PROPOSAL pengaruh LOS N.GO Terhadap replikasi HIV

PROPOSAL pengaruh LOS N.GO Terhadap replikasi HIV

1. Pengaruh Lipooligosakarida (LOS) Nesseria gonorrhea , Terhadap Replikasi Human Immunodeficiency Virus (HIV) Melalui Aktivasi Nuclear factor-kappa B (NFKB), impulse response function 3 (IRF3), dan Interferon  ( IFN) PROPOSAL Niniek Budiarti Departemen Ilmu Penyakit Dalam Rumah Sakit Saiful anwar Malang 1

2. Hambatan Pertumbuhan HIV wanita pekerja seks komersial yang menderita gonorhoe memiliki kekebalan spesifik virus yang lebih kuat terhadap HIV dibandingkan dengan yang bukan co - infeksi atau terinfeksi IMS lainnya. 1 LPS dapat menekan replikasi HIV-1 post entry reverse transcription yang terdapat pada imunitas alami. 3 LOS sendiri merupakan Lipopolisakarida (LPS) dengan berat molekul rendah. 4,5 Lipooligosakarida (LOS) adalah komponen dari membran luar N gonorhoe yang menginduksi imunitas alami melalui keterlibatan Toll-like reseptors 4 (TLR4 ). 6 1 Sheung et al., 2008 2 Feng Liang Liu, 2016 3 Liu , 2016 4 Wanget al, 2010 ; 5 Butler , 2011 6 AlisonG , 2008

3. Imunitas Alami Terhadap Infeksi N. Gonorrhoeae Dalam Menghambat Replikasi HIV Sistem imun alami menggunakan germline-encoded pattern-recognition receptors (PRRs) yang menginisiasi dalam mendeteksi mikroba. PRRs mengaktifkan jalur sinyal down stream pada induksi respons imun alami dengan menghasilkan sitokin inflamasi, interferon tipe I (IFN), dan mediator lainnya. 1 N. gonorrhoeae memiliki potensi mekanisme untuk menghindar destruksi oleh respon imun alami, karena mekanisme untuk menghindar maka pelepasan LOS dari membrane sel N . G onorrhoeae. 2 LOS yang dilepas merangsang produksi interferon tipe I, oleh sel dendritik plasmacytoid (pDCs), ini dapat mencegah replikasi HIV. 3,4 1 Kawasaki T & Kawai T, 2014; 2 Imarai et al., 2012; 3 Belaire et all , 2010; 4 Melissa K et all, 2013

4. TLR4 Sebagai Receptor mekanisme masuknya LOS dan LPS kedalam sel Dendrit LOS yang diekspresikan N . gonorrhoeae menginduksi respon imun alami spesifik melalui pensiyalan TLR4. 1 TLR4 adalah satu-satunya reseptor yang dapat menginduksi gen tipe IFN (IFN  ) dengan mengenali asam-asam nonnukleat, lipopolisakarida ( LPS). 2, 3 Meningkatnya ekskresi NFkB & IRF3 meningkatkan produksi IFN β yang akan memblokir reverse transcription ( RT) selanjutnya menekan replikasi HIV-1 pasca-entri. 4 1 xinyan L, 2006 2 Takeuchi O et al., 1999 3 Yang Y et al., 2016. 4 Feng Liang Liu et all , 2016

5. Sinyal TLR di cDCs, Makrofag (Kawasaki T & Kawai T, 2014)

6. Rumusan Masalah Rumusan Masalah Umum Apakah paparan Lipooligosakarida (LOS ) N gonnorhoe , pada Sel dendrit pasien HIV naif , akan menekan replikasi HIV melalui aktivasi ekspresi NFkB , IRF3 dan IFN  Rumusan Masalah Khusus Apakah paparan Lipooliogosakarida (LOS) N gonorhoe pada sel dendrit pasien HIV naïf akan meningkatkan aktivasi NFkB Apakah paparan Lipooliogosakarida (LOS) N gonorhoe pada sel dendrit pasien HIV naïf akan meningkatkan aktifasi IRF3 Apakah paparan Lipooliogosakarida (LOS) N gonorhoe pada sel dendrit pasien HIV naïf akan meningkatkan aktivasi IFN  Apakah paparan Lipooliogosakarida (LOS) N gonorhoe pada sel dendrit pasien HIV naïf akan menurunkan jumlah virus HIV Apakah paparan Lipooliogosakarida (LOS) N gonorhoe pada sel dendrit pasien HIV naïf, dengan menurunnya jumlah virus HIV akan diikuti peningkatan aktivasi NFkB , IRF3 dan IFN  Apakah paparan Lipooliogosakarida (LOS) N gonorhoe pada sel dendrit pasien HIV naïf terdapat kadar yg paling optimal dengan menurunnya jumlah virus HIV

