Relatório Enzimas UEM por D.Petter.

1. 1

1.INTRODUÇÃO
As enzimas são catalisadores das reações que ocorrem nos sistemas biológicos. A
presença e manutenção de um conjunto completo e equilibrado sistema de enzimas
é essencial para a quebra de nutrientes para fornecer energia e construção de blocos
químicos como a montagem dos blocos de construção em proteínas, DNA,
membranas, células e tecidos. Como a exceção de alguns RNA catalítico chamado
ribozimas, a grande maioria das enzimas são proteínas. A característica que
distingue uma reação catalisada enzimaticamente é a de ela ocorrer no interior dos
limites de uma cavidade na enzima chamada sítio ativo. A molécula que se liga ao
sítio ativo e sítio ativo e sofre a ação da enzima é chamada substrato.
Deficiências nas quantidade ou atividade catalítica de enzimas como nas desordens
genéticas herdadas pode resultar em deficidade nutricionais ou toxinas. As enzimas
são moléculas de importância fundamental na biomédica, exemplo; a medida da
atividade de enzimas no plasma sanguíneo, eritrócitos ou amostras de tecido são
importantes no diagnóstico de várias doenças. Além disso muitas drogas exercem
seu efeito biológico por meio de interações com as enzimas. Também na indústria
química as enzima são utilizado no processamento de alimentos e na agricultura.
As enzimas podem ser classificadas de acordo com vários critérios. O mais
importante foi estabelecido pela União Internacional de Bioquímica e Biologia
Molecular(IUBMB), e estabelece 6 classes:
 OXIDORREDUTASES:As enzimas que catalisam reações de transferências
de elétrons (ion hidretos ou átomos de H)
 TRANSFERASES:As enzimas que catalisam reações de transferência de
grupos funcionais.
 HIDROLASES:As enzimas que catalisam reações de hidrolise.
 LIASES:As enzimas que catalisam reações de adição de grupos às duplas
ligações ou formação de duplas ligações por meio de remoção de grupos.
 ISOMERASES:As enzimas que catalisam reações de transferência de
grupos dentro da mesma molécula para formar isômeros.
 LIGASES:As enzimas que catalisam reações de formação do tipo C - C,
C - S, C - O e C - N por meio de reações de condensação acopladas á quebra
do ATP.

2. 2



As enzimas como catalisadores aumentam a velocidade da reação reduzindo a
energia livre de ativação. A velocidade de uma reação pode aumentar na ordem de
10
6
a 10
12
vezes mais do que a reação correspondente não-catalisada. Três
propriedades distintas das enzimas permitem que elas exerçam papel na promoção
e regulação dos processos celulares, caracterizando-as como componentes vitais
aos sistemas vivos:
1. Elevada especificidade da reação. Como regra geral, cada reação sob
condições apropriadas é catalisada por uma enzima especifica. Diante de
várias rotas potencialmente possíveis, a enzima escolhe a com menor energia
livre de ativação.
2. Condições reacionais mais limitada: A atividade de cada enzima é
dependente do pH, da temperatura, da presença de vários cofatores e das
concentrações de substratos e produtos.
3. Capacidade de regulação da concentração e da atividade: Permite o
ajuste fino do metabolismo em diferentes condições fisiológicas.
Ultimo, mas não menos importante as enzimas possui a propriedade distinta de
não ser consumida ou alterada ao participar da catálise. Esse propriedade é
muito importante para manter a composição celular no fim de cada uma reação
enzimática.
No corpo humano a enzima amilase saliva é a enzima que devido à sua
facilidade na obtenção, é mais usado nos estudos das atividade enzimática. Por
isso os objetivos deste relatório são baseados neste enzima.

