Pathogens in food by RT PCR_Biotecon_VN.pptx

Pathogens in food
Kit định tính Brucella
Kit định tính và định lượngCampylobacter .
LyoKit định tính Clostridium botulinum.
Kit định tính Enterobacteriaceae + Cronobacter .
Kit định tính E. coli and Shigella .
Kit định tính E. coli O157 .
LyoKit sàng lọc và xác định STEC.
Kit và LyoKit định tính Listeria monocytogenes.
Kit định tính Listeria

1. food proof ® ( Lyo )Kits định tính Salmonella Dr. Xiaoyun Lee 19. March 2019

2. food proof ® Pathogen Detection Kits/ Kit định tính VSV gây bệnh Kit định tính Brucella Kit định tính và định lượng C ampylobacter . LyoKit định tính Clostridium botulinum. Kit định tính Enterobacteriaceae + Cronobacter . Kit định tính E . coli a nd Shigella . Kit định tính E . coli O157 . LyoKit sàng lọc và xác định STEC. Kit và LyoKit định tính Listeria monocytogenes . Kit định tính Listeria . LyoKit và Kit định tính Salmonella . LyoKit định tính Salmonella Typhimurium & Enteritidis. Kit định tính Vibrio. Kit định tính Yersinia enterocolitica and pseudotubercul. Kit định tính Norovirus .... 2

3. 3 food proof ® Salmonella Detection Kit / LyoKit Bao gồm: > 700 chủng Salmonella (tất cả loài và chủng loài) Không bao gồm: > 60 chủng khá liên quan đến các loài vi sinh vật có cùng môi trường sống Độ nhạy : 1 – 10 cfu / 25g mẫu Nền mầu: > 100 nền mẫu thực phẩm (gia cầm, thịt, sữa, ca cao, môi trường, ...)

4. Tiêu chuẩn PCR của Đức 4 DIN 10135 P olymerase chain reaction (PCR ) là phương pháp để định tính vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm – phương pháp định tính Salmonella L 00.00-95 phương pháp PCR định tính Listeria monocytogenes trong thực phẩm . L 00.00-96 định tính Campylobacter jejuni và Campylobacter coli trong thực phẩm bằng phương pháp khuyeetch đại gen PCR L 00.00-112 định tính noroviruses của nhóm gen I và II trên bề mặt nhẵn , cứng trong thực phẩm bằng phương pháp real- time RT-PCR L 02.00-36 định tính rotavirus trong sản phẩm sữa bị chua sử dụng phương pháp real-time PCR L 07.18-1 định tính, phân lập và phát hiện độc tố sinh ra bởi Escherichia coli ( VTEC ) trong thịt bò bằng công nghệ PCR và lai tạo DNA.

5. food proof ® Kit định tính Salmonella 5 Bản thảo DIN 10135 và EU CEN được dựa trên phương pháp phân tích BIOTECON. Nguồn của các phương pháp chính thống:

6. Chứng nhận toàn cầu 16140 6

7. Real-time PCR & Kit chuẩn bị mẫu Salmonella + + + Listeria monocytogenes + + - E. coli O157 + + - Enterobacteriaceae plus Cronobacter - - + Short Prep I Kit + + - Short Prep II Kit + + - StarPrep One Kit + + + StarPrep Two Kit + + - Magnetic Prep One Kit + - + Magnetic Prep IV Kit - - + Tổ chức chấp thuận : định tính vi sinh vật gây bệnh 7

8. Tổ chức chấp thuận : Sản phẩm và chứng nhận Tất cả các loại thực phẩm đều được thẩm định bao gồm thành phẩm , nguyen liệu thô , mẫu môi trường và giai đoạn sản xuất chính . 8

9. Nhiễm bệnh do Salmonell a ở người ~ 16.000 ca do nhiễm Salmonella*. (Đức 2015) Các chủng chính: S. Enteritidis 44 chủng S. Typhimurium 40 chủng S . Infantis 17 chủng chiếm 80% Ảnh hưởng trong thực phẩm: Nhà máy chế biến thịt Nhà máy chế biến trứng Bánh kẹo/ kem Khác (gia vị, đậu, mầm,...) * Dữ liệu được thống kê bởi Viện nghiên cứu Robert Koch, Berlin 9

10. Dịch nhiễm Samonella trong thực phẩm và động vật năm 2018 Dữ liệu được thống kê bởi cdc.gov 10

11. food proof ® Kit định tính Salmonella Chủng đã kiểm tra Các loài vi sinh vật có liên quan Các loài vi sinh vật có cùng môi trường sống 63 chủng Loài Salmonella Salmonella enterica Phân loài enterica (I) Phân loài salamae (II) Phân loài arizonae (IIIa) Phân loài diarizonae (IIIb) Phân loài houtenae (IV) Phân loài indica (VI) Salmonella bongori Hơn 700 chủng 523 36 31 28 20 10 18 Bao gồm 100% phát hiện 100% không phát hiện Không bao gồm 11