7. Tujuan Penelitian Tujuan Umum Penelitian ini bertujuan menilai efek paparan LOS N gonorhoe pada sel dendrit pasien HIV naïf, yang diharapkan dapat menekan replikasi HIV melalui peningkatan aktivasi ekspresi NFkB , IRF3 dan IFNβ TUJUAN KHUSUS Memberi paparan lipooligosakarida (LOS) Neisseria gonorhoe , pada sel dendrit pasien HIV naif Membuktikan peningkatan ekspresi IFN  dari sel dendrit hasil paparan Lipooligopolisacharida (LOS) N gonorhoe Membuktikan peningkatan ekpresi NFkB dari sel dendrit hasil paparan Lipooligopolisacharida (LOS) N gonorhoe Membuktikan peningkatan ekpresi IRF3 dari sel dendrit hasil paparan Lipooligopolisacharida (LOS) N gonorhoe Membuktikan penurunan virus HIV dari sel dendrit hasil paparan Lipooligopolisacharida (LOS) N gonorhoe Membuktikan hasil paparan Lipooligopolisacharida (LOS) N gonorhoe pada sel dendrit pasien HIV yang naif dengan menurunnya jumlah virus HIV akan diikuti peningkatan aktivasi NFkB , IRF3 dan IFN  Membuktikan kadar paparan Lipooligopolisacharida (LOS) N gonorhoe yang paling optimal pada sel dendrit pasien HIV yang naif dengan menurunnya jumlah virus HIV

8. Manfaat Penelitian Manfaat akademis Dapat dijadikan dasar teori untuk menambah wawasan ilmu pengetahuan sekaligus sebagai dasar untuk pengembangan penelitian selanjutnya dalam bidang kesehatan Manfaat Praktis Dengan paparan LOS N Gonorhoe pada sel dendrit pasien HIV naif, akan meningkatkan aktivasi NFkB , IRF3, IFN β dengan menghambat replikasi HIV, diharapkan dapat dikembangkan sebagai pencegahan yang dapat menurunkan progresifitas dari pasien HIV-AIDS sehingga kualitas hidup ODHA akan lebih baik.

9. KERANGKA TEORI, KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN

10. KERANGKA TEORI Pengaruh Lopooligosakarida N gonorrhoe dalam penghambatan Replikasi HIV melalui jalur TLR4

11. LOS SEL DENDRIT Pasien HIV TLR 4 IFN β  NfkB Reverse Transkiptase RNA Virus HIV DNA Provirus TIRAP TRAM MyD88 IKK  IRAK1     TRIF IKK-NFκB TRAF 6 RIP-1 TAK-1 IRF3 IRF3 P : Yang diteliti KERANGKA KONSEP TRAF 6 TAK 1

12. Hipotesa Penelitian Paparan LOS N gonnorhoe pada sel dendrit pasien HIV melalui reseptor TLR4 dapat meningkatkan aktivasi NFkB , IRF3, IFN  dan menurunkan jumlah virus HIV Sub Hipotesa Paparan LOS N gonnorhoe lebih meningkatkan aktivasi NFkB pada sel Dendrit pasien HIV naif Paparan LOS N gonnorhoe lebih meningkatkan aktivasi IRF3 pada sel Dendrit pasien HIV naif Paparan LOS N gonnorhoe lebih meningkatkan aktivasi IFNβ pada sel Dendrit pasien HIV naif Paparan LOS N gonnorhoe lebih menurunkan jumlah virus HIV pada sel Dendrit pasien HIV naif Paparan Lipooliogosakarida (LOS) N gonorhoe pada sel dendrit pasien HIV naïf lebih menurunkan jumlah virus HIV dengan diikuti peningkatan aktivasi NFkB , IRF3 dan IFN 

13. METODE PENELITIAN

14. Desain Penelitian Quasi - experimental laboratory design untuk mengetahui efek pemberian LOS N gonnorhoe pada sel dendrit dari donor yang telah terinfeksi virus HIV. Dilakukan penelitian dengan memapar lipooligosakarida (LOS) dari kuman Neisseria gonorrhoe dalam menekan replikasi HIV melalui jalur NFkB , IRF3, IFN β

15. Sampel Penelitian Pemilihan Sampel K riteria inklusi : relawan laki-laki yang berusia 20 sampai 50 tahun yang dilakukan pemeriksaan test HIV dengan 3 metode yang berbeda dengan hasil yang positif dan masih naïf, stadium HIVnya masih stage 1 atau 2 dan bersedia untuk dilakukan penelitian dengan pengambilan darah Kriteria eksklusi : pasien HIV yang belum pernah mendapatkan ARV (anti retro viral) di RSSA , ternyata diketahui pernah mendapatkan ARV sebelumnya mnya dari tempat lain

