Protein isolation techniques of beans using different methods.pdf

GFNFGNFG

1. Protein isolation techniques of beans using different methods

Abstrak
ren yang berkembang saat ini adalah semakin banyak masyarakat yang memilih untuk
mengurangi konsumsi protein hewani karena alasan kesehatan, dan menggantinya dengan
protein nabati untuk memenuhi asupan proteinnya. Protein yang diperoleh dari kacang-
kacangan dapat dipisahkan dari komponen lain yang disebut konsentrat dan isolat protein.
Teknik isolasi protein kacang-kacangan dapat menggunakan metode ekstraksi dengan
pelarut asam basa, metode salting out dengan pelarut garam, dan modifikasi dengan
hidrolisis enzimatik. Pembahasan ini dapat melihat secara jelas perbedaan atau
persamaan karakteristik isolat/konsentrat protein kacang-kacangan dengan metode isolasi
yang berbeda. Titik isoelektrik dan kelarutan protein menjadi perhatian utama untuk
memaksimalkan protein dari biji yang akan diisolasi. Penggunaan enzim protease dapat
bermanfaat untuk memutus ikatan peptida sehingga isolat/konsentrat protein kacang-
kacangan menjadi mudah dicerna.

I. Intruduction

Tren yang berkembang saat ini adalah semakin banyak masyarakat yang memilih
mengurangi konsumsi hewani
protein karena alasan kesehatan, dan menggantinya dengan protein nabati
untuk memenuhi asupan proteinnya.
Di Indonesia, secara keseluruhan terjadi peningkatan konsumsi protein per
penduduk Indonesia sejak tahun 2013–2017 [1]. Protein yang dikonsumsi
sebagian besar berasal dari protein nabati seperti sereal, umbi-umbian, sayur
mayur, kacang-kacangan, dan buah-buahan. Penggunaan kedelai sebagai
alternatif raja protein nabati kemungkinan akan terus berlanjut dalam beberapa
waktu ke depan.
Namun, beberapa peneliti telah berhasil mengisolasi protein dari
Sumber protein nabati lokal Indonesia seperti kacang hijau [2], kacang merah
[3], kecipir [4], biji lamtoro gung [5], dan koro benguk [6].
Protein yang diperoleh dari kacang-kacangan dapat dipisahkan dari komponen
lain yang disebut konsentrat protein
dan mengisolasi. Konsentrat mempunyai kandungan protein minimal 70%,
sedangkan isolat protein harus mengandung

2. lebih dari 90% protein berasal dari bahan kering. Konsentrat atau isolat protein
kacang diperoleh dengan cara
menyimpan protein pada titik isoelektriknya. Beberapa peneliti menetapkan titik
isoelektriknya pada pH 3,7–5,5 untuk menghasilkan hasil dan karakteristik yang
berbeda [7–9]. Selain mengatur titik isoelektrik, penggunaan variasi suhu dan
waktu ekstraksi [9] dan jenis asam [10] dalam teknik isolasi protein juga
menentukan karakteristik fungsional dan sifat isolat protein yang dihasilkan.


Teknik isolasi protein kacang-kacangan dapat menggunakan metode ekstraksi
dengan pelarut asam basa [11], metode salting out dengan pelarut garam [12],
dan modifikasi dengan hidrolisis enzimatik [13]. Variasi protein
Teknik isolasi dilakukan untuk menghasilkan karakteristik terbaik dari
isolat/konsentrat protein tersebut, sehingga dapat diterapkan pada berbagai
sistem pangan. Enzim protease yang ditambahkan pada proses isolasi protein
dapat memecah struktur protein secara lebih sederhana (oligopeptida) dengan
cara memutus ikatan peptida.
Struktur protein yang sederhana akan meningkatkan daya cerna protein dalam
sistem pangan. Protease digunakan untuk meningkatkan kualitas nutrisi dan
sensorik protein, serta fungsi protein [14]. Oleh karena itu, penulis tertarik untuk
membahas teknik isolasi protein kacang-kacangan dengan berbagai metode
yang berbeda. Manfaat lain dari pembahasan ini adalah dapat melihat secara
jelas perbedaan atau persamaan karakteristik isolat/konsentrat protein kacang-
kacangan dengan metode isolasi yang berbeda.

