính hiển vi. Giếng chứng âm : tế bào sống đẹp , không bị bắt màu xanh của dung dịch nhuộm . Giếng mẫu thử : nếu thấy tế bào bắt màu xanh xẫm là tế bào chết . đếm tỉ lệ tế bào chết từ 11% trở lên là cho kết quả dương tính . Nếu thấy tế bào trắng sáng thì cho kết quả âm tính

28. Kết quả và bàn luận Tiến hành song song giữa CDC và FCXM

29. Trong số 30 cặp ghép có kết quả âm tính CDC, chúng tôi ghi nhận được giá trị MFI tín hiệu từ KT huỳnh quang kháng IgG bám trên tế bào B và T ( tức là chỉ số MFI-B và MFI-T) như sau :

30. Đối với 2 cặp ghép có kết quả CDC dương tính , giá trị MFI tín hiệu từ KT huỳnh quang kháng IgG bám trên tế bào B và T ( tức là chỉ số MFI-B và MFI-T) ghi nhận như sau

31. MCS = MFI ( Mẫu thử ) – MFI( Chứng âm chuẩn ) ngưỡng cut-off trong thí nghiệm này với tế bào lympho B âm tính là 50, tế bào lympho T âm tính là 199; với tế bào lympho B dương tính là 30 và tế bào lympho T dương tính là 2.

32. ở nhóm có kết quả CDC âm tính , có 96,67% (29/30) trường hợp có MCS-B nhỏ hơn 50 trong khi chỉ có 1 trường hợp chiếm 3,33% có giá trị MCS-B lớn hơn 50; với tế bào T thì cho kết quả 100 % (30/30) trường hợp MSB-T nhỏ hơn 199. Trong khi đó , ở nhóm có kết quả CDC dương tính thì tất cả MCS-B đều lớn hơn 30 và MCS-T đều lớn hơn 2.

33. Bàn luận