Qualificação mestrado- Thalita da Silva Ramos (versão final).pptx

Mestrado

1. DETERMINAÇÃO DE PARABENOS EM SORO, URINA E SALIVA DE MULHERES VISANDO A AVALIAÇÃO DA EXPOSIÇÃO ATRAVÉS DO USO DE HIDRATANTES CORPORAIS Discente : Thalita da Silva Ramos Orientadora : Profa. Dra. Isarita Martins Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Universidade Federal de Alfenas Exame de Qualificação apresentado ao PPGCF- Unifal -MG

2. INTRODUÇÃO 1 Contaminantes emergentes Componentes da formulação Plastificantes Pesticidas Fontes de exposição PHPCPs Alimentos Medicamentos Hormônios sintéticos SONI, M. G.; CARABIN, I. G.; BURDOCK, G. A. Safety assessment of esters of p-hydroxybenzoic acid (parabens). Food and Chemical Toxicology , v. 43, n. 7, p. 985–1015, 2005. FRANSWAY, A. F. et al. Paraben Toxicology . Dermatitis , v. 30, n. 1, p. 32–45, 2019. VALE, F. et al. Parabens as emerging contaminants : Environmental persistence , current practices and treatment processes. Journal of Cleaner Production , v. 347, p.1-18, 2022. Conservantes Segurança Baixo custo Elevado espectro Estabilidade

3. INTRODUÇÃO 2 DARBRE, P. D.; HARVEY, P. W. Paraben esters: review of recent studies of endocrine toxicity, absorption, esterase and human exposure, and discussion of potential human health risks. Journal of Applied Toxicology , v. 28, n. 5, p. 561–578, 2008. CABALEIRO, N. et al. An overview of sample preparation for the determination of parabens in cosmetics. TrAC - Trends in Analytical Chemistry , v. 57, p. 34–46, 2014. . Parabenos Fonte: Darbre e Harvey (2008). Analito Fórmula molecular Peso molecular (g mol -1 ) Log P pKa Solubilidade em H 2 O (%m/m) Ponto de fusão (°C) MeP C 8 H 8 O 3 152,15 1,96 8,17 0,25 (25°C) 131 EtP C 9 H 10 O 3 166,17 2,49 8,22 0,11 (25°C) 116 PrP C 10 H 12 O 3 180,08 2,98 8,35 0,04 (25°C) 96 BuP C 11 H 14 O 3 194,23 3,47 8,44 0,02 (25°C) 68 Sólído em °Tamb Lipossolúvel: possibilidade de acúmulo em tecidos lipídicos Propriedades Físico-Químicas Tabela 1: Principais características físico-químicas dos parabenos .

4. INTRODUÇÃO 3 Circulação sanguínea Célula alvo XENOESTRÓGENO ESTRÓGENO Desregulação endócrina e outros efeitos nocivos Mimetização das funções do estradiol Acúmulo na pele e no tecido adiposo Estimulação de células do câncer de mama Toxicidade reprodutiva BYFORD, J. R. et al. Oestrogenic activity of parabens in MCF7 human breast cancer cells. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology , v. 80, n. 1, p. 49–60, 2002. . DARBRE, P. D. et al. Eostrogenic activity of benzylparaben . Journal of Applied Toxicology , v. 23, n. 1, p. 43-51, 2003. SONI, M. G.; CARABIN, I. G.; BURDOCK, G. A. Safety assessment of esters of p-hydroxybenzoic acid (parabens). Food and Chemical Toxicology , v. 43, n. 7, p. 985–1015, 2005.

5. INTRODUÇÃO 4 Cosmetotoxicologia Toxicologia de Cosméticos Promover no o corpo ou rosto : Higienização Embelezamento Modificação Limite máximo de uso : 0,4% (m/m), para um único parabeno; e 0,8% (m/m), quando associados 2 ou mais Pele humana Ésteres de p - hidroxibenzóico CORBETT, J. F.; SHARMA, R. K.; DRESSLER, W. E. Cosmetic Toxicology. Toxicology , p. 899–918, 1999. US, Food and Drug Administration (FDA) (2021). Cosmetics . Disponível em: <https://www.fda.gov/ cosmetics />. Acesso em: 15/04/2021. BRASIL, Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) (2012b). RDC no 29, de 1 de junho de 2012 , 1-7. Disponível em: <http://portal.anvisa.gov.br>. Acesso em: 15/04/2021.

