Proteinas recombinantes, Insulina recombinante

Trabajo expuesto que aborda el tema de ADN recombinante, insulina recombinate.

1. UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS Universidad del Perú, Decana de América FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA EAP DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA PROTEÍNAS RECOMBINANTES: INSULINA RECOMBINANTE Chuco Sutta Luis Alberto Domínguez Parco Sandy Espilco Villarruel Guadalupe Evangelista Tenorio Eduardo Hualan Sandoval Luis Félix 28 de Noviembre 2013

2. DEFINICIÓN DE ADN RECOMBINANTE

3. INGENIERÍA GENÉTICA Técnicas que modifican las características hereditarias de un organismo en un sentido predeterminado mediante la alteración de su material genético La formación de nuevas combinaciones de genes por el aislamiento de un fragmento de DNA, la creación en él de determinados cambios y la reintroducción de este fragmento en el mismo organismo o en otro. Cuando los genes nuevos son introducidos en las plantas o animales, los organismos resultantes pasan a llamarse transgénicos. Es el conjunto de métodos y técnicas que permiten el acceso y la manipulación del DNA

4. 1953 Watson & Crick determinación de estructura del ADN 1966 Nirenberg, Ochoa y Khorana elucidaron Código Genético 1967 Wise y Richardson aislaron ADN ligasa 1973 Stanley Cohen y H. Boyer pusieron ADNr en bacterias además de desarrollar las técnicas de clonaje de ADN en laboratorios 1982 Tabaco, la primera planta modificada genéticamente 1983 p almiter y brinster produjeron un ratón transgénico . 2000 26 de junio se presenta 90% borrador genoma humano 2001 26 de enero borrador genóma del arroz Oriza sativa RESEÑA HISTÓRICA

5. Ingeniería Genética Clonación Producción de Proteínas humanas Terapia Génica Síntesis de Nuevas Proteínas Nuevos Antibióticos Nuevas Plantas y Animales

6. BENEFICIOS FUTUROS DEL DNA RECOMBINANTE La terapia por reemplazo de genes para el tratamiento de enfermedades hereditarias. La obtención de evidencias mediante huellas de DNA en casos de crímenes

7. CONSEGUIR PRODUCTOS AGRÍCOLAS MÁS DURADEROS Y NUTRITIVOS. Alterar los genomas de los seres vivos para dotarles de alguna cualidad que no tenían (plantas resistentes a heladas, frutas que maduran antes, cultivos que crecen más,...). ARROZ con altos niveles de tolerancia a diferentes condiciones ambientales de estrés. Se insertaron dos genes fusionados de trehalosa . Los genes de trehalosa permiten la producción de arroz aún si está estresado por frio, sequía o altos niveles de salinidad e incrementa la producción en 20%. El azúcar trehalosa ayuda a estabilizar moléculas biológicas: lípidos, enzimas y otras proteínas, en organismos en condiciones de estrés. La composición química de los granos no cambia.

8. ADN RECOMBINANTE PROPÓSITO Enzimas Restricción Cortan ADN en puntos específicos, hacen fragmentos de ADN ADN Ligasa Une fragmentos de ADN Vectores Virus o fagos: llevan ADN a las células y aseguran replicación Plásmidos Clase común de vector Marcadores Genéticos Identifican a las células que han sido transformadas Gel Electroforesis Para separar fragmentos de ADN Secuenciación ADN Para leer la secuencia de bases de un segmento de ADN

9. ADN RECOMBINANTE Creación de nuevas combinaciones de segmentos o de moléculas de ADN que no se encuentran juntas de manera natural. 1 2 3

10. 1) CORTE ESPECÍFICO DEL ADN Los fragmentos de ADN se generan utilizando unas enzimas denominadas ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN , que reconocen y cortan las moléculas de ADN por secuencias nucleotídicas específicas.

11. ENZIMAS DE TIPO II: Eco RI: Reconoce y se une a la secuencia palindrómica GAATTC Enzima desoxinucleotidil transferasa terminal para crear colas complementarias mediante la adición de fragmentos de poli- dA y de poli- dT

12. 2) INSERCIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN Esta inserción se realiza en  vectores de clonado , que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras. Son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras.  PLÁSMIDOS BACTERIÓFAGOS CÓSMIDOS

13. 3) MÉTODOS DE INTRODUCCIÓN DEL VECTOR Consiste en la captación por parte de una célula receptora de una molécula o fragmento de DNA desnudo y la incorporación de esta molécula al cromosoma del receptor en una forma heredable. En la transformación natural, el DNA procede de una bacteria donadora. TRANSFORMACIÓN

14. TRANSDUCCIÓN 1) La partícula viral se fija a un sitio receptor específico de la superficie bacteriana. 2) En la segunda, el material genético del virus que con frecuencia es DNA bicatenario , penetra entonces en la célula. Tras la adsorción y la penetración, el cromosoma viral obliga a la bacteria a fabricar ácidos nucleicos y proteínas del virus. 3) La tercera fase comienza tras la síntesis de los componentes virales. Se ensamblan fagos a partir de estos componentes. El proceso de ensamblaje puede ser complejo, pero en todos los casos el ácido nucleico se introduce (“se empaqueta”) en la cápside proteica viral. • Finalmente, los virus maduros son liberados al medio mediante la lisis de la célula huésped .

