Radioinmunoensayo, ELISA y Western Blot

A continuación, te proporciono información detallada sobre los tipos de ELISA, inmunoensayo y Western Blot, incluyendo los pasos a seguir, la técnica, el fundamento, los materiales, la historia y las aplicaciones. Espero que esta explicación te ayude a comprender mejor cómo se llevan a cabo estas técnicas y para qué se utilizan. Si tienes alguna duda, no dudes en preguntar, estaré encantado de ayudarte.

El ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) es una técnica de ensayo inmunológico ampliamente utilizada para detectar y cuantificar la presencia de una sustancia específica, como un antígeno o un anticuerpo, en una muestra biológica. Existen diferentes tipos de ELISA, incluyendo el competitivo, directo, indirecto y sándwich.

En el ELISA competitivo, el antígeno de interés compite con un antígeno marcado previamente conocido por su unión a un anticuerpo. La cantidad de antígeno presente en la muestra se determina midiendo la cantidad de antígeno marcado que se une al anticuerpo.

En el ELISA directo, el antígeno de interés se une directamente a una superficie sólida (como un pozo de una placa de microtitulación) y se detecta utilizando un anticuerpo marcado que se une específicamente al antígeno.

En el ELISA indirecto, se utilizan dos anticuerpos: uno primario, que se une específicamente al antígeno, y otro secundario, marcado con una enzima, que se une al anticuerpo primario. La enzima proporciona una señal detectable para cuantificar la presencia del antígeno.

En el ELISA sándwich, se utilizan dos anticuerpos: uno de captura, que se une al antígeno, y otro de detección, que se une a otra región del antígeno. El antígeno se "sándwicha" entre los dos anticuerpos, lo que permite una alta sensibilidad en la detección.

El inmunoensayo es una técnica general que utiliza anticuerpos para detectar y cuantificar antígenos o anticuerpos específicos. El ELISA es un ejemplo de inmunoensayo, pero también existen otras técnicas, como el radioinmunoensayo (RIA), que utiliza isotopos radiactivos, y los inmunoensayos enzimáticos basados en enzimas para la detección.

El Western Blot, también conocido como inmunotransferencia, es una técnica utilizada para detectar proteínas específicas en una muestra. Consiste en separar las proteínas de la muestra mediante electroforesis en gel, transferirlas a una membrana y luego incubar la membrana con anticuerpos específicos para las proteínas de interés. Los anticuerpos marcados permiten la detección de las proteínas mediante reacciones enzimáticas o quimioluminiscencia.

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1. Radioinmunoensayo, ELISA y Western Blot M.D Bryan Adrian Priego Parra Biología Celular Dra. Rossana Citlali Zepeda Hernández Centro de Investigaciones Biomédicas Universidad Veracruzana

2. Antígeno: molécula externa que produce una respuesta inmune Anticuerpo: Proteína elaborada en respuesta a un antígeno

3. Inmunoensayos Métodos bioanalíticos para el análisis cuantitativo/cualitativo Basados en la reacción específica antígeno -anticuerpo

4. Radioinmunoensayo (RIA) 1960: Solomon Berson y Rosalyn Yalow  Concentración de insulina plasmática YALOW RS, BERSON SA. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man . J Clin Invest . 1960;39(7):1157-1175. doi:10.1172/JCI104130

5. Fundamento: Radioinmunoensayo Competencia de unión entre la sustancia desconocida a cuantificar y cantidades conocidas de la misma sustancia marcada con un radioisótopo (131I, 14C) Formar complejos Ag-Ac o Ag*Ac Directo: Cuantifica radiación emitida por el antígeno que no reacciona. Indirecto: Radiación emitida desde el anticuerpo que reacciona.

6. RIA: Pasos generales Nota al léctor : Si tengo una muestra que no conozco, en caso de que esta contenga antígenos, van a competir contras los radioisótopos marcados para unirse contra los anticuerpos. (A mayor cantidad de antígeno que tenga la muestra, menos cantidad antígeno marcado va a tener, por lo tanto, menor radioactividad (gráfica)

7. Radioinmunoensayo Ventajas: Puede detectar pequeñas cantidades (picogramos) de ag o ac en el suero. Muy alta sensibilidad Limitaciones: Radioactivo Equipo especial para manipular muestra ¿Desechos radioactivos? Vida media de radioisótopos es corta