6. INTRODUÇÃO 5 Monitoramento Biológico Soro : Dados de exposição e dose interna (e possivelmente efeito) Matriz muito invasiva Correlação batom e antitranspirante com a concentração de parabenos Urina e saliva : Dados de exposição e dose interna Matrizes menos invasivas Correlação entre as concentrações encontradas no soro e na saliva TAHAN, G. P. et al. Determination of parabens in serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Correlation with lipstick use. Regulatory Toxicology and Pharmacology , v. 79, p. 42–48, 2016. KARTHIKRAJ, R.; KANNAN, K. Human Biomonitoring of Select Ingredients in Cosmetics. Second Edition ed. [ s.l. ] Elsevier B.V., 2018. MARTINS, I. et al. Serum analysis in women and in vitro skin assay for the assessment of exposure to parabens in antiperspirants. Environmental Science and Pollution Research , v. 27, n. 4, p. 4219–4226, 2020.

7. OBJETIVO GERAL 6 Determinar parabenos em soro, saliva e urina, a fim de avaliar se a exposição aos hidratantes corporais aumenta a carga corpórea dessas substâncias químicas.

8. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 7 Áre a [ ] Preparo de amostras Validação analítica Quantificação Análise estatística DLLME Linearidade Efeito matriz LoD e LoQ Precisão e exatidão HPLC-UV UPLC-MS/MS Teste de Shapiro-Wilk Teste t de Student ANOVA Teste Tukey

9. Determinação de parabenos em hidratantes corporais

10. Rótulo A1 : Aqua , Paraffinum Liquidum , Glycerin , Isopropyl Palmitate , Glyceryl Stearate , Cetearyl Alcohol , Phenoxyethanol , Avena Sativa Kernel Extract , Triethanolamine , Avena Sativa Kernel Oil , Triclosan , Methylparaben , Butylparaben , Carbomer , Hexyl Cinnamal , Linalool , Ethylparaben , Benzyl Salicylate , Butylphenyl Methylpropinal , d- Limonene , Propylparaben , Isobutylparaben , Citronellol , Geraniol , Coumarin . METODOLOGIA 8 8 hidratantes corporais (diferentes marcas) Munícipio de aquisição: Alfenas-MG Amostragem TAHAN, G. P. et al. Determination of parabens in serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Correlation with lipstick use. Regulatory Toxicology and Pharmacology , v. 79, p. 42–48, 2016. MARTINS, I. et al. Serum analysis in women and in vitro skin assay for the assessment of exposure to parabens in antiperspirants. Environmental Science and Pollution Research , v. 27, n. 4, p. 4219–4226, 2020. Limites máximos de parabenos: 0,4% (m/m) individual e 0,8% (m/m) para misturas de ésteres de p - hidroxibenzóico .

11. 9 1 2 3 4 Amostra contendo os analitos Injeção de mistura contendo solvente extrator+dispersor Formação de solução turva (dispersão) Retirada da fase sedimentada (inferior) Princípio básico da DLLME ZGOŁA-GRZEŚKOWIAK, A.; GRZEŚKOWIAK, T. Dispersive liquid-liquid microextraction. TrAC - Trends in Analytical Chemistry , v. 30, n. 9, p. 1382–1399, 2011. METODOLOGIA

12. 10 Teste de viabilidade da DLLME para o preparo de amostras de hidratante corporal 250 µL 500 µL 750 µL 500 µL 750 µL 900 µL 250 µL 500 µL 750 µL 1000 µL 100 mg de hidratante corporal fortificado numa concentração de 4000 µg mL- 1 (0,4% (m/m)) Volume de solvente extrator Volume de solvente dispersor Volume de água Milli -Q Solvente dispersor: 750 µL Água Milli -Q: 1000 µL Solvente extrator: 300 µL Água Milli -Q: 1000 µL Solvente extrator: 300 µL Solvente dispersor : 500 µL METODOLOGIA DE OLIVEIRA, M. L. et al. Determination of 17 potential endocrine-disrupting chemicals in human saliva by dispersive liquid-liquid microextraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry . Talanta , v. 196, n. December 2018, p. 271–276, 2019.