3. 3




2.OBJECTIVO
2,1. GERAL.
Examinar a cinética da amilase salivar.
2,2. ESPECIFICO.
 Analisar as diferença das absorbâncias antes e depois de adição de
amilase no amido.
 Preparação da curva padrão.
 Determinar com auxilo do gráfico de Lineweaver-Burk os valores Km e
Vmax e explique o seu significado.
3.PRINCÍPIO DO MÉTODO.
A amilase saliva digere o amido por catalisar a hidrólise, que é a divisão de
molécula de amido por meio da adição de moléculas de água.
A cinética da amilase salivar pode ser analisado usando espectrofotómetro na
técnica de espectrofotometria. A espectrofotometria é uma técnica analítica que
utiliza a luz para medir a concentração de uma solução. Esse método utiliza
propriedade de absorbância da solução. Absorbância (também
chamada densidade óptica ) de um material é a proporção da radiação que
incide sobre um material, para a radiação transmitida através da material.Com
a técnica de espectrofotometria a absorbância de uma solução pode ser
calculada usando a lei de Beer que diz ''a absorbância de uma solução é
diretamente proporcional à concentração da solução (A ∝ Cs )''
Portanto usando a técnica de espectrometria podemos observar as diferenças de
concentrações de amido antes de e depois de adicionar a enzima amilase. Neste
experiência precisamos solução de iodo que forma o complexo azul escuro com
amido. É este color( azul escuro) que é detectada por o espectrofotómetro que
nos dar os valores de absorbância.

4. 4


4.MATERIAS E REAGENTES.
1% solução de amido.
Água destilada.
Banho - maria.
Espectrofotómetro.
Solução de iodo.
Solução de saliva.
Gelo.
5.PROCEDIMENTOS.
EXPERIENÇIA 1.
Pegou-se 6 tubos e marcou-se P1 a P6. Em cada tubo colocou-se 2 gotas de
solução de iodo e adicionou-se soluções de amido e água destilada em acordo
com a tabela a baixo. Passou-se as misturas pelo o centrífugo e mediu-se as
absorbências no espectrofotómetro.
Tubos P1 P2 P3 P4 P5 P6
Solução de
amido(ml)
0 1,6 3,2 4,8 6,4 8
Água
destilada(ml)
9 7,4 5,8 4,2 2,6 1
Absorbência 0 0,531 0,841 0,717 1,428 0,737

EXPERIENÇIA 2.
Preparou-se cerca de 10ml de solução aquosa de saliva bochechando
intensamente durante 2 minutos, e de seguida filtrou-se a solução com gaze.
Numa série H1 a H6 de tubos contendo solução de amido e água com volumes
idênticos aos da tabela anterior, adicionou-se 1ml da solução de saliva em cada
tubo. Incubou-se cada amostra @ 35°C. Apos a incubação adicionou-se a 2

5. 5

gotas da solução de iodo. Depois colocou-se imediatamente os tubos num copo
com gelo.
Depois disso leu-se absorbência de cada tubo no espectrómetro:
Tubos H1 H2 H3 H4 H5 H6
Absorbâncias 0 0,053 0,210 0,267 0,290 0,310

6.CALCULOS E RESULTADOS .
Dados:
1.Concentração inicial de amido = 1%
Significa que 1 grama de amido foi dissolvido em 100 ml de agua.
∴Concentração padrão(g/litre) =10g /L
Molaridade inicial =
���������çã� ����ã� �� ��??????��
����� ����� �� ��??????��

=
10??????/�
162,16??????/���
= 0,062 mol/L
2.Volume final de solução de amido = 9 ml = 0,009 L


calculando concentração final do amido na experiencia 1.
Usando a Lei de diluição:
Numero de moles antes de diluição = Numero de moles pois diluição.
Concentração(molaridade) =
������ �� ���� �� ������
����� �� ����çã�

daí Numero de moles = molaridade × volume da solução (M × V)
Portanto a lei de diluição
Mi Vi = Mf Vf

