Revisión bibliográfica Western Blot generalidades e implicación con el VIH

Western Blot generalidades e implicación con el VIH

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María Alexandra Zambrano Muñoz; Jorge Cañarte Alcívar; Revisión bibliográfica Western blot:
Generalidades e implicación con el VIH
Catedra de Inmunología, Escuela de Medicina, Facultad Ciencias de la Salud. Universidad Técnica de Manabí.
REVISION BIBLIOGRAFICA; WESTERN BLOT:
GENERALIDADES E IMPLICACIÓN CON EL VIH
María Alexandra Zambrano Muñoz
1
, Jorge Cañarte Alcívar
2-3-4

1
Estudiante de la Escuela de Medicina. Facultad Ciencias de la Salud. Universidad Técnica de Manabí, Portoviejo – Manabí
– Ecuador
2
Docente Investigador. Facultad Ciencias de la Salud. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo – Manabí – Ecuador
3
Medico especialista en Inmunología Clínica, StemMedic, Manta – Manabí – Ecuador.
4
Director de Docencia e Investigación, Instituto Ecuatoriano de Enfermedades Digestiva IECED, Portoviejo – Manabí –
Ecuador


Resumen. - el western blot es una técnica
de laboratorio empleada para detectar una
proteína especifica en una muestra ya sea de
sangre o tejido. También es conocido como
“protein blotting” o “inmunoblotting”, fue
introducida en 1979. Con esta se determina la
presencia y cantidad de antígenos y de
anticuerpos específicos, tiene una sensiblididad y
fiabilidad superior respecto a otras pruebas de
laboratorio que tienen la misma finalidad, aunque
el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA,
el Western Blot se usa como prueba confirmatoria
cuando el ELISA da un resultado positivo en un
grupo que no es de riesgo o en una población
donde la prevalencia del virus es muy baja. La
técnica utiliza tres etapas para lograr esto:
separación por tamaño, transferencia a un
soporte sólido y, finalmente, visualización
mediante la marcación de proteínas con el uso
de anticuerpos primarios o secundarios
apropiados. Esta técnica es hoy en día
imprescindible en varios campos de la biología,
como la biología molecular, la bioquímica, la
biotecnología o la inmunología. A pesar de que el
fundamento de la técnica se mantiene, a lo largo
de los años se han ido desarrollando nuevos
métodos de detección con el fin de obtener
resultados más precisos y que permitan además
un análisis cuantitativo de las proteínas.
Palabras claves. – Muestra, anticuerpos,
antígenos, proteína, inmunodeficiencia.



Introducción. - La transferencia de
proteínas o blotting supone la inmovilización de
las proteínas o acidos nucleicos sobre membranas
sintéticas, seguido de la detección empleando
sistemas especialmente diseñados para tinción de
blots. Western Blot es una técnica poderosa
utilizada por muchos investigadores para
identificar la presencia de proteínas específicas en
una muestra separados electroforéticamente con
anticuerpos. El método implica el uso de
electroforesis en gel para separar las proteínas de
la muestra. Las proteínas separadas se transfieren
del gel a la superficie de una membrana. La
membrana se expone a un anticuerpo especifico
contra la proteína de estudio. La unión del

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anticuerpo se detecta usando un marcador
radiactivo o químico. El Western blot se utiliza
para diagnosticas una variedad de enfermedades.
(1)
En el laboratorio a menudo se quiere medir si una
proteína específica se expresa en una muestra. Se
puede hacer esto tomando el material de la
muestra y correrlo en un gel, y luego transferir las
proteínas resueltas en una pieza especial de una
membrana - de papel, si se quiere - y luego se
expone el papel a una sonda que contine un
anticuerpo contra la proteína específica de
interés. Debido a que el anticuerpo está marcado
con una molécula que podremos visualizar,
podemos preguntarnos si la proteína de interés se
expresa en esta muestra y tener una idea de la
concentracion, así como la composicion y el
tamaño es la proteína. (1)
La electroforesis tiene como objetivo separar las
proteínas de la muestra tomada en base a su peso
molecular. Consiste en la migración de moléculas
cargadas a través de soluciones, bajo la influencia
de un campo eléctrico. Muchas moléculas
biológicamente importantes como lo son
aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos,
ácidos nucleicos; poseen grupos ionizables que un
potencial de hidrogeno (pH) determinado, existen
como especies cargadas en solución. (2)
La separación de moléculas del ácid o
desoxirribonucleico (ADN) según su tamaño, es
una herramienta que destaca dentro de la biología
molecular, pues el análisis de los fragmentos
derivados de esta técnica, permite evaluar
importantes propiedades de los genes, como su
organización o alteraciones relacionadas con
diferentes enfermedades. Por esto la
electroforesis de ADN se considera un
procedimiento esencial. En la actualidad se
conocen tres formas fundamentales: la
electroforesis en gel horizontal o vertical, la
electroforesis capilar y los dispositivos
microfabricados. La electroforesis en gel, que
puede ser de agarosa o de poliacrilamida, es una
de las más utilizadas para la separación de ácidos
nucleicos en los laboratorios de biología
molecular. Los geles están formados por un
retículo de polímeros (formando una malla
tridimensional) y el líquido intersticial en el que se
encuentra inmerso. Los geles poseen poros de
diferentes dimensiones moleculares, que
delimitan la velocidad de traslado y el volumen de
las moléculas durante el proceso electroforético.
De esta forma, la separación no sólo se produce
por las diferentes cargas de las moléculas, sino
también por las diferencias en tamaño.
Generalmente, la electroforesis en gel consume
más cantidad de tiempo y mayor cantidad de
muestra, tiene baja eficiencia, baja capacidad de
análisis de muestras por unidad de tiempo,
diferencias en el tiempo de migración de las
moléculas y dificultades en la interpretación, al no
ser capaz de identificar todos los compuestos de
una muestra. Además, la electroforesis en gel es
difícil de automatizar, por lo que es muy trabajosa
en el momento de ejecutar múltiples muestras. (2)
La técnica de Western blot permite transferir las
proteínas de un gel de poliacrilamida sodio dodecil
sulfato (SDS) a una membrana absorbente, siendo
las proteínas transferidas a la membrana una
copia exacta del gel donde han sido separadas por
electroforesis. Esta transferencia de gel a