16. Estimasi Besar Sampel Penelitian ini merupakan penelitian analitik numeric tidak berpasangan (two-sided test). Rumus besar sampel yang digunakan menggunakan “Formula of Federer” Jumlah sampel dihitung dengan rumus : ( n-1)( t-1) ≥ 15 n = jumlah sampel tiap perlakuan t = jumlah kelompok perlakuan

17. Variabel Bebas Lipooligosakarida (LOS) Variabel Perantara kadar Interferon β ( IFN β) ekspresi NFkBp65 ekspresi IRF-3 Variabel Tergantung Jumlah virus HIV Variabel Penelitian

18. Definisi Operasional P asien HIV Naif P asien yang belum pernah mendapatkan terapi ARV sebelumnya Lipooligosakarida (LOS) N gonorhoe Zat yang didapatkan dari ekstraksi membrane sel kuman Neiserria gonorrhoeae, yang digunakan untuk menginduksi sel dendrit dari PBMC pasien HIV naif , yang selanjutnya menginduksi NFkB, IRF3, IFN β untuk menekan replikasi HIV Subunit p65 NF- κB Ekspresi p65 NF- κB diukur dengan pewarnaan imunofluoresensi anti-p65 NF- κB diamati menggunakan flowsitometri

19. Analisa Data Seluruh teknis pengolahan data hasil penelitian dianalis secara komputerisasi dengan menggunakan software Statistical Product and Service Solution , IBM SPSS Statistics 20 dengan tingkat signifikansi atau nilai probabilitas 0,05 (p=0,05) dan taraf kepercayaan 95 % ( α = 0,05 ) Uji hipotesis komparatif adalah sebagai berikut : uji normalitas data, uji homogenitas varian, uji One-Way ANOVA , dan Post hoc test (uji Least Significant Difference)

20. Prosedur Pengambilan Darah Darah donor HIV naif pada pasien rawat inap dan rawat jalan di RSSA Malang Diambil dengan vacutainer yang sudah diberi EDTA sebanyak 10 cc diberi label identitas yang jelas  dikirim ke laboratorium Biomedik di laboratorium Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang, setelah itu dilakukan kultur PBMCs.

21. Isolasi PBMCs dan Kultur Sel Dendrit Sampel darah pasien HIV naif  Ficollhipaque dengan sampel darah adalah 1:1 . dan akan terbentuk 2 lapisan . disentrifus ( Biosan LMC-3000) suhu ruang , kecepatan 1000 rpm (30’) terpisah menjadi 5 lapisan , yaitu plasma, PBMCs, Ficoll-Hipaque , granulosit dan sel darah merah . Cincin PBMCs diambil dimasukkan botol sentrifuge 15 ml. Larutan PBMCs dicuci PBS 10 ml , sentrifus dalam suhu ruang , 1200rpm (10’). Supernatant dibuang dan pellet yang terbentuk dicuci kembali dengan PBS dan disentrifus kembali pada suhu ruang 1200 rpm (1000-1600 rpm) selama 10 menit dan dilakukan dua kali. Setelah disentrifus maka akan terbentuk pellet (PBMCs) didasar botol sentrifus 15 ml  PBMCs dikulturkan dengan media ImmunoCult ™ Dendritic Cell Culture Kit , untuk mendapatkan sel dendrit , selama 1,2 hari -2,9 hari ( Grievink , H.W., et al. 2016)

22. Ekstraksi dan Pemurnian LOS (1) LOS diekstraksi dengan metode Westphal dan John ( modifikasi ). bakteri biomassa disuspensikan dalam 170 ml air suling , penambahan 190 ml 90% (v / v) fenol panas (66 ° C), campuran diaduk kemudian selama 14 menit pada 66 ° C. Suspensi bakteri disimpan suhu diturunkan menjadi 0 ° C disentrifugasi (8500 × g, 4 ° C) selama 15 menit . LOS diekstraksi dengan penambahan etanol dingin 25% dan 100% (v / v) (4˚C) ke fasa berair dan fenol . Seratus ml 75% (v / v) dingin (4˚C) etanol ditambahkan ke supernatan fasa berair dan disimpan pada suhu 4 ° C selama 6 jam, kemudian disentrifugasi pelet mengandung LOS dilarutkan dalam air suling ( Pelet yang diperoleh dari fenol fasa ) disentrifugasi selama 1 jam supernatan yang mengandung LOS disimpan untuk pemurnian akhir .