6. 6

∴Mf = (Mi Vi)÷ Vf
Mi = Molaridade inicial
Vi = Volume inicial.
Mf = Molaridade final
Vf = Volume final
Usaremos a equação acima para calcular as contrações final do amido nos tubos
PS.:
Tubo P1
Concentração em % =0
Tubo P2
Mf = (Mi Vi)÷ Vf
= (0,062× 0,0016) ÷ 0,009
= 0,011 mol/L
∴ Concentração padrao = 1,78 g/L
Concentração em % = 0,178%
Tubo P3
Mf = (Mi Vi)÷ Vf
= ( 0,062 × 0,0032) ÷ 0,009
= 0,022 mol/L
Concentração padrão = 3,57 g/L
Contração em % = 0,357%
Tubo P4
Mf = (Mi Vi)÷ Vf

7. 7

= ( 0,062 × 0,0048) ÷ 0,009
= 0,033 mol/L
Concentração padrão = 5,35 g/L
Concentração em % = 0,535%
Tubo P5
Mf = (Mi Vi)÷ Vf
= (0,062 × 0,0064) ÷ 0,009
= 0,044 mol/L
Concentração padrão = 7,14 g/L
Concentração em % = 0,714%
Tubo P6
Mf = (Mi Vi)÷ Vf
= (0,062 × 0,008) ÷ 0,009
= 0,055 mol/L
Concentração padrão = 8,92 g/L
Concentração em % = 0,82%
TABELA DE ABSORBÂNCIA E CONCENTRAÇÕES
Tubos P1 P2 P3 P4 P5 P6
Absorbânçia 0 0,455 0,788 1,003 1,040 1,282
Concentrações
do amido %
0 0,178 0,357 0,535 0,714 0,82

8. 8

Como vimos no principio do método que, a espectrofotometria segue a lei de
Beer, analisando a relação do lei concluirmos que o nosso deve ter a linha
estreita como a curva padrão:
Absorbência ∝ Concentração
A ∝ Conc
Introduzindo a sinal de igualdade em acordo de Beer
A = ??????bConc
Em que ?????? = absortividade molar (uma propriedade inerente de uma substância)
b = Comprimento de caminho cuveta ( sempre 1cm )
Portanto: ??????b = constante (m)
∴ A = m Conc
Como podemos ver a equação a cima é equação linear análogo ao y = mx. Daí
provamos que a nossa curva padrão é linha estreita.
A inclinação de gráfico é a constante (m) que é propriedade inerente de
amido(absortividade molar de amido).
A partir do gráfico:
Inclinação (m) =
���??????�çã� �� ������â��??????�
���??????�çã� �� ���������çã� ����������

=
1,2−0,8
0,0,72−0,48

=0,67

9. 9

Calculando a concentração do amido para cada amostra após a hidrólise (CE)
usando a curva padrão:
Considerando que a inclinação de gráfico é a propriedade constante de amido,
podemos calcular a concentração do amido para cada amostra após a hidrólise.
Desde que Absorbência = �×??????��??????
∴ CE =
??????�����â��??????� ��ó� � ℎ??????��ó�??????��
??????���??????��çã�

Tube H1
CE =
??????�����â��??????� ��ó� � ℎ??????��ó�??????��
??????���??????��çã�

= 0%
Tube H2
CE =
??????�����â��??????� ��ó� � ℎ??????��ó�??????��
??????���??????��çã�

=
0,0531
1,67
= 0,032%
Tube H3
CE =
??????�����â��??????� ��ó� � ℎ??????��ó�??????��
??????���??????��çã�

=
0,210
1,67
= 0,13%
Tube H4
CE =
??????�����â��??????� ��ó� � ℎ??????��ó�??????��
??????���??????��çã�

=
0,267
1,67
= 0,16%

10. 10


Tube H5
CE =
??????�����â��??????� ��ó� � ℎ??????��ó�??????��
??????���??????��çã�

=
0,290
1,67
= 0,17%
Tube H6
CE =
??????�����â��??????� ��ó� � ℎ??????��ó�??????��
??????���??????��çã�

=
0,31
1,67
= 0,19%
Calculando velocidade da reação para cada amostra:
Usando a formula v =
∆??????
∆�
=
CO – Ce
10 �??????�����

V1
v =
∆??????
∆�
=
CO – Ce
10 �??????�����
=
0−0%
10�??????�����
= 0
V2
v =
∆??????
∆�
=
CO – Ce
10 �??????�����
=
0,18%−0,032%
10�??????�����
= 0,0148
V3
v =
∆??????
∆�
=
CO – Ce
10 �??????�����
=
0,4%−�,13%
10�??????�����
= 0,027
V4
v =
∆??????
∆�
=
CO – Ce
10 �??????�����
=
0,54%−0,16%
10�??????�����
= 0,038
V5
v =
∆??????
∆�
=
CO – Ce
10 �??????�����
=
0,71%−0,17%
10�??????�����
= 0,054

11. 11

V6
v =
∆??????
∆�
=
CO – Ce
10 �??????�����
=
0,82%−0,19%
10�??????�����
= 0,063
TABELA DE VELOCIDADE E CONCENTRAÇÃO
Tubos H1 H2 H3 H4 H5 H6
Velocidade
(V)
0 0,0148 0,027

0,038 0,054 0,063
Concentrações
(Ce%)
0 0,032 0,13 0,16 0,17 0,19
1??????⁄ 0 67,6 37 26,31 18,5 15,9
1Ce⁄% 0 31,3 7,7 6,3 5,9 5,3

7.DISCUSSÃO E CONCLUSÃO.
A partir do gráfico ӀӀ, o gráfico obedece a equação linear �=��+??????. Além disso
o gráfico obedece a equação de lineweaver-Burk,
1
??????�
=
��
??????��??????
1
[�]
+
1
??????��??????
. Portanto a
equação de lineweaver-Burk e a equação linear são análogo.
Usando a equação de lineweaver-Burk ,
1
??????�
=
��
??????��??????
1
[??????�]
+
1
??????��??????

1.A inclinação =
��
??????��??????
=
∆
1
??????
∆
1
????????????
=
56−36
24−12
= 1,67
2.Em ,
1
??????�
– intercepto,
1
??????�
= 0 ;
Daí ,
1
??????�
– intercepto =
1
??????��??????
= 16
∴ Vmax = 16
-1
= 0,63. Este é velocidade atingida quando todas as moléculas da
enzimas estiverem na forma do complexo ES e a concentração da enzima livre E
for pequena. Nessa condições, a enzima está “saturada” com seu substrato e a
velocidade da reação não aumenta mais com novos aumentos da [S].
3.Em
1
[??????�]
– intercepto,
1
??????�
= 0 ;

12. 12

Daí 0 =
��
??????��??????
1
[??????�]
+
1
??????��??????

−
1
??????��??????
=
��
??????��??????
1
[??????�]


1
[??????�]
– intercepto = −
1
��
= − 9,6
∴Km = 9,6
-1
= 0,104. Este é a concentração de amido quando a velocidade máxima
de reação é metade.

13. 13




BIBLIOGRAFIA
 David Plummer, An Introduction to Practical Biochemistry 3
rd
Ed.1987
 David Blicq, BIOCHEMISTRY-I LABORATORY MANUAL TO7 -A115
 Bruening, Criddle, Preiss & Rudert, Biochemistry Experiments-John Wiley
& Sons 1970
 Motta. Bioquímica básica.2005.
 Murray, R. K, Granner, D. K., Mayes, P. A.,& Rodwell, V. W.(2003).
Harper's Illustrated Biochemistry(26
th
ed.):Lange Medical Books/McGraw-
Hill.
 Voet, D. Voet, G, J. Biochemistry(4
th
ed). NewYork: John Wiley & Sons,
INC.
 Nelson, D. L., & Cox, M. M (2005). Lehninger Principle of Biochemistry
( 4
th
ed.). New York: Worth Publisher.
 Devlin, T. (1998).Text book of Biochemistry with clinical correlations (6
th

ed). John Wiley & Sons, INC., PUBLICATION