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membrana supone una gran herramienta para la
detección y caracterización de proteínas,
especialmente las que están en baja abundancia.
(3).
Las ventajas específicas que supone la técnica de
Western Blot son las siguientes:
 Las membranas humedad son flexibles y
fáciles de manipular.
 Las proteínas bloqueadas en la membrana
son accesibles para los diferentes ligandos
 Se necesitan pocos reactivos para el
análisis.
 Se pueden mantener las membranas útiles
durante más tiempo.
A estas ventajas hay que sumarle la evolución
constante que tiene esta técnica desde sus inicios
en 1979, lo que permite trabajar con diferentes
medios y modos de transferencia de proteínas. (3)
Hay 3 etapas principales de esta técnica que son
esenciales para un resultado de calidad:
Electroblotting, Immunoblotting y detección.
Antes de estas etapas, se debe realizar SDS-PAGE,
en el que desnaturalizado las proteínas se separan
por tamaño en un gel de poliacrilamida.
Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)
Para meternos más en contexto en el trabajo se
debe dar a conocer una de las afecciones más
asociadas a la prueba de western blot, el Virus de
Inmunodeficiencia humana. En 1981, en los
Estados Unidos de América se reportaron los
primeros casos de una enfermedad desconocida
que producía una intensa inmunodepresión en
varones homosexuales, quienes padecían
infecciones oportunistas y/o neoplasias malignas.
(4)
La infeccion por VIH/SIDA constituye uno de los
principales problemas en salud en el mundo con
elevadas tasas de morbilidad y mortalidad
demostradas a lo largo de la historia. En diferentes
estudios epidemiológicos ha quedado confirmado
que 36.3 millones de personas vivían con VIH
hasta el año 2015 alrededor de todo el mundo.
Hasta este momento la OMS ha reportado que han
sido infectadas 78 millones de personas desde el
año 1981, año en que comenzó esta epidemia, y el
25% de los pacientes desconocen que están
infectados, lo cual propicia el contagio. (5)
El tratamiento antirretroviral (ARV) de alto
impacto surgió en el mundo en 1996, y en Cuba,
en el año 2001. Este tratamiento ha permitido
convertir esta enfermedad, antes letal, en una
enfermedad crónica con una larga expectativa de
vida debido a la disminución de la aparición de
enfermedades oportunistas y tumores malignos.
Este tratamiento consiste en combinar varias
drogas ARV de alta eficiencia, las cuales aumentan
su efecto sobre el VIH y disminuyen notablemente
la morbilidad y mortalidad por el virus, de modo
que hoy día esta enfermedad se comporte como
una enfermedad crónica. No obstante, la
utilización de estas drogas se ha asociado a
importantes inconvenientes, entre los que
destaca el desarrollo de resistencia y la gran
toxicidad que producen estos fármacos. (5)
Las manifestaciones clínicas de la enfermedad por
el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
comprometen diferentes órganos y sistemas,
estas alteraciones varían en gravedad y dependen

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de factores como la replicación del virus en el
tejido infectado, la presencia de infecciones
oportunistas en los diferentes órganos y el
desarrollo de efectos adversos a los
medicamentos utilizados para su tratamiento. (6)
El tracto gastrointestinal es un sitio
frecuentemente afectado en la infección por VIH,
al respecto se ha reportado que el 88 % de los
pacientes tienen al menos una anormalidad en su
función gastrointestinal. Además, la
sintomatología gastrointestinal en pacientes con
VIH se ha relacionado con progresión o
inadecuado control de la enfermedad y de igual
manera, se ha encontrado que algunos
medicamentos antirretrovirales están asociados a
efectos secundarios gastrointestinales que
incluyen náuseas, vómitos y diarreas; estos
efectos son la causa más frecuente de suspensión
de la terapia