PREPARACION DE MUESTRAS PARA SU OBSERVACION AL MICROSCOPIO OPTICO

Indicaciones y preinscripciones par analizar y utilizar las muestras de laboratorio.

1. GRUPO 1 UNIVERSIDAD NACIONAL JOSÉ FAUSTINO SÁNCHEZ CARRIÓN FACULTAD DE INGENIERÍA AGRARIA, INDUSTRIAS ALIMENTARIAS Y AMBIENTAL   CARRERA PROFESIONAL INGENIERÍA AMBIENTAL “PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO ÓPTICO” INTEGRANTES Espinoza Reyes Naissa Jimena Garro Lazaro Marco Antonio Huata Rosales Ketty Roxana Julca Tarazona Mireya Zoraida Sanchez Cajaleon Jorge Alberto

2. RESUMEN 01 INTRODUCCIÓN 02 MATERIAL NESESARIO PARA LA PREPARACION DE MUESTRA Preparación de la muestra 03 PREPARACIÓN DEL MATERIAL MICROBIOLOGICO PARA LA MICROSCOPIA 04 RECOMENDACIONES, CONCLUSIONES Y REFERENCIAS Preparación de muestra P reparacion preparado fijo para tinciones P reparación en fresco P reparación en seco 05 ÍNDICE

3. El microscopio óptico se ha utilizado como una herramienta fundamental para proporcionar imágenes magnificadas de objetos imperceptibles a simple vista. Una imagen óptica es una representación discreta de distribución de intensidades en una superficie hacia la cual se dirigen los rayos que derivan de un objeto iluminado tras interactuar con un sistema óptico. El resultado de la interacción de la luz con la muestra y su entorno es impreso en la imagen, ésta provee información sobre la estructura de la muestra como su morfología y distribución espacial. El análisis y estudio de esta información abre la posibilidad de determinar algunas propiedades físico-químicas de las muestras y su contribución en otros procesos del ambiente en el que están relacionados. El microscopio óptico de campo claro se ha utilizado como herramienta de análisis en aplicaciones biológicas como la clasificación de células, estudios de tráfico intracelular de moléculas, el análisis histológico para detectar defectos en células humanas, etc. Una de las limitaciones de esta técnica es la dificultad para formar imágenes de muestras muy delgadas, por tal razón se han desarrollado otras técnicas de iluminación que compensan este tipo de limitaciones como la microscopía de contraste de fase, la microscopía de campo obscuro, la microscopía de fluorescencia y la microscopía confocal, entre otras. 1 RESUMEN

4. Los microorganismos son demasiado pequeños para ser detectados por el ojo humano, por ello, es esencial la observación microscópica para determinar la forma, el tamaño, agrupamiento y características de coloración de los mismos. Generalmente, éstos son los primeros datos que se obtienen cuando se desea saber qué tipo de bacteria u hongo es. Con el microscopio óptico se consigue un amplio margen de aumento que puede alcanzar desde 10 a 1000 diámetros Para ello es necesario saber si observaremos una muestra viva o muerta, si queremos ver la muestra entera o simplemente una sección y si será necesario utilizar tintes para poner de relieve una característica concreta. También es importante conocer la duración de la observación ya que esto determina si será necesario hidratar la muestra para evitar que se seque. INTRODUCCIÓN

5. MATERIAL NESESARIO PARA LA PREPARACION DE MUESTRA Historia del microscopio: Los microscopios de Anton van Leeuwenhoek constaban de una única lente pequeña y convexa, montada sobre una plancha, con un mecanismo para sujetar el material que se iba a examinar (la muestra o espécimen). Leeuwenhoek realizó las primeras observaciones de microorganismos en el agua de lluvia, sarro de dientes, sangre, semen, excrementos, etc., describiendo unos pequeños animales de gran diversidad. Un microscopio óptico es un microscopio basado en lentes ópticas. También se le conoce como microscopio de luz (que utiliza luz o «fotones») o microscopio de campo claro.

