Proteínas plasmáticas. electroforesis de proteínas séricas

Laboratorio de Bioquímica. Proteínas plasmáticas. ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS SÉRICAS. Universidad de Panamá. Facultad de Medicina.

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Apuntes de Laboratorio de Bioquímica. PROTEÍNAS PLASMÁTICAS Latrodectus mactans
TEMA N° 3: PROTEÍNAS PLASMÁTICAS
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS SÉRICAS
Es una técnica de separación de moléculas bioquímicas de acuerdo a su carga neta en medio amortiguado,
utilizando una fuente de corriente directa. Se utiliza como método diagnóstico en estados patológicos donde
ocurren cambios significativos de fracciones proteicas.
 Las moléculas pequeñas que se difunden con rapidez requieren un gradiente de voltaje alto (20 V/cm o
más)
 Las proteínas a diferencia de los aminoácidos no difunden con gran rapidez y se pueden separar en
gradientes de voltajes menores.
 La posición de una proteína en el electroforetograma NO depende de la cantidad que se añada.

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PROCEDIMIENTO
Cuando una solución de una mezcla proteica se coloca entre dos electrodos, cátodo (-) y ánodo (+), las proteínas
se cargadas negativamente debido al amortiguador (en este caso, tris-barbitan pH 8,8) y migran hacia el ánodo
(+) a una velocidad que depende de:
 Carga neta
 Medio de soporte usado
 Peso molecular y tamaño de la proteína.
Realizada la separación electroforética el soporte se tiñe de un colorante (Rojo Ponceau S), el cual se une a las
proteínas detectando las bandas correspondientes a las proteínas séricas. Si el soporte es sólido, una sustancia
inerte, una tira de papel o acetato de celulosa, las secciones se cortan para proveer muestras concentradas de
fracciones proteicas individuales que componen la mezcla, y de esta manera se cuantifican.
La corrida debe durar aproximadamente 30 minutos preferiblemente (35-40 min).
 Cuando aumenta el pH (medio básico o alcalino) los residuos de aminoácidos se cargan negativamente
(se desprotonan). Pasan de –COOH a –COO
--
. Esto se debe a que las proteínas son anfóteras (pueden
actuar como ácidos o bases). De esto se concluye que la carga de una proteína dependerá del pH del
medio.
 La electroforesis en gel se utiliza para el análisis de ADN.

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MATERIALES UTILIZADOS
 Ácido acético 5%: Elimina el exceso de colorante y ayuda a fijarlo a las proteínas.
 Amortiguador Tris-barbitan pH 8,8: ofrece el campo eléctrico. Se utiliza el pH de 8,8 para cargar la
proteína negativamente. Es una fase móvil, además es reutilizable.
 Aplicador de muestras
 Cámara de electroforesis: en ella se coloca el amortiguador y el soporte
 Colorante Ponceau S: colorante rojo que tiñe las proteínas. (Es una solución de revelado)
 Espectrofotómetro
 Fuente de poder: 295 V
 Magnetos sujetadores
 Muestras y patrones
 NaOH 0,1 M
 Probetas de 200 mL
 Tiras de acetato de celulosa: es el soporte (sólido)
 Vasos químicos de 600 mL
CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles son las funciones de las proteínas plasmáticas?
a. Mantener la presión oncótica
b. Transporte de hormonas
c. Formación de coágulos
d. De defensa

2. ¿Cuáles son las principales proteínas plasmáticas?
a. Albúmina
b. Globulinas (α, β, ɤ)
c. Prealbumina
* Es de baja concentración en el suero y ejerce poca influencia sobre el patrón normal de
electroforesis)

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3. Si se usa suero en lugar de plasma ¿Cuál será la diferencia en el electroforetograma?
El plasma contiene fibrinógeno (globulina β2) y el suero carece de ella. Al utilizar plasma en la
electroforesis la región correspondiente a β2 será más oscura.

4. Considerando que los P.I. de las proteínas son: Albúmina (4,7); alfa1 globina (2,7); alfa2 globina (4,4);
beta globina (5,0); gamma (6,2 – 7,3) de fracciones de proteínas séricas. Explique ¿Por qué se utiliza
el amortiguador Tris-Barbital pH 8,8 para realizar la separación?
Se utiliza el Tris –Barbital por que a un pH=8,8, las proteínas obtienen una carga negativa (se
desprotonan), de esta manera al colocarles electrodos en los extremos de la cámara electroforética las
proteínas se desplazaran del cátodo (-) al ánodo (+). Si las proteínas están es su estado zwitterión (estado
neutro) no se desplazaran hacia ningún polo. Por esto las proteínas se colocan en un medio alcalino.