23. Ekstraksi dan Pemurnian LOS (2) Untuk mengurangi kontaminasi asam nukleat dan kontaminasi protein, digunakan enzim DNase , RNase dan proteinase K dan untuk presipitasi , 1 g asam trikloroasetat (TCA) per 20 ml sampel yang diekstraksi ditambahkan larutan dipertahankan pada suhu 4 ° C selama 3 jam disentrifugasi (2000 x g 4 ° C selama 10 menit ) dan dialisis dengan air deionisasi selama 72 jam. Sampel yang dialyzed, dianalisis dengan SDS-PAGE 10% dan diwarnai dengan perak nitrat . Konsentrasi LOS diuji secara kolorimetri dan absorbansi diukur pada 595 nm. Konsentrasi LOS dalam sampel dihitung terhadap kurva yang ditarik dengan menggunakan E. coli LPS sebagai standar . Kandungan protein sampel yang diekstraksi diukur secara spektofotometri menggunakan NanoDrop (Amin A, 2017)

24. Pengukuran Kadar IFN  , IRF3 dan NFkB dengan Flowcytometri Sel dendrit diberikan staining dan disaring menggunakan filter (sentrifugasi preparasi 5 menit , kecepatan 1500 rpm ,suhu 4 o C) ditambah RBC lisis buffer  sentrifugasi dan berikan larutan PBS  tambahkan antibody terlabel untuk setiap sampel, lima tabung disiapkan dan diproses secara paralel. Pewarnaan tunggal dengan human antibody anti-NFkB p65 ditambahkan ke dalam wash tube. Pewarnaan ganda dengan human antibody anti-NFkB p65 dan anti-IFN  [7F-D3] pada wash tube. Pewarnaan ganda dengan human antibody anti-NFkB p65, anti-IFN  [7F-D3] dan anti-IRF3 [IRF35l218] pada wash tube. Seluruh sampel kemudian disimpan dalam suhu 4 o C dalam kondisi gelap dan dianalisa menggunakan flowcytometri selama 1 jam ( Biocompare, 2018) (Abcam, 2018).

25. Pemeriksaan PCR untuk menghitung RNA virus HIV Reaksi PCR ( protokol PCR konvensional ) terdiri dari tiga tahap : Denaturasi (Melting). Dilakukan pemisahan DNA untai ganda menjadi komponen untai tunggal , sehingga memungkinkan terjadinya hibridasi primer PCR untai tunggal pada sekuen targetnya . Annealing Primer PCR. Hibridasi primer PCR pada sekuens target. Temperatur annealing PCR biasanya dihitung dari suhu annealing primer hasil penghitungan matematis ( rumus : 4x (G+C) + 2 x ( A + T)). Waktu yang dibutuhkan untuk tahapan ini biasanya 15-60 detik Elongasi ( ekstensi rantai DNA). Pada tahap ini daerah yang sudah dihibridasi oleh primer akan dibuat sequens baru , dari ujung -5 ke ujung -3 dengan bantuan enzim polymerase. Suhu elongasi 72 o C selama 3 menit . Sehingga cukup waktu bagi DNA polymerase, untuk mengamplifikasi sekuens target secara komplit .

26. PBMc HIV naïf menghitung jumlah virus HIV dengan PCR, Soluble IFN  , ekspresi NFkB , IRF3   Analisa data KP2 Dipapar LOS N gonorrhea 100 ng /ml KP1 Dipapar LOS N gonorrhea 5 ng /ml KP menghitung jumlah tRNA virus HIV dengan PCR & soluble IFN  , ekspresi NFkB , IRF3   Dikulturkan 72 jam dengan menambahkan Ficoll paque , ImmunoCult ™ Dendritic Cell Culture Keterangan : KN : Kontrol negatif ( PBMc pasien sehat ) KP : Kontrol positif ( PBMc pasien HIV naif tanpa pemaparan ) KP1 : PBMc pasien HIV naif dengan pemaparan LOS N gonorhoe 50 ug /ml KP2 : PBMc pasien HIV naif dengan pemaparan LOS N gonorhoe 100 ug /ml KP3 : PBMc pasien HIV naif dengan pemaparan LOS N gonorrhoe 200 ug /ml ALUR PENELITIAN KP2 Dipapar LOS N gonorrhea 200 ng /ml

27. PBMc HIV naïf menghitung jumlah virus HIV dengan PCR, Soluble IFN  , ekspresi NFkB , IRF3   Analisa data KP2 Dipapar LOS N gonorrhea 100 ng /ml KP1 Dipapar LOS N gonorrhea 5 ng /ml KP menghitung jumlah tRNA virus HIV dengan PCR & soluble IFN  , ekspresi NFkB , IRF3   Dikulturkan 72 jam dengan menambahkan Ficoll paque , ImmunoCult ™ Dendritic Cell Culture KP2 Dipapar LOS N gonorrhea 200 ng /ml

28. Terima Kasih

29. DUMMY TABLE 1 : KARAKTERISTIK PASIEN

30. DUMMY TABLE 2 Jumlah Virus , IRF3, NFkB , NFkB Sebelum Paparan

31. DUMMY TABLE 3 Jumlah Virus , IRF3, NFkB , NFkB Sesudah Paparan