8. USOS

9. ELISA: Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas

10. ElISA : Descrito en 1971 en Suecia por Eva Engvall y Peter Perlmann

11. ELISA fundamento Uso de Ag o Ac marcados con una enzima e insolubilizado sobre un pocillo inmunoadsorbente Detecta reacción Ag-Ac al añadir un substrato que produce que la enzima produzca un color Se cuantifica la longitud de la onda mediante un espectrofotómetro

12. Tipos de enzimas y sustratos Enzima Sustrato Peróxidasa de rabano Peróxido de hidrógeno B-Galactosidasa O- nitrofenil -Beta-D- Galactopiranósido Fosfatasa alcalina P- nitrofenilfosfato

13. Materiales ELISA Placas de micropocillos (8x12=96) Recipientes para los reactivos Pipetas de distintos volúmenes Puntas de pipeta Muestra Antígenos Anticuerpos Enzimas Lector de microplacas (400 nm-700 nm) Buffer de lavado Solución Stop Espectrofotómetro

14. Pasos generales: ELISA Revestimiento: Antígeno se adsorbe en el pocillo de la placa ELISA con el buffer de recubrimiento Remover el buffer y lavar Bloqueo: Tampón con proteína no relacionada bloquea los sitios libres en los pocillos Remover el buffer y lavar Detección : Ac de detección conjugado con una enzima se una al Ag Remover el buffer y lavar Lectura: El sustrato es catalizado por una enzima cromógena = lectura en color

15. Tipos de ELISA

16. Elisa directo Antígeno inmovilizado en el pocillo Ag detectado por un Ac directamente conjugado a una enzima Cambio de coloración

17. Elisa directo Ventajas: Rápido. Al tener menos pasos hay menor probabilidad de error. Elimina la reactividad cruzada entre anticuerpos Desventajas: Inmovilización del antígeno no específica La señal se amplifica menos Menor sensibilidad que otros tipos de ELISA Usos: Detección de antígenos.

18. ELISA INDIRECTO Antígeno adsorbido en el pocillo Detección: 2 pasos 1.- El anticuerpo primario no marcado se une al antígeno específico 2.- Un anticuerpo secundario conjugado con enzimas se dirige contra el anticuerpo primario Cambio de coloración al añadir substrato

19. Elisa indirecto Ventajas: Alta sensibilidad: más de un ac secundario puede unirse al Ac primario Flexible: Diferentes ac primarios pueden usarse con un solo Ac secundario Desventajas: Puede haber reactividad cruzada con el Ac secundario Fases de incubación adicionales = más tiempo Usos: Detección de anticuerpos

20. Elisa tipo Sándwich Requiere de pares de anticuerpos para captura y detección. Cada anticuerpo es específico para un epítopo diferente. Placa cubierta con un anticuerpo de captura Se agrega el analito o la muestra seguido de un Ac de detección Sándwich directo: Ac de detección conjugado con enzima Sándwich Indirecto : Ac de detección no marcado y requiere de un Ac secundario conjugado con una enzima Cambio de coloración al añadir substrato

21. Elisa Sándwich Ventajas: Alta sensibilidad: 2-5 veces más sensible que Elisa directo/indirecto Alta especificidad: dos Ac están involucrados en la captura y detección Flexibilidad: Se puede usar detección directa o indirecta Desventajas: La optimización de los Ac puede ser difícil Puede ocurrir reactividad cruzada entre los anticuerpos de captura y detección Usos: Análisis de muestras complejas ( pej : endotelina o proteínas de supervivencia de neuronas motoras)

22. Elisa competitivo Mide la concentración de un Ag o Ac mediante la detección de interferencia en la señal de salida esperada

23. Elisa competitivo Revestimiento: El Ag de control se absorbe en el pocillo en un tampón de recubrimiento Remover líquido y lavar Bloqueo: Tampón con proteína no relacionada bloquea los sitios libres en los pocillos Preparar la mezcla de la muestra anticuerpos de detección Muestra: Agregar la mezcla de la muestra en los pocillos Anticuerpo de detección: Añadir un Ac de detección secundario conjugado con una enzima Lectura : El sustrato es catalizado por una enzima que genera color Remover líquido y lavar Remover líquido y lavar El Ag de la muestra y el ag purificado compiten por la unión del Ac A mayor concentración de Ag, más débil será la señal de salida

24. Elisa competitivo Ventajas: No se requiere procesamiento de muestras Las muestras se pueden usar sin purificar Menos probable que se diluya la muestra Menor variabilidad entre muestras duplicadas Desventajas: Las de cada técnica Elisa debido a que cada una puede adaptarse a competitivo Usos: Cuando solo hay un Ac disponible para el antígeno pej : Oxitocina o Corticoesterona .