5. Los porcentajes de fracciones de proteínas séricas determinados luego de la densitometría son los
siguientes:
Albúmina 52, 6 %
Globulina alfa 13,2 %
Globulina alfa 212,4%
Globulina beta 11,2%
Globulina gamma 17, 1%
El suero tiene una concentración de 7 g/dL. Calcule los g/dL correspondientes a cada fracción.
Se utiliza el factor de conversión
7
??????
????????????
100

Albúmina=
(7
g
dL
)(52,6 %)
100 %
= 3, 682
g
dL

Globulina alfa 1=
(7
g
dL
)(3,2 %)
100 %
= 0, 224
g
dL

Globulina alfa 2=
(7
g
dL
)(12,4 %)
100 %
= 0, 868
g
dL

Globulina beta=
(7
g
dL
)(11,2 %)
100 %
= 0, 784
g
dL

Globulina gamma=
(7
g
dL
)(17,1 %)
100 %
= 1, 197
g
dL

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DETERMINACIÓN CUANTI TATIVA DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS
Algunas formas de cuantificar proteínas son:
 Absorción UV
 Tribidimétrico
 Biuret
 Kjedahl (se usa en alimentos)

BIURET
 Es un compuesto de sulfato de cobre, contiene el ion cobre
Cu
2+
(es mucho más alcalino).
 Identifica proteínas.
 Su color es turquesa, al añadirse a una sustancia, que entre
más enlaces peptídicos tenga se torna un color más morado.


REQUISITOS PARA CONS IDERAR UNA PROTEÍNA PLASMÁTICA
1. Ser secretadas activamente a la sangre
2. NO derivar de lesiones, ni alteraciones de tejidos o células
3. Ejercer una función en el sistema vascular
4. Presentar mayor concentración en el plasma que en otros tejidos

SITIOS DE BIOSÍNTESIS
La principal síntesis de proteínas se da en el HÍGADO, EXCEPTO la síntesis de inmunoglobulinas, que son
producidas por células plasmáticas derivadas de los linfocitos B de la médula ósea.

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GLOSARIO
1. Suero: sangre sin elementos formes o células y proteínas implicadas en la coagulación (fibrina y
fibrinógeno).
2. Plasma: líquido amarillento transparente que se forma al extraer sangre y dejarla coagular.
3. Electroforetograma: tira con una electroforesis teñida (desarrollada) donde se observa distintas
bandas teñidas que indican el patrón de migración de las proteínas.
4. Proteinograma: representación gráfica de la distribución de las distintas fracciones de las
proteínas plasmáticas. Se basa en la separación de las proteínas en función de su masa y su carga,
tras someterlas a un campo eléctrico. Es una representación densitométrica de las bandas
obtenidas tras someter al suero a electroforesis y es complementario a la determinación de
proteínas totales en suero.
5. Normoproteinemia o euproteinemia: concentración normal de las proteínas sanguíneas 6-8
g/dL.
6. Hipoproteinemia: concentración disminuida de proteínas sanguíneas. Ejemplo,
hipoalbuminemia <3g/dL. Algunos mecanismos que la producen son:
 Malnutrición proteínica
 Defectos en las síntesis de proteínas. Ejemplo cuando hay daño hepático (hepatopatía),
insuficiencia hepática avanzada, hepatitis severa, cirrosis avanzada, cáncer.
 Pérdidas a nivel renal (síndrome nefrótico), gastrointestinales (diarrea crónica), piel
(quemaduras extensas y ciertas enfermedades de la piel).
7. Hiperproteinemia: concentración aumentada de proteínas sanguíneas. Por ejemplo,
concentración de globulinas >10 g/dL
 Hemoconcentración
o Cáncer (Ejemplo, mieloma múltiple)
o Enfermedades inmunológicas
o Tumores
8. Proteinuria: presencia de proteínas en la orina. Proteinuria normal, hasta 150 mg de proteína en
orina durante 24 horas.
9. Síndrome: conjunto de signos y síntomas.
10. Hipoalbuminemia: disminución de niveles séricos de albúmina por debajo de 3,5 g/dL.