15. PROTEÍNAS RECOMBINANTES

16. INSULINA RECOMBINANTE

17. Historia Hasta 1983 toda la insulina utilizada para el tratamiento de la diabetes era extraída de páncreas de porcino y bovino, sin embargo, el uso prolongado de este tipo de insulina provoca, en algunos individuos, una respuesta inmune. Además la disponibilidad de páncreas de los animales mencionados es limitada, por lo que es deseable la obtención y uso de insulina humana.

18. El objetivo sería conseguir que los genes humanos, responsables de la producción de la hormona insulina se expresaran en la bacteria. De este modo, las bacterias producirían insulina a grandes velocidades, pudiéndose escalar el modelo en tanques de fermentación para la obtención de grandes cantidades .

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20. Existen dos rutas para la obtención de insulina humana utilizando microorganismos modificados por ingeniería genética: Una de ellas, consiste en producir por separado ambas cadenas para , posteriormente, asociarlas químicamente. La otra se basa en la producción de proinsulina que es procesada hasta insulina madura mediante métodos enzimáticos.

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22. Historia - Disponibilidad de páncreas de los animales mencionados es limitada, por lo que es deseable la obtención y uso de insulina humana. -Regular la diabetes mellitus ( Deficiencia de insulina ), la más común es la de tipo 2 (No insulinodependiente ) se puede controlar con dieta equilibrada .

23. LA ESTRUCTURA DE LA INSULINA Sir Frederick Grant Banting descubrió la insulina en el año de 1921 teniendo como antecedentes los trabajos de Shafer . Dilucidación de su estructura, proeza realizada en 1954 por Frederick Sanger y sus colaboradores de la Universidad de Cambridge. La insulina es una molécula muy pequeña: sólo contiene 254 átomos de carbono, 337 de hidrógeno, 65 de nitrógeno, 75 de oxígeno y 6 de azufre. 24 aminoácidos posibles, 17 están presentes en la insulina. 

24. Secuencia crucial Un solo cambio en la posición de un aminoácido dentro de la molécula puede hacer cambiar la funcionalidad de la proteína.  Sanger utilizó el método tradicional para estudiar grandes moléculas: romperlas en fragmentos y colocarlas nuevamente juntas como las piezas de un rompecabezas. La rotura completa de la molécula sirve para identificar los aminoácidos, pero no dice nada acerca de como están ordenados. 

25. El objetivo sería conseguir que los genes humanos, responsables de la producción de la hormona insulina se expresaran en la bacteria. De este modo, las bacterias producirían insulina a grandes velocidades, pudiéndose escalar el modelo en tanques de fermentación para la obtención de grandes cantidades.

26. PRODUCCION DE INSULINA RECOMBINANTE Biólogos moleculares aislaban los genes responsables de la producción del proinsulina y pronto la industria farmaceútica vislumbró la posibilidad de obtener insulina humana por clonación de genes en bacterias.  La estrategia seguida para la producción de insulina humana recombinante fué la siguiente:

27. INSULINA DE TIPO HUMANO Proviene de bacterias alteradas por medio de ingeniería genética que producen una insulina muy similar a la de los humanos, de aquí que se le denomine insulina humana o recombinante INSULINA DE TIPO ANIMAL Esta se puede obtener por extracción del páncreas de diferentes especies animales en particular la bovina (buey) o la porcina (cerdo). ( Lerman : 1994) BENEFICIOS Menos inmunológicas Son física y químicamente equivalente a la insulina pancreática humana Produce menos formación de anticuerpos. Su producción es más rápida y se genera en grandes cantidades. Permite alargar la supervivencia en forma considerable, Bajo costo ya que no esta patentada, Adecuado control para los pacientes que no toleran la insulina transgénica No tienen problemas en su administración puesto que se adapta fácilmente a su cuerpo. CONSECUENCIAS Causa atrofia (desgaste de los tejidos grasos debajo de la piel) en los sitios de inyección dejando un ligero hundimiento, la hipertrofia (hinchazón del tejido graso) abultamiento en las zonas de inyección. El costo de esta es más caro por las empresas que la han patentado. Puede provocar alergias causando comezón en el lugar de la inyección, por que la estructura química de esta es diferente a la humana y por lo tanto el sistema inmunológico no la reconoce como una proteína propia, también provoca lipodistrofia (trastorno en el metabolismo de las grasas) o formación de anticuerpos.

28. GRACIAS POR SU ATENCIÓN