25. Aplicaciones de Elisa Parásitos Hormonas (HCG, progesterona, testosterona) Cuantificación de inmunoglobulinas (IgG, IgE, IgA) Enfermedades autoinmunes: AC anti DNA, ANCA, Factor reumatoide, inmunocomplejos, etc

26. Western Blot

27. Blotting = Transferencia Western Blot : Proteinas Southern Blot : DNA Northern Blot : RNA

28. Western blot Técnica usada para la detección de proteínas específicas en una muestra Pej: Encefalopatía espongiforme Enfermedad de Lyme Gold standard: VIH

29. Western blot : Fundamento Se basa en el principio de inmunocromatografía donde las proteínas se separan en un gel de poliacrilamida de acuerdo con su peso molecular. Los antígenos transferidos a la membrana son reconocidos por Ac mono o policlonales específicos y cuantificados.

30. Western blot : 1.- Preparación de la muestra Lisis por detergente  Cultivo celular Ultrasonificación  Suspensión celular Homogeneización mecánica  Tejidos animales o vegetales Digestión enzimática  Bacterias, levaduras y hongos. Proceso realizado a bajas temperaturas para evitar ruptura celular.

31. Western blot : Pasos generales 1.- Método apropiado de extracción de proteínas 2.- Electroforesis en gel 3.- Transferencia de proteínas 4.- Inmunodetección de las proteínas por anticuerpos 5.- Análisis de la información

32. Detección de proteína: Quimioluminiscencia: Ac secundarios conjugados con peroxidasa  Reacción luminiscente que se captura en una película o de forma digital con una cámara CCD. Fluorescencia: Ac secundario unido a un fluoróforo que cuando se excita emite luz  Se mide la longitud de onda Colorimetría: Anticuerpo secundario conjugado con una enzima cromógena.

33. Limitaciones: Western Blot Requiere de una correcta extracción y cuantificación de proteínas Más tiempo Más complejo, necesita ser realizado por personal capacitado Se necesita disponibilidad de los Ac primarios para las proteínas Los Ac pueden reaccionar con más de una proteína $$$ La membrana puede no retener proteínas pequeñas Las proteínas grandes son difíciles de transferir a la membrana

34. Métodos de detección Western Blot Método de detección Ventaja Desventaja Radioactividad Alta sensibilidad Riesgos en bioseguridad Colorimétrica Rapidez, sencillez y menor costo Baja sensibilidad Quimioluminiscencia Alta sensibilidad Equipamiento especial para lectura de resultados Fluorescencia Más estable, permite cuantificar la proteína en la muestra, se pueden usar Ac marcados con fluoróforos con diferente longitud de onda Menor sensibilidad que QL y se necesita equipamiento especializado

35. Conclusiones Inmunoensayos son métodos bioanalíticos ampliamente utilizados para diagnóstico de patologías, monitoreo de niveles de drogas, hormonas y farmacocinética clínica, alergias, etc. No existe un método perfecto, es necesario conocer usos y limitaciones así como conocer los recursos disponibles de cada centro.

36. Bibliografía 1.- Gorovits B, Baltrukonis DJ, Bhattacharya I, et al. Immunoassay methods used in clinical studies for the detection of anti-drug antibodies to adalimumab and infliximab . Clin Exp Immunol . 2018 Jun;192(3):348-365. 2.- Roggenbuck JJ, Zarske G, Schierack P, et al . Third generation radioimmunoassay (RIA) for TSH receptor autoantibodies ( TRAb ) - one step less , similar results ? Nuklearmedizin . 2021 Feb;60(1):38-46. 3.- Kohl TO, Ascoli CA. Direct Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Cold Spring Harb Protoc . 2017 Jul 5;2017(7):pdb.prot093740. 4.- J udith A. Owen, Jenni Punt , Sharon A. Stranford , Patricia p. Jones.– Kuby Inmunología. Séptima edición.--México, D. F. : McGraw-Hill, 2014. 692 páginas 5.- Pillai- Kastoori L, Schutz- Geschwender AR, Harford JA. A systematic approach to quantitative Western blot analysis . Anal Biochem . 2020 Mar 15;593:113608. 

37. Gracias Twitter: Bryanpriegop Espero te ayude 