13. 11 Pré clean- up DLLME METODOLOGIA Preparo de amostra de hidratantes corporais 16686 g por 5 minutos 100 mg de creme H 2 O: MeOH (4:1, v:v) 1 minuto 1000 uL Sobrenadante retirado Solvente dispersor e extrator (2:1,v:v) 20 segundos Solução turva 16686 g por 10 minutos 300 uL Análise em HPLC

14. Condições cromatográficas para a determinação de hidratante corporal Coluna Cromatográfica : C8 (150 x 4,6 mm; 5 µm) Fase móvel : água:acetonitrila (70:30, v:v) Comprimento de onda : 240 nm Volume de injeção : 20 µL Vazão fase móvel : 1,0 mL min -1 Temperatura do forno : 40º C Tempo de análise : 28 minutos MARTINS, I. et al. Determination of parabens in shampoo using high performance liquid chromatography with amperometric detection on a boron-doped diamond electrode . Talanta , v. 85, n. 1, p. 1–7, 2011. TAHAN, G. P. et al. Determination of parabens in serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Correlation with lipstick use. Regulatory Toxicology and Pharmacology , v. 79, p. 42–48, 2016. MARTINS, I. et al. Serum analysis in women and in vitro skin assay for the assessment of exposure to parabens in antiperspirants. Environmental Science and Pollution Research , v. 27, n. 4, p. 4219–4226, 2020. 12 METODOLOGIA

15. Conformidade do sistema Parâmetros Recomendações Fator de capacidade (k) DPA*/DPS**= 2x < o tempo que o analito interage com a fase móvel. Resolução ( Rs ) Rs >2 Fator de alargamento da cauda (TF) 0,5 ≤ TF ≤ 2 Número de pratos teóricos (N) > 2000 Tabela 2: Principais parâmetros para verificação da conformidade de um sistema cromatográfico. Notas: *DPA: distância percorrida pelo analito; **DPS: distância percorrida pelo solvente. Fonte: Do autor (adaptada de Ribani , 2004). Validação analítica Áre a [ ] Linearidade Efeito matriz Precisão e exatidão LoD * e LoQ ** Curva de calibração (n=6): 60, 120, 180, 240, 360 e 480 µg mL -1 (equivalente a 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,6 e 0,8 % em (m/m)) RIBANI, M. et al. Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos . Química Nova , v.27, São Paulo, 2004. BRASIL, Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) (2017). RDC no 166, de 24 de julho de 2017 , 1-12. Disponível em: <http://portal.anvisa.gov.br>. Acesso em: 15/04/2021. 13 METODOLOGIA Otimização do sistema e método analítico    

16. RESULTADOS E DISCUSSÃO Teste de viabilidade da DLLME para o preparo de amostras de hidratante corporal Volumes de solventes Eficiência de extração (%) Metilparabeno Etilparabeno Propilparabeno Etanol + TCM* 18,4 17,1 23,6 Acetona +TCM* 72,2*** 67,3*** 93,0*** ACN** + TCM* 55,9 52,0 71,9 Tabela 3: Resultados do teste t de Student para avaliar a melhor combinação de solventes para determinação de metilparabeno , etilparabeno e propilparabeno em hidratantes corporais pelo método DLLME-HPLC-UV. Notas:*TCM: triclorometano ; **ACN: acetonitrila ; ***valor de -p ≤ 0,05 indicam médias estatisticamente diferentes ao nível de 95% de confiança.. 14