12. food proof ® LyoKit định tính Salmonella ( R 602 27) Tính năng : Thuận tiện Hỗn hợp phản ứng có sẵn trong kit , chỉ cần chuẩn bị mẫu DNA Dễ bảo quản ( 2 - 8 °C) – dễ vận chuyển (RT ) An toàn Giả m thiểu sử dụng pipete : giảm nguy cơ nhiễm chéo Độ nhạy cao : thể tích mẫu cần chuẩn bị lớn ( lên đến 25 µl thay vì 5 µl) Không cần đông sâu Thông số kỹ thuật Thuận tiện Tương thích với gần như tất cả các chu kỳ real-time PCR dựa trên đầu dò Hydrolysis Tiêu chuẩn chất lượng mẫu cai ví dụ như kit mẫu lỏng food proof ® : bao gồm IPC và UNG 12

13. Tính năng - Kit PCR 13 Nền tảng mở: Kit PCR có thể được sử dụng trên các thiết bị real-time PCR khác nhau Loại Lyo: Dễ sử dụng và bảo quản Bao gồm kiểm soát: Chứng dương, chứng âm, nội chuẩn (IAC) Bắt buộc dựa trên ISO 22174:2004 Đảm bảo tính hợp lệ của kết quả ! Workflow LyoKits

14. KingFisher TM Flex and Magnetic Preparation Kits I - V Chiết tách DNA Salmonella tự động và các thông số khác 14

15. food proof ® RoboPrep Fusion Hệ thống hoàn toàn tự động : Xác định mẫu với đầu đọc barcode Phân phối mẫu Phân phối dung dịch và đệm Bộ Janus cung cấp mẫu KingFisher TM Flex trong việc chiết tách acid nucleic Cài đặt PCR 15 Đ ược AOAC , MicroVal, ISO 16140 chấp thuận

16. Ứng dụng trong: food proof ® Magnetic Preparation Kit I (vi khuẩn gram âm, ví dụ Salmonella ) food proof ® Magnetic Preparation Kit III ( GMO, chất gây dị ứng , định danh động vật) food proof ® RoboPrep 32 – Tính năng 16 Hiệu quả: Trích xuất tự động nhỏ gọn và yên tĩnh cho tối đa 32 mẫu trong vòng < 1 h Đế in nhỏ gọn: 40 cm (rộng) x 42 cm (sâu) x 44 cm (cao) Thân thiện với người sử dụng : dễ dàng sử dụng và xử lý mẫu An toàn : Tích hợp cửa an toàn & UV-Light để chống nhiễm chéo NEW!

17. food proof ® (Lyo)Kits định tính Listeria monocytogenes Dr. Xiaoyun Lee 19 March 2019

18. food proof ® (Lyo)Kits định tính L . monocytogenes 18 Bao gồm : > 100 chủng L. monocytogenes Không bao gồm : > 60 chủng khá liên quan đến các loài vi sinh vật có cùng môi trường sống Độ nhạy : 1 – 10 cfu / 25 g of mẫu tăng sinh Nền mẫu : nhiều nền mẫu thực phẩm ( sữa , phô mai , gia cầm , thịt , gia vị , …)

19. Bối cảnh – Sự nhiễm dịch Listeria 19 Tại Đức : 467 ca nhiễm Listeria vào năm 2013 1 7% tử vong Tại EU: 1470 & 1642 ca nhiễm Listeria vào năm 2011 & 2012 2 chỉ loài Listeria monocytogenes gây bệnh nguy hiểm với người  viêm màng não , nhiễm trùng máu và sảy thai … N hóm người bị ảnh hưởng :  trẻ sơ sinh, phụ nữ có thai, người già, người có hệ miễn dịch kém Bệnh do nhiễm Listeri a ở người thường liên quan đến việc ăn uống :  thịt , cá , các sản phẩm từ sữa , rau củ ( xà lách , dưa hấu …) Nguồn : 1 Viện nghiên cứu Robert Koch, 2 Cơ quan an toàn thực phẩm châu Âu