6. Preparación de la muestra: Portaobjetos NH 3 H H N N O El primer paso antes de empezar a preparar una muestra es asegurarnos que disponemos de todo el material que necesitaremos. El portaobjetos es una pequeña pieza de vidrio con unas dimensiones de aproximadamente 76 x 26 mm y entre 1 y 1.5 milímetros de espesor. Su función es servir de soporte para la muestra ya que es sobre él que colocaremos el espécimen que queremos observar. Es importante manipular con cuidado el portaobjetos ya que sus cantos afilados pueden en ocasiones producir cortes. Para evitar lesiones existen portaobjetos con las esquinas esmeriladas.

7. Cubreobjetos El cubreobjetos es también una pequeña pieza de vidrio con unas dimensiones menores que el portaobjetos. El cubreobjetos tiene una forma cuadrada con un lado de entre 18 y 20 milímetros y un espesor de entre 0.13 y 0.17 mm. Debido a su espesor extremadamente bajo, el cubreobjetos es un elemento extremadamente frágil y, por lo tanto, hay que manipularlo con cuidado. Durante la preparación de la muestra es habitual añadir unas gotas de agua sobre la muestra. Función: Mantener la muestra en su sitio y protegerla de posibles contaminaciones. Es una medida de protección para evitar que la lente del objetivo entre en contacto con la muestra. La colocación del cubreobjetos sobre estas gotas de agua permite aplanar el líquido y facilita el enfoque sobre el plano de la muestra.

8. Pinzas Instrumento para agarrar cosas, en especial cosas pequeñas, que consiste en dos piezas unidas por un extremo y separadas por el otro, que se juntan o se separan haciendo presión con los dedos por el centro o por uno de sus extremos Pipeta La pipeta es un instrumento de laboratorio que permite medir y dosificar un líquido con gran precisión. En el campo de la microscopía se utiliza para colocar sobre la muestra la cantidad de líquido adecuada para su hidratación o simplemente para colocar sobre el portaobjetos una cantidad limitada de líquido que contiene la muestra

9.   Tinta y papel absorbente La tinción es uno de los recursos utilizados para poner de relieve algunas características concretas de la muestra observada. Existe una gran cantidad de técnicas de tinción y su uso en cada caso depende de la muestra observada. En los procesos de tinción se utilizan colorantes y tinturas que se mezclan con la muestra para mostrar estructuras que de otro modo permanecerían invisibles. Una distinción importante es entre la tinción in vivo, que incluye las técnicas para teñir células vivas, y la tinción in vitro, que se refiere a las técnicas para teñir células muertas. Cuando se utilizan tintes es habitual utilizar también papel absorbente para deshacerse de un posible exceso de tinte sobre el portaobjetos.

10. PREPARACIÓN DEL MATERIAL MICROBIOLÓGICO PARA MICROSCOPÍA La observación microscópica constituye la primera etapa del estudio de los microorganismos y también el diagnóstico microbiológico ya que permite conocer algunas características de los microorganismos, como: forma, disposición o agrupación, presencia o ausencia de estructuras (cápsulas, esporas, flagelos), movilidad, etc. El estudio "en fresco" se desarrolló cuando todavía no se habían inventado la fijación y la tinción. Actualmente se siguen utilizando, sobre todo gracias al desarrollo de las técnicas de contraste de fases y contraste interferencial.

11. Un estudio “en fresco" es aquel que no precisa un tratamiento en el que se maten las células, como es la fijación o la inclusión. Las bacterias no teñidas muestran pocos detalles morfológicos, el diagnóstico bacteriológico generalmente se basa en las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias para identificarlos más adecuadamente. Sin embargo, también resultan útiles las preparaciones no teñidas en la determinación de la movilidad. Las preparaciones fijas y teñidas son de uso casi universal, tanto a partir de especímenes recibidos como de colonias cultivadas. En general una muestra del espécimen original puede ser colocada directamente sobre el portaobjetos o bien ser recogida con un asa, recordando siempre tener una preparación delgada y homogénea. Una colonia puede ser examinada haciendo con ella una suspensión tenue en una gota de solución salina, y luego extendiéndola con un asa sobre un portaobjetos. Las películas secadas al aire son fijadas con calor suave sobre la flama de un mechero y luego pasadas a través de ella. Debe tenerse cuidado para evitar el calor excesivo, que puede alterar la forma bacteriana. El calor deseable es aquel en el que el portaobjetos sea apenas caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.

12. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA : Para observar una muestra al microscopio óptico podemos recurrirá a:

13. Preparación húmeda Se realiza colocando una gota de la suspensión de microorganismos entre un porta y un cubreobjetos. Se observa directamente. Preparación fijada: Se coloca una suspensión homogénea de microorganismos en una gota de agua sobre el portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes químicos) y después se tiñen mediante diferentes técnicas. Estas preparaciones se observan sin cubreobjetos y, habitualmente, con objetivos de inmersión.

14. Preparación preparado fijo para tinciones. Secado F ijado 1 2 La extensión del material sobre el portaobjetos se hará de diferentes formas, en función de la procedencia del producto a examinar. Si el producto es líquido, se depositará una pequeña cantidad de material en el centro del porta, extendiéndolo con el asa hasta conseguir una capa fina y homogénea. Si la extensión debe hacerse a partir de un cultivo en medio sólido, la colonia que vayamos a estudiar se mezclará con una gotita de agua destilada estéril colocada en el centro del portaobjeto. Una vez realizado el frotis, debemos dejar secar al aire la preparación, cuando está seca la superficie pasa de ser brillante a mate; para acelerar el secado se puede calentar ligeramente la parte inferior del portaobjetos (sin quemar). La fijación es el último paso antes de proceder a la tinción, y tiene como objetivo no permitir que la muestra de estudio se pierda (o se barra) en el proceso de tinción. En frotis hematológicos no se requiere de fijación debido a que existe una coagulación rápida de las albúminas citoplasmáticas; o si el material a teñir posee abundante material celular, se recomienda fijar con alcohol metílico después de secar la preparación.

15. P reparado en fresco Las preparaciones en fresco mantienen la hidratación durante un periodo de aproximadamente 30 minutos. Si se requiere mantener la muestra hidratada durante un espacio de tiempo más largo pueden sellarse los bordes del cubreobjetos con vaselina . En este caso se evita la evaporación del líquido durante unas horas o incluso unos días. La preparación en fresco es ideal para la observación de microorganismos o de tejidos biológicos que requieren ser hidratados

16. A B C D E Si la muestra es líquida colocamos unas gotas de la muestra en el centro del portaobjetos con la ayuda de una pipeta. Si la muestra es sólida colocamos primero unas gotas de agua destilada o de solución salina sobre el portaobjetos y a continuación un fragmento de la muestra con la ayuda de unas pinzas. Sujetando el cubreobjetos por dos de sus lados, apoyamos otro de sus lados sobre el portaobjetos de modo que forme un ángulo de aproximadamente 45 grados. A continuación, podemos soltar con cuidado el cubreobjetos de modo que quede colocado sobre el líquido que hemos depositado anteriormente. (Mediante este procedimiento se evita la formación de burbujas dentro de la muestra. En caso de que hayan aparecido burbujas entre el portaobjetos y el cubreobjetos será necesario repetir el procedimiento anterior.) En caso de que haya un exceso de líquido alrededor del cubreobjetos podemos eliminarlo mediante papel absorbente.