17. Teste de volume dos solventes extrator, dispersor e água Milli -Q em hidratantes corporais Tabela 4: Resultado do teste Tukey para a escolha dos volume de solventes extrator, dispersor e água Milli -Q para a determinação de metilparabeno em hidratantes corporais pelo método DLLME-HPLC-UV. Volume de solventes Eficiência da extração (%) Clorofórmio   250 µL 59,6 300 µL 61,2 500 µL 53,4 Acetona   500 µL 69,3* 750 µL 57,5 900 µL 56,2 Água Milli -Q   0 µL 62,3 250 µL 64,0 500 µL 64,5 750 µL 68,9 1000 µL 66,9 RESULTADOS E DISCUSSÃO Notas: *valores de -p ≤ 0,05 indicam médias estatisticamente diferentes ao nível de 95% de confiança. 15 *

18. Conformidade dos sistemas de HPLC-UV Analitos Pratos Teóricos TF* Resolução Assimetria (10%) Metilparabeno 8715 2,72 - 1,25 Etilparabeno 10627 3,87 8,46 1,24 Propilparabeno 11972 6,15 12,40 1,22 Butilparabeno 12409 2,97 15,11 1,21 Benzilparabeno 12213 3,42 2,97 1,20 Tabela 5: Parâmetros de conformidade do sistema em uma solução padrão de concentração 240 µg mL -1 de parabenos nas condições cromatográficas otimizadas . Figura 1: Cromatograma obtido a partir da injeção dos analitos na concentração de 240 µg mL -1 , em fase móvel. RESULTADOS E DISCUSSÃO 16 Notas: *TF= Fator de alargamento de cauda/fator de capacidade

19. Validação analítica- efeito matriz em hidratantes corporais Analito α em matriz ( n=3) α em solvente ( n=3) Valor de -p* Metilparabeno 0,0051 0,0030 0,0083* Etilparabeno 0,0055 0,0032 0,0138* Propilparabeno 0,0049 0,0035 0,0656 Butilparabeno 0,0046 0,0036 0,0940 Analito Valor de -p* Metilparabeno 0,0051 0,0030 0,0083* Etilparabeno 0,0055 0,0032 0,0138* Propilparabeno 0,0049 0,0035 0,0656 Butilparabeno 0,0046 0,0036 0,0940 Tabela 6: Resultados do teste t de Student para avaliar o efeito matriz das curvas de calibração em solvente e matriz para a determinação de parabenos em hidratante corporal pela DLLME-HPLC-UV (n=3). Notas: α- coeficiente angular da curva de calibração; *valores de -p ≤ 0,05 indicam médias estatisticamente diferentes ao nível de 95% de confiança. RESULTADOS E DISCUSSÃO 17

20. Validação analítica- linearidade, coeficientes e limites em hidratantes corporais Analitos Parâmetros de validação  Metilparabeno   Etilparabeno   Propilparabeno   Butilparabeno Curva de calibração (n=6) y=0,005x+0,102 y=0,006 x+0,098 y=0,004 x+0,118 y=0,005 x+0,073 R 0,9979 0,9973 0,9933 0,9954 R 2 0,9957 0,9946 0,9867 0,9909 LoD % (m/m)* 0,0022 0,0020 0,0045 0,0060 LoQ % (m/m)** 0,0066 0,0060 0,0136 0,0182 Tabela 7: Faixa analítica, coeficiente de correlação e determinação, e LoD e LoQ das curva em matriz para a determinação de parabenos em hidratantes corporais pela DLLME-HPLC-UV. Notas: * LoD ( limit of detection - limite de detecção); ** LoQ ( limit of quantification - limite de quantificação), calculados de acordo com equação disponibilizada no guia de validação bioanalítica da ANVISA (BRASIL, 2017). RESULTADOS E DISCUSSÃO 18