20. 20 Nguồn : Kênh NewsAsia Bối cảnh – Sự nhiễm dịch Listeria

21. Listeria monocytogenes – Bao gồm & Không ba o gồm 21 102 chủng Listeria monocytogenes 50 chủng được xác nhận thêm 52 chủng đã kiểm tra > 300 trình tự kiểm tra trên máy tính Chủng kiểm tra 27 Listeria spp .: L. fleischmannii , L. grayi , L. innocua , L. ivanovii , L . marthi , L . rocourtiae , L. seeligeri , L. welshimeri , L . weihenstephanensis 27 vi sinh vật cùng môi trường sống Bao gồm Không bao gồm 100% phát hiện 54 chủng 100% không phát hiện

22. Các loại thực phẩm cần kiểm tra 22 37 nền mẫu thực phẩm cần kiểm tra

23. Từ mẫu đến kết quả trong vòng 24 h 23 Tăng sinh Chiết tách DNA Cài đặt PCR PCR 18 – 22 h 2 0 – 45 min 5 min 100 min

24. Đã được xác minh : food proof StarBroth : 22 +/- 2 h ½ Fraser: 48 h tăng sinh Tương thích với môi trường tăng sinh 24

25. Dụng cụ PTN để chiết tách DNA 25 Tuýp ly giải đơn (< 24 mẫu ) Ly giải 8 kênh (> 24 mẫu ) DEEPWELL LYSIS ( tự động )

26. Từ chuẩn bị mẫu đến kết quả trong 24 h ( hiệu năng thấp ) 26 Chỉ tiêu Tăng sinh Chiết tách DNA PCR Listeria monocytogenes 22 h ± 2 h in Listeria StarBroth StarPrep Two Kit, 1 ml (A) or 800 µl (B), 8 min. Disruptor Genie and 5 min. 95 - 100°C Listeria monocytogenes Detection Kit 25 µl, 100 min. Ưu điểm : AOAC tương thích với L . mono ISO 11290 Chỉ tăng sinh 1 lần (25 g) và cho kết quả trong 24 h Tương thích với đa dạng nền mẫu LOD khoảng 10 3 cfu/ml Thuận tiện với PCR LyoKit (chỉ tái huyền phù hóa với 25 µl DNA)

27. food proof ® Campylobacter Kits Dr. Xiaoyun Lee 19 March 2019

28. 28 Camyplobacter – Thông tin Campylobacter ( nghĩa là “vi khuẩn hình cong "); Gram âm Xuất hiện chủ yếu ở gia cầm , con ngườ i có thể nhiễm do ăn thực phẩm bị nhiễm C ampylobacter . Chủng phổ biến thường gây bệnh ở người : C . jejuni và C. coli.

29. 29 Camyplobacter – Thông tin Chủng ưa nhiệt mới C . hepaticus – có thể được phát hiện bởi Kit định tính food proof Campylobacter. C. hepaticus được phát hiện lần đầu vào năm 2016 , lý do gây nên “ bệnh gan gà nổi đốm ” “ Bệnh gan nổi đốm (SLD) gây nên giảm lượng trứng đáng kể và gây chết ở gà , vì thế bệnh ảnh hưởng lớn đến nền công nghiệp gia cầm ...”

30. C. avium 34 Chủng C. butzleri C. canadensis C. cinaedi C. coli C. concisus C. corcagiensis C. cryaerophilus C. cuniculorum C. curvus C. fennelliae C. fetus C. gracilis C. helveticus C. hepaticus C. hominis C. hyoilei C. hyointestinalis C. insulaenigrae C. jejuni C. lanienae C. lari C. mucosalis C. mustelae C. nitrofigilis C. peloridis C. pylori C. rectus C. showae C. sputorum C. subantarcticus C. upsaliensis C. ureolyticus C. volucris Các chủng Campylobacter 30

31. Điều khoản (EC ) số 2073/2005 như sau : Tiêu chuẩn vi sinh vật Yêu cầu vệ sinh tron g sản xuất thực phẩm Tiêu chuẩn quy trình vệ sinh Điều khoản ( EU ) 2017/1495 ban hành ngày 23 tháng 8 2017 bổ sung thành Điều khoản (EC) số 2073/2005 liên quan đến Campylobacter trong thịt gà Kể từ ngày 1 tháng 1 năm 2018 (EC ) 2017/1495 là một phần của ( EC) 2073/2005 và Campylobacter cần được phân tích trong thịt gà Tại sao cần kiểm tra Campylobacter ? Điều khoản mới trong (EU ) 2017/1495 31

32. Đặc trưng : Phạm vi : Kit định lượng real-time PCR trong việc phát hiện và định lượng loài ưa nhiệt Campylobacter Tên : food proof Campylobacter Quantification Kit Mã số: R 302 05 Phản ứng: 96 Dạng: kit lỏng , 5‘Nuclease Kênh: FAM (ưa nhiệt C. ), VIC/HEX (IPC), ROX ( C. jejuni ), Cy5 ( C. coli ) Bảo quản : -15 đến - 25°C Bao gồm tăng sinh, kit này cũng có thể dùng để định lượng! food proof ® Kit định lượng Campylobacter , 5‘Nuclease 32