17. P reparado en Seco La preparación en seco es ideal para muestras que no necesitan hidratación. Esto incluye, por ejemplo, un cabello, granos de polen, esporas, muestras de plantas, insectos, etc. A Si la muestra es totalmente opaca el primer paso consistirá en cortar primero una sección muy fina de la muestra. Esto permitirá observarla en el microscopio mediante luz transmitida. B Colocamos la sección que hemos cortado en el centro del portaobjetos con la ayuda de unas pinzas. Si la muestra tiene un cierto volumen es recomendable utilizar un portaobjetos con una cavidad cóncava C Para mantener la muestra fija en su sitio la cubrimos con un cubreobjetos. Esto evita también que el objetivo llegue a tocar la muestra en caso de cometer algún error durante la manipulación del microscopio

18. C onclusión El microscopio es sin duda una herramienta muy importante para los seres humanos, una herramienta muy factible ya que ayuda a la medicina y su evolución lo hace aún más satisfactorio para la investigación. La preparación de la muestra es esencial para evaluar los resultados, es por ello que la muestra debe ser una cantidad limitada que un organismo, se debe preparar para la observación que consiste en someter a la tinción colorear los microorganismos con un colorante que destaque ciertas estructuras de esto para llevarse a cabo se siguen dos procesos el proceso de extensión y el de fijación la extensión se da a partir de una muestra la cual se extiende una película delgada del material que contiene los microorganismos sobre la superficie de un portaobjetos.

19. A través de la llama de un mechero bunsen con el extendido hacia arriba la fijación produce la muerte simultánea de los microorganismos y su adherencia al portaobjetos si no se realiza el colorante puede arrastrar los microorganismos del portaobjetos y cuando vamos a realizar la observación a través del microscopio. Realizar la tinción empezamos con la muestra la cual se va a ser un proceso de extensión como con movimientos circulares y luego el proceso de fijación a través de la llama de un mechero bunsen que finalmente se puede proceder a seguir con atención para realizar la tinción.

20. Recomendaciones Como sabemos el microscopio es un instrumento de precisión construido de valiosos y delicados materiales, con un buen mantenimiento y cuidado tal instrumento durara muchos años. Si vamos a mover constantemente nuestro equipo es conveniente tomarlo de las partes que nos indica el proveedor generalmente es del brazo o cuello del microscopio, estando frío por supuesto esto evitará que se fundan los focos de iluminación, el lugar de almacén del deberá ser lo más limpio del polvo, humedad, o exceso de calor en anaqueles estables y fijos. Al iniciar el mantenimiento de un microscopio es muy importante tener las herramientas y los materiales adecuados, como soluciones líquidas preparadas para la limpieza; y por supuesto un área destinada para el mantenimiento. Cuando se inicia un buen mantenimiento NO es necesario desensamblar todas sus partes: ópticas, mecánicas y electrónicas, porque todos ellos están provistos de sellos del fabricante y con la garantía de seguridad de que no se penetrará nada nunca en condiciones normales de trabajo, además se corre el riesgo de confundir una cara de cualquier lente interna ya sea del ocular o del objetivo.

21. Artedinámico . HISTORIA DEL MICROSCOPIO. [ citado el 12 de julio de 2022];  Disponible en : https://www.equiposylaboratorio.com/portal/articulo-ampliado/historia-del-microscopio C. Bayles, Light and Video Microscopy (American Institute of Biological Sciences, 2010). J. Carlos, “Descubriendo el microscopio”, Centro de investigaciones en óptica. S.A. (2014) J. Pawley, Handbook of biological confocal microscopy (Springer, 2010). K. K. Ghosh, L. D. Burns, E. D. Cocker, A. Nimmerjahn , Y. Ziv , A. E. Gamal, and M. J. Schnitzer , "Miniaturized integration of a fluorescence microscope," Nat. Methods 8, 871-878 (2011). Mundo microscópico, “Preparación de muestras para microscopio óptico” ( https://www.mundomicroscopio.com/preparacion-de-muestras/ ) N. S. Claxton, T. J. Fellers, and M. W. Davidson, "Microscopy, Confocal," in Encyclopedia of Medical Devices and Instrumentation (John Wiley & Sons, 2006). Real Academia Española. (2014). Diccionario de la lengua española. Recuperado de: https://dle.rae.es/pinza Universidad Nacional de Piura, “Microbiología general”, (2017) ( http://www.fcn.unp.edu.ar/sitio/microgeneral/wp-content/uploads/2017/02/02-MICROSCOPIA.pdf ) B ibliografia