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ALBUMINA
 Principal proteína del cuerpo humano.
 Varias hormonas, drogas y otras moléculas viajan unidas a ella por el torrente sanguíneo para
luego ser liberado.
 Su disminución (hipoalbuminemia) disminuye la presión oncótica del plasma provocando
extravasación del plasma y edema.
LAS ALTERACIONES DE LA ALBUMINA PUEDEN S ER CAUSADAS POR:
 Síndrome nefrótico (↑ eliminación de albúmina)
 Enfermedad hepática (↓ disminuye síntesis de albumina)
 Desnutrición (↓ disminuye síntesis de albumina)
La hipoproteinemia es más frecuente que la hiperproteinemia. NO existen patologías que produzcan
hiperalbuminemia, pero sí puede haber un aumento relativo de las proteínas totales por
hemoconcentración. Hay hiperglobulinemias cuando la concentración de proteínas totales es igual o
mayor a 10 g/dL. Por ejemplo, mieloma múltiple (mieloma= tumor compuesto por células que
normalmente se encuentran en la médula ósea).

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En el síndrome nefrótico hay daño renal en la membrana basal, por eso deja pasar las proteínas. Se
produce hinchazón debido a que el líquido pasa al compartimiento intersticial (LIS).
Criterios para diagnosticar el síndrome nefrótico:
 Albúmina sérica= 3 g/Dl ó menos
 3 g ó más de proteínas en la orina de 24 horas.

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PROCEDIMIENTO
1. Prepare los tubos de ensayo según lo indica el siguiente cuadro. Primero añadir la cantidad más
pequeña en el tubo de ensayo.
Tubo blanco Tubo patrón Tubo muestra
3mL Biuret
3mL Biuret 3mL Biuret
60µL Agua
60µL Patrón 60µL Suero
[Patrón]= 0,36 ; 7 g/dL
2. Mezcle los reactivos (preferiblemente en el vortex) y deje reposar 15 minutos (preferiblemente
incubar a temperatura ambiente)
3. Lea la absorbancia de la muestra a 545 nm.. A aproximadamente 545 nm se obrservan las soluciones
de color rojo. En este caso se lee la solución porque el color morado (azul+rojo) lee la parte roja de la
solución. En realidad en la reacción se produce una coloración roja, la cual reacciona con el azul y se
produce el color morado.
*El tubo blanco debe quedar de color turquesa debido a que NO hay proteínas
*El tubo patrón debe cambiar de color
4. Obtenga la concentración de cada muestra con la siguiente fórmula
RECORDANDO: Los tubos de lectura está fabricados de cuarzo, se rayan con gran facilidad y por lo tanto
SÓLO se deben lavar con agua. NO se le debe poner tape ni ningún otro tipo de cinta adhesiva para
identificar las muestras. TAMPOCO se deben colocar en gradillas de madera o metal, sino en gradillas
plásticas para evitar que los tubos se rayen.
NOTA: En el suero NO hay fibrinógeno, pero en el plasma SÍ hay fibrinógeno.
RESULTADOS
[&#3627408448;&#3627408482;&#3627408466;&#3627408480;&#3627408481;&#3627408479;&#3627408462;]=
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??????&#3627408463;??????&#3627408462;&#3627408481;&#3627408479;ó??????
??????[??????&#3627408462;&#3627408481;&#3627408479;ó??????]
Muestra 1
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0,38
0,36
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&#3627408448;&#3627408482;&#3627408466;&#3627408480;&#3627408481;&#3627408479;&#3627408462;= 7,39 ??????/&#3627408465;&#3627408447;
Muestra 2
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Muestra 3
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Muestra 4
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0,36
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Muestra 5
&#3627408448;&#3627408482;&#3627408466;&#3627408480;&#3627408481;&#3627408479;&#3627408462;=
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0,36
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Muestra 6
&#3627408448;&#3627408482;&#3627408466;&#3627408480;&#3627408481;&#3627408479;&#3627408462;=
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&#3627408448;&#3627408482;&#3627408466;&#3627408480;&#3627408481;&#3627408479;&#3627408462; 6=
0,39
0,36
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&#3627408448;&#3627408482;&#3627408466;&#3627408480;&#3627408481;&#3627408479;&#3627408462; 6= 7,58??????/&#3627408465;&#3627408447;



Mas vosotros sois linaje escogido, real sacerdocio, nación santa, pueblo adquirido por Dios, para que
anunciéis las virtudes de aquel que os llamó de las tinieblas a su luz admirable;
1 Pedro 2:9