33. food proof ® Định danh và định lượng Campylobacter 33 Định lượng tuyệt đối Campylobacter spp. [cfu/ml] Định danh C . jejuni và C . coli ở hai kênh riêng biệt quant . standard pos. sample C. coli identification C. jejuni identification

34. Định danh Campylobacter – Thời gian cho kết quả 34 Phương pháp ISO truyền thống Real-Time PCR Tăng sinh 24 h Tăng sinh chọn lọc 24 – 48 h Tăng sinh trên thạch mCCD 24 h Ủ trong môi trường lỏng & thạch 48 h + 48 h Xác minh huyết thanh học 4 h Xác minh sinh hóa 4 h Tăng sinh 24 – 48 h Chiết tách DNA 0.5 h Định lượng Real-Time PCR Định danh C. Jejuni và C. coli 1 - 1.5 h Tiết kiệm thời gian: Kết quả âm tính: > 3 ngày Kết quả dương tính : > 5 ngày

35. Tại sao nên dùng PCR ? 35 Từ chuẩn bị mẫu đến cho kết quả trong vòng 24 h 18 – 22 h 2 0 – 45 phút 100 phút Chỉ tiêu Tăng sinh Chiết tách DNA Cài đặt PCR và PCR Campylobacter ĐỊNH LƯỢNG Preston or Bolton Bouillon (ISO 19272) StarPrep Two Kit, 100°C + mech . disruption Campylobacter Detection Kit Campylobacter ĐỊNH LƯỢNG StarPrep Two Kit, 100°C + mech . disruption Campylobacter Quantification Kit

36. Campylobacter – Bao gồm và không bao gồm 36 Không bao gồm Bao gồm 73 chủng 193 chủng Loài Campylobacter Isolates Campylobacter coli 77 Campylobacter jejuni 102 Campylobacter lari 10 Campylobacter upsaliensis 4 Chủng kiểm tra Loài Campylobacter không ưa nhiệt Chủng có gen gần giống Chủng có cùng môi trường sống 100% Phát hiện 100% không phát hiện

37. Campylobacter – Nền mẫu thực phẩm kiểm tra 37 Pha loãng Tăng sinh Định lượng  pha loãng đến 10 2 , 10 3 , or 10 4 cfu/ml C. coli Campylobacter sp . = FAM , IPC = HEX , C. jejuni = ROX , C. coli = Cy5 Nền mẫu: gà, heo, gà tây, vịt, thỏ, la-gu Định tính  nuôi cấy tăng sinh đến 10 2 hoặc 10 3 cfu/ml C. jejuni Campylobacter sp . = FAM , IPC = HEX , C . jejuni = ROX , C . coli = Cy5 Nền mẫu: tôm, cá hồi, pa-tê, gà, gà tây, thịt viên, phô mai, gà viên C ó thể phát hiện 10 3 cells/ml trong phần lớn nền mẫu kiểm tra Khuếch đại không bị ức chế cho đến 10 8 tế bào/ ml E. coli

38. Quy trình chiết tách DNA được thẩm định : R 310 05: food proof ShortPrep II Kit (S 400 02) food proof Sample Prep Kit II ( S 400 05) R 302 05 food proof ShortPrep II Kit (S 400 02) food proof Sample Prep Kit II (S 400 05 ) food proof StarPrep One Kit (S 400 07) Khuyến cáo cho việc định lượng và phân biệt tế bào sống & chết: food proof StarPrep Two Kit (S 400 08) Reagent D food proof ® Camplyobacter Kits: Chiết tách DNA 38

39. Reagent D: phân biệt tết bào Campylobacter sống/ chết Kết hợp với food proof StarPrep Two Kit (quy trình đặc hiệu cho việc phân tích định lượng Campylobacter ) Reagent D 39

40. Loại bỏ tế bào chết bằng Reagent D và D-Light 40 1. Xử lý với Reagent D 2. Sau chiết tách 3. Chạy máy real-time PCR

41. So sánh với phương pháp vi sinh truyền thống: Tiết kiệm thời gian hơn so với tiêu chuẩn ISO 10272 Độ chính xác cao hơn , phương pháp đổ đĩa ISO 10272 khó phân tích, cần phải lặp lại nhiều lần Tất cả các nền mẫu liên quan theo điều khoản mới ( EC) 2017/1495 đã được kiểm chứng Ưu điểm của Kit food proof ® Campylobacter 41