21. Validação analítica- precisão e exatidão em hidratantes corporais Parâmetros Analitos Metilparabeno Etilparabeno Propilparabeno Butilparabeno *DPR% 4,604 a 8,365 a 5,426 a 4,674 a 8,834 b 7,292 b 6,820 b 10,081 b 4,856 c 5,433 5,423 c 8,308 **ER% -1,057 a -0,911 a 3,763 a -13,377 a 10,410 b 13,846 b -10,555 b -14,248 b -0,307 c -2,753 c -0,960 c -11,059 c Tabela 8: Precisão e exatidão, expressas como DPR% e ER%, respectivamente, do método DLLME-HPLC-UV para a determinação de parabenos em hidratantes corporais (n=3). Notas: a 60 ppm , b 240 ppm e c 480ppm; *DPR%: desvio padrão relativo; **ER%: erro relativo. . RESULTADOS E DISCUSSÃO 19

22. Determinação de parabenos em amostras de hidratantes corporais Amostras Concentrações % (m/m) Metilparabeno Etilparabeno Propilparabeno Butilparabeno A1 0,14 0,01 0,02 0,01 A2 0,11 0,02 0,01 0,02 A3 0,18 - 0,03 - A4 0,16 - 0,10 - A5 0,02 - 0,26 - A6 0,41 - 0,16 0,20 A7 0,43 - 0,04 0,10 A8 0,12 - 0,11 - Tabela 9: Concentrações, em % (m/m), de parabenos em amostras de hidratante corporal (n=8), obtidas a partir do método DLLME-HPLC-UV, otimizado e validado. Limites máximos de parabenos: 0,4% (m/m) individual e 0,8% (m/m) para misturas de ésteres do ácido p - hidroxibenzóico . RESULTADOS E DISCUSSÃO 20 Concentrações % (m/m) PB Média LoQ MeP 0,20 0,0066 EtP 0,02 0,0060 PrP 0,10 0,0136 BuP 0,07 0,0182

23. Determinação de parabenos em soro

24. METODOLOGIA 21 Amostra A1: - MeP , EtP , PrP e BuP Critérios de voluntárias (n=20) : -Sexo feminino -Idade entre 18 e 40 anos -Discentes da Unifal -MG Critérios para as coletas: -3 amostras biológicas SORO, URINA E SALIVA -5 amostragem em 3 fases Amostragem TAHAN, G. P. et al. Determination of parabens in serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Correlation with lipstick use. Regulatory Toxicology and Pharmacology , v. 79, p. 42–48, 2016. MARTINS, I. et al. Serum analysis in women and in vitro skin assay for the assessment of exposure to parabens in antiperspirants. Environmental Science and Pollution Research , v. 27, n. 4, p. 4219–4226, 2020.

25. METODOLOGIA 22 TAHAN, G. P. et al. Determination of parabens in serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Correlation with lipstick use. Regulatory Toxicology and Pharmacology , v. 79, p. 42–48, 2016. MARTINS, I. et al. Serum analysis in women and in vitro skin assay for the assessment of exposure to parabens in antiperspirants. Environmental Science and Pollution Research , v. 27, n. 4, p. 4219–4226, 2020. Fases de experimentação Armazenamento das amostras Fase I Fase II Fase III Soro Freezer (a -2° C) Urina e saliva Freezer (a -2° C) Questionário TCLE Uso rotineiro Sem parabeno Com parabeno

26. Condições cromatográficas e espectrométricas para a determinação de parabenos em soro Coluna Cromatográfica : C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm) Fase móvel : acetonitrila: água (75:25, v:v) Fonte de ionização : electrospray (ESI) Modo: negativo Volume de injeção : 20 µL Vazão fase móvel : 0,3 mL min -1 Temperatura do forno : 32º C Tempo de análise : 12 minutos Fluxo gás de nebulização*: 2,0 mL min -1 Fluxo do drying gass : 15 L min -1 Temperatura da DL : 250 °C Temperatura do heat block : 400 °C CID gass : 230 Kpa Pressão do sistema : 2,2 MPa *argônio METODOLOGIA 23 VELA-SORIA, F. et al. A new treatment by dispersive liquid-liquid microextraction for the determination of parabens in human serum samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry , v. 405, n. 23, p. 7259–7267, 2013 TAHAN, G. P. et al. Determination of parabens in serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Correlation with lipstick use . Regulatory Toxicology and Pharmacology , v. 79, p. 42–48, 2016. MARTINS, I. et al. Serum analysis in women and in vitro skin assay for the assessment of exposure to parabens in antiperspirants. Environmental Science and Pollution Research , v. 27, n. 4, p. 4219–4226, 2020.