2. Protein isolation techniques of beans using acid-base extraction methods

Isolasi protein pada prinsipnya didasarkan pada dua proses utama yaitu
ekstraksi dan pengendapan protein [4,6,9]. Isolat protein berbahan kacang-
kacangan lokal dapat dibuat dengan metode ekstraksi/hidrolisis asam dan
sentrifugasi, untuk melengkapi protein dengan komponen lain. Pemisahan
protein menggunakan pelarut
asam untuk mendeposisi protein pada pH isoelektrik. Beberapa penelitian
isolasi protein kacang-kacangan dengan metode ekstraksi asam basa disajikan
pada tabel 1

Pemisahan protein menggunakan pelarut asam untuk mendeposisi protein pada
pH isoelektrik. Pemilihan suasana asam sebagai pH selama ekstraksi

3. disebabkan oleh fakta bahwa sebagian besar asam amino akan bermuatan
positif atau negatif. Muatan semacam ini akan saling tolak menolak sehingga
menyebabkan interaksi minimal
antara residu asam amino yang berarti akan meningkatkan kelarutannya selama
ekstraksi. Bahan dilarutkan dalam larutan HCl encer hingga pH 4–5 dan
dihidrolisis, kemudian campuran disentrifugasi sehingga endapan dan
berbentuk cair, sedimen sebagian besar mengandung komponen protein dan
non-protein yang terlarut dalam cairan, endapan dinetralkan menggunakan
NaOH encer hingga pH 6–8 kemudian disaring, dikeringkan dan dianalisis isolat
proteinnya.

Pada titik isoelektriknya, suatu protein menunjukkan nilai tolakan elektrostatik
yang paling kecil, oleh karena itu
protein akan memiliki kelarutan paling rendah dan pada akhirnya akan
mengendap. Sifat-sifat tersebut sangat berguna dalam proses kristalisasi
protein. Ketika pH larutan mencapai titik isoelektrik tertentu, suatu protein akan
mengendap dan terpisah dari protein lain yang mempunyai titik isoelektrik
berbeda. Prinsip itu digunakan dalam memisahkan satu protein dari protein
lainnya. Perbedaan titik isoelektrik pada protein adalah
berdasarkan perbedaan asam penyusunnya. Setiap asam amino mempunyai ciri
khas tersendiri yang membedakannya
antara satu sama lain. Ada asam amino yang bermuatan positif, negatif, atau
netral
Jika beberapa asam amino bergabung membentuk protein, maka setiap muatan
asam amino akan memberikan kontribusi terhadap total muatan protein yang
disusunnya. Pada pH rendah, asam amino akan bermuatan positif, sedangkan
pada pH tinggi
pH mereka akan bermuatan negatif. Pada pH 4,0–5,0 (pH isoelektrik), asam
amino akan berada dalam bentuk dipolar atau
di negara bagian Zwitter. Dalam keadaan ini kelarutan protein paling kecil
sehingga protein akan menggumpal dan
menetap

5. Nilai titik isoelektrik suatu protein memberikan pengaruh penting terhadap sifat
biokimia protein yang dapat digunakan dalam proses pemurnian dan
elektroforesis. Di dalam
elektroforesis, jika pH larutan buffer lebih besar dari titik isoelektrik maka
molekul protein akan bermigrasi menuju kutub positif. Sedangkan jika pH buffer
lebih rendah dari titik isoelektrik, maka molekul protein akan bermigrasi menuju
kutub negatif. Jika pH buffer sama dengan titik isoelektrik, maka protein akan
tetap pada tempatnya atau tidak bermigrasi sama sekali

Salah satu yang paling penting adalah kelarutan protein [18]. Protein isolat
dibuat dengan mendepositkan protein pada titik isoelektriknya. Koagulasi dan
pengendapan dilakukan dengan cara melepaskan dan melepaskan asam,
hingga mencapai pH tertentu (pH isoelektrik), terjadi penggumpalan dan
endapan (protein) dikeluarkan dari cairan (pati). Kacang merah dan kacang hijau
mempunyai titik isoelektrik pada pH 4,4. Titik isoelektrik merupakan suatu nilai
pH dimana suatu protein mempunyai jumlah muatan negatif sama dengan
jumlah muatan positifnya, atau dengan kata lain suatu protein bersifat netral
atau tidak bermuatan. Pada nilai pH yang lebih rendah dari titik isoelektrik,
protein mempunyai muatan positif, dan pada nilai pH lebih besar dari titik
isoelektrik maka protein tersebut akan bermuatan positif
bermuatan negatif

Jenis asam dan filtrat menentukan kemampuan untuk mengentalkan protein,
dan endapan protein
terbentuk. Asam sitrat merupakan asam lemah, mempunyai kemampuan
koagulasi, dan menghasilkan kandungan protein yang rendah,
rendah, 54,73% - 61,94%. Sehingga hanya dapat menyebabkan denaturasi
protein dalam jumlah yang lebih kecil dengan keelektronegatifan yang rendah.
Penambahan asam asetat pada protein dapat menyebabkan denaturasi protein.
Hal ini terjadi karena asam asetat tidak dapat terionisasi sempurna dengan sifat
elektronegativitasnya yang lebih kecil dibandingkan asam klorida. Penambahan
asam asetat dengan pH 4,5 memberikan hasil yang optimal terhadap
kandungan protein isolat kacang hijau. Penambahan asam klorida (HCl) yang
merupakan asam kuat mengakibatkan adanya ion H+ berlebih yang
menunjukkan adanya kekeruhan dan semakin banyaknya endapan di dalam air.
proses pemanasan

6. Pemisahan isolat/konsentrat protein kacang-kacangan melalui metode ekstraksi
diawali dengan
mengekstraksi protein dalam larutan basa. Larutan basa yang lebih kuat akan
mengekstrak lebih banyak protein. Hasil perlakuan berupa ekstrak yang
mengandung protein terlarut dan residu yang sebagian besar berupa
karbohidrat. Tahap sentrifugasi dilakukan untuk memisahkan keduanya. Maka
langkah selanjutnya adalah
untuk mengatur pH menjadi pH isoelektrik dengan penambahan asam dan akan
menghasilkan endapan protein yang terpisah dari cairan. Endapan yang
dihasilkan dicuci dan dikeringkan untuk memperoleh isolat/konsentrat protein.
Parameter terbaik dalam isolasi protein kacang hijau adalah perbandingan
cairan 10%, suhu ekstraksi 31,74, pH ekstraksi 8,97, pH pengendapan 4,4,
waktu ekstraksi 33,24 menit.

Sifat fisikokimia (WHC, OAC, kelarutan, emulsifikasi dan stabilitas emulsi)
MPI dan albumin menunjukkan bahwa MPI lebih unggul dan dapat dianggap
sebagai protein alami yang berkualitas tinggi. Glu adalah komponen utama
asam amino dalam MPI dan albumin, masing-masing sekitar 16,21% dan
20,78%. Jumlah Asp, Leu dan Phe yang relatif lebih besar juga ditunjukkan
dalam hasil tersebut. Sebaliknya, kandungan val paling rendah pada MPI dan
albumin, yaitu sekitar 0,14%,
masing-masing 0,10%, diikuti oleh asam amino yang mengandung sulfur


3. Protein isolation techniques with enzymatic hydrolysis methods
Hidrolisis didefinisikan sebagai pemecahan banyak ikatan menjadi ikatan yang
lebih kecil dan sederhana. Dalam hidrolisis, ikatan antara dua atom terputus.
Ikatan peptida yang membangun rantai polipeptida dalam protein dapat
dihidrolisis menggunakan asam, basa, atau enzim. Pemutusan ikatan peptida
dengan menggunakan enzim merupakan suatu proses hidrolisis biokimia yang
akan menghasilkan produk reaksi berupa satu molekul yang mempunyai gugus
karboksil dan molekul lain yang mempunyai gugus amina. Penambahan enzim
protease pada proses pembuatan protein
Isolasi dapat memecah protein menjadi oligopeptida sehingga meningkatkan
jumlah oligopeptida di dalamnya
produk HPF.

7. Teknik isolasi protein kacang-kacangan yang dilakukan dengan hidrolisis
enzimatik sedikit berbeda dengan
proses isolasi melalui ekstraksi pengendapan. Kacang digiling, lalu dicampur
dengan air sulingan sesuai perbandingan bahan dan air tertentu. Kemudian,
pindahkan campuran tersebut ke dalam penangas air
sambil diaduk terus menerus dan diatur pH campurannya menggunakan NaOH.
Enzim protease ditambahkan ke dalam campuran dan mempertahankan suhu
hidrolisis selama proses hidrolisis enzimatik. Kemudian menonaktifkan enzim
dengan menaikkan suhu hingga 100 oC selama 5 menit. Campuran
disentrifugasi
pada 4.500 rpm selama 30 menit untuk menghasilkan supernatan dan lumpur.
Endapan dianalisis kandungan proteinnya dengan metode Kjeldahl

Hidrolisis didefinisikan sebagai pemecahan banyak ikatan menjadi ikatan yang
lebih kecil dan sederhana. Dalam hidrolisis, suatu ikatan
antara dua atom dipecah. Ikatan peptida yang membangun rantai polipeptida
pada protein dapat diputuskan (dihidrolisis) dengan menggunakan asam, basa
atau enzim. Pemecahan ikatan peptida pada kondisi asam atau basa kuat
merupakan proses hidrolisis kimia dan pemecahan ikatan peptida
menggunakan enzim merupakan proses hidrolisis biokimia. Reaksi hidrolisis
peptida akan menghasilkan produk reaksi berupa satu molekul bergugus
karboksil dan molekul lain bergugus amina. Penambahan enzim protease pada
proses isolasi protein kacang tanah diharapkan dapat meningkatkan jumlah
oligopeptida sehingga produk HPF menjadi mudah dicerna [20].
Oligopeptida Kedelai (SOP) menunjukkan stabilitas yang kuat untuk pencernaan
proteolitik oleh pepsin dan
trypsin. Kemiripan kromatogram SOP sebelum dan sesudah pencernaan pepsin
dan trypsin adalah 99,1% dan 94,9% yang dianalisis dengan perangkat lunak
evaluasi, menunjukkan bahwa tidak terjadi degradasi SOP yang jelas selama
pencernaan in vitro. Hasil ini menunjukkan bahwa SOP tidak dapat dihidrolisis
menjadi asam amino bebas
dalam saluran pencernaan dan karenanya disimpan dalam bentuk bioaktif
setelah diberikan sebagai bahan makanan. SOP secara signifikan menghambat
peroksidasi lipid dalam sistem oksidasi asam linoleat (IC50 0 1,2 ± 0,09 mg/mL).
SOP memiliki aktivitas penghambatan enzim konversi angiotensin I (IC50 0 1,1 ±
0,06 mg/mL), dan efek antihipertensi pada tikus hipertensi spontan dengan
dosis 200 mg/kg [20]. Telah banyak penelitian tentang isolasi protein dengan
metode hidrolisis enzimatik yang disajikan pada tabel 2