27. Precipitação de proteínas DLLME Preparo de amostra de soro METODOLOGIA 24 VELA-SORIA, F. et al. A new treatment by dispersive liquid-liquid microextraction for the determination of parabens in human serum samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry, v. 405, n. 23, p. 7259–7267, 2013. 16686 g por 10 minutos 250 µ L de soro 250 µ L de água Milli -Q 1000 µ L de acetonitrila 30 segundos 1000 µ L Sobrenadante retirado Solvente dispersor e extrator (1:1,v:v) 30 segundos Solução turva 16686 g por 20 minutos 500 uL Análise em UPLC-MS/MS pH= 2

28. Otimização dos parâmetros espectrométricos   Analito Íon precursor (m/z) Íons produtos (m/z)   Q1* (V)   EC** (V)   Q3** (V) Metilparabeno 151,10 92,10 136,10 18 18 25 22 12 17 Etilparabeno 165,10 92,10 137,10 19 19 23 18 12 18 Propilparabeno 179,10 92,10 136,10 13 13 27 19 12 18 Butilparabeno 193,10 92,10 136,10 23 24 26 19 12 18 13 C 6 -MeP 1 156,95 98,10 142,25 11 19 19 13 22 19 13 C 6 -EtP 2 170,90 98,15 143,15 12 13 19 13 25 19 13 C 6 -PrP 3 185,10 98,15 142,15 14 14 19 29 26 19 13 C 6 -BuP 4 198,85 98,15 142,15 14 10 20 14 26 18 Tabela 10: Condições otimizadas dos parâmetros m/z de cada um dos analitos e padrões internos pelo UPLC-MS/MS, em ESI modo negativo, para a determinação de parabenos em soro. Notas: *Q1: primeiro quadrupolo; **EC: energy colision ( energia de colisão); ***Q3: terceiro quadrupolo; 13 C 6 -MeP 1 : 13 C 6 -Metilparabeno; 13 C 6 -EtP 2 : 13 C 6 -Etilparabeno; 13 C 6 -PrP 3 : 13 C 6 -Propilparabeno; 13 C 6 -BuP 4 : 13 C 6 -Butilparabeno. RESULTADOS E DISCUSSÃO 25

29. Curva de calibração em fase móvel* Parâmetros Analitos     Metilparabeno Etilparabeno Propilparabeno Butilparabeno Curva em solvente (n=6) y=859,39x+1082 y=385,38x-1140 y=818,18x+1437   y=770,02x-3341 R 0,9961 0,9976 0,9966 0,9989 R 2 0,9923 0,9952 0,9932 0,9979 DPR% 11,74 a 4,17 a 9,11 a 10,63 a 3,42 b 2,06 b 7,66 b 6,59 b 0,18 c 2,73 c 1,32 c 9,65 c ER%   7,84 a 13,14 a 8,06 a 13,77 a -8,50 b 5,83 b 9,12 b 3,11 b 3,15 c -1,19 c -0,19 c 0,54 c Tabela 11: Parâmetros de linearidade, precisão e exatidão, nas concentrações de 10 ng mL- 1 a 100 ng mL -1 dos analitos, em fase móvel, obtidos nas condições cromatográficas e espectrométricas otimizadas . Notas: a 10 µg L -1 ; b 50 µg L -1 ; c 100 µg L -1 ; fase móvel: acetonitrila : água (75:25, v:v)) RESULTADOS E DISCUSSÃO 26

30. Otimização da técnica de preparo de amostras Testes Resultados Mistura de solventes         Acetona:TCM (1:1 (v:v)) Apesar de não ter sido preciso e exato, a mistura promoveu uma melhor pré -concentração do analito;   ACN:TCM (1:1 (v:v)) Não houve precisão e exatidão, e ainda a concentração dos analitos foi inferior a mistura acetona:TCM ; Volume de solventes       500 µ L (acetona) 500 µ L (TCM) Promoveu uma solução turva, e após a centrifugação promoveu precipitado límpido. Não apresentou precisão e exatidão;   1000 µ L (acetona) 500 µ L (TCM) Solução bem turva, aumentando a superfície de contato, que depois de centrifugada estava límpida. Não apresentou precisão e exatidão;   Tabela 12: Testes de padronização do solvente orgânico, dos volumes de solventes, do volume de amostra e do volume de água Milli -Q, realizados em soro, para a otimização do método DLLME-UPLC-MS/MS. Notas: TCM= triclorometano (clorofórmio); DLLME: dispersive liquid-liquid microextraction . RESULTADOS E DISCUSSÃO 27

31. Otimização da técnica de preparo de amostras Testes Resultados Volume da amostra       100 µ L   Volume pequeno que dificultou a quantificação dos analitos, ainda que o preparo de amostras e o equipamento não estejam otimizados; 250 µ L   Maior volume de amostra para quantificar os analitos, bem como aquele que atende a disponibilidade amostral por voluntária. Contudo, após a DLLME e injeção no equipamento não apresentou precisão ou exatidão; 500 µ L   Maior quantidade de analitos, porém sem grandes diferenças do volume de amostra de 250 µ L. Também não apresentou precisão e exatidão após análise;   Diluição (água Milli-Q)       100 µ L   Insuficiente para melhorar o preparo de amostra, sem precisão e exatidão após análise em UPLC-MS/MS; 250 µ L   Melhorou o preparo de amostras, facilitando a limpeza da matriz. Não houve precisão e nem exatidão após as análises;   500 µ L   Melhorou o preparo de amostras, facilitando a limpeza da matriz. Não houve precisão e nem exatidão após as análises;   Notas: TCM= triclorometano (clorofórmio); DLLME: dispersive liquid-liquid microextraction . RESULTADOS E DISCUSSÃO 28 Tabela 12: Testes de padronização do solvente orgânico, dos volumes de solventes, do volume de amostra e do volume de água Milli -Q, realizados em soro, para a otimização do método DLLME-UPLC-MS/MS.

32. CONCLUSÕES PARCIAIS 29 A técnica DLLME foi eficiente para o preparo de amostras de hidratantes, na remoção dos interferentes e pré -concentração dos parabenos, além de ser prática e rápida, respeitando os princípios da Química Verde, como a diminuição do gasto de solventes tóxicos O método analítico DLLME-HPLC-UV foi aplicável ao objetivo proposto, sendo capaz de identificar e quantificar parabenos nas amostras de hidratantes corporais e demonstrou desempenho analítico satisfatório para ser utilizado no controle de qualidade dessas formulações Os parâmetros espectrométricos otimizados no UPLC-MS/MS, para as análises de parabenos em soro, foram considerados satisfatórios, uma vez que houve linearidade, precisão e exatidão, nas curvas das soluções-padrão desses analitos A técnica DLLME, para parabenos em soro, ainda precisa ser otimizada, todavia, mostrou-se promissora, em relação à remoção de interferentes da matriz, que podem danificar e/ou diminuir a vida útil do equipamento, uma vez que, nas condições até agora estudadas, já foi possível verificar que o extrato final é límpido e pode ser injetado no UPLC-MS/MS

33. ETAPAS FUTURAS Otimização da DLLME-UPLC-MS/MS para análise de soro Tratamento dos dados de soro, urina e saliva Escrita da defesa da dissertação Publicação de artigos científicos 30

34. AGRADECIMENTOS O presente trabalho é realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES)- Código de Financiamento 001.