8. Tepung kacang buangan (DBM) mengandung protein lebih tinggi (± 40%)
sehingga dapat digunakan sebagai sumber
protein/isolasi protein. Penelitian terkait pemanfaatan protein kacang-kacangan
yang berfokus pada kajian sifat fisiko-kimia, fungsi, dan alergi telah dilakukan.
Hanya ada sedikit penelitian yang meneliti penggunaan protein dalam makanan
manusia. Peptida bioaktif telah ditemukan dari hasil hidrolisis enzimatik pada
beberapa protein makanan antara lain peptida terikat mineral, peptida
imunomodulator, peptida antibakteri, peptida antitrombotik, dan peptida
antihipertensi [21].
Oligopeptida fungsional mengacu pada peptida yang diproduksi dengan teknik
enzimolisis atau fermentasi mikroba dan dengan bahan utama tepung kacang
tanah atau protein kacang tanah, dengan massa molekul 5000 Da atau kurang.
Hasil analisis asam amino menunjukkan bahwa kandungan asam amino bebas
oligopeptida fungsional kacang tanah adalah 66,4 mg/g. Dapat dilihat bahwa
produk tersebut sebagian besar berupa oligopeptida dengan asam amino yang
lebih rendah
konten, meskipun hidrolisis enzimolisis kompleks tinggi. Dengan menggunakan
metode enzimatik untuk menghidrolisis protein dalam kondisi ringan,
polipeptida yang dihasilkan memiliki nilai gizi yang sangat tinggi. Oligopeptida
dengan massa molekul lebih rendah dari 1000 Da dapat dengan mudah diserap
oleh tubuh manusia dan memiliki aktivitas fungsional yang kuat. Hal ini
menunjukkan bahwa proses hidrolisis yang dipilih untuk pembuatan
oligopeptida harus memaksimalkan DH protein sekaligus menjamin hasil
oligopeptida yang tinggi.

Spesies enzim adalah salah satu faktor yang mempengaruhi paling penting
dalam enzimolisis. Lima spesies
protease dipilih untuk hidrolisis protein kacang tanah dalam sebuah percobaan.
Di bawah kondisi yang direkomendasikan untuk setiap protease, TCA-NSI dari
protease netral 1398, FM, Protamex, dan N120 p dalam hidrolisis protein kacang
tanah adalah 45–53% dan DH adalah 9,4–12,1%; sedangkan TCA-NSI dan DH
alkalase pada hidrolisis protein kacang tanah masing-masing sebesar 63,80 ±
0,47% dan 15,01 ± 0,88%, jauh lebih tinggi dibandingkan
protease lainnya (p <0,01). Pengaruh pH pada reaksi enzimatik terutama
tercermin dalam pengaruhnya terhadap aktivitas enzim. Percobaan telah
menganalisis perubahan TCA-NSI dan DH ketika pH berubah dari 6 menjadi 9.
Dengan meningkatnya pH, TCA-NSI dan DH meningkat dengan cepat. Ketika pH
sistem mencapai 8,0, TCA-NSI dan DH masing-masing mencapai 68,61 ± 1,23%

9. dan 16,36 ± 0,33%; ketika pH sistem mencapai 9,0, TCA-NSI dan DH lebih
rendah dibandingkan pada pH 8,0, dengan penurunan sebesar 1,59% dan
masing-masing 0,84%.

10. Solasi protein kacang-kacangan dapat dilakukan dengan metode ekstraksi asam
basa yang dikombinasikan dengan enzimatik
hidrolisis. Titik isoelektrik dan kelarutan protein menjadi perhatian utama untuk
memaksimalkan protein dari biji yang akan diisolasi. Penggunaan enzim
protease dapat bermanfaat untuk memutus ikatan peptida sehingga
isolat/konsentrat protein kacang-kacangan menjadi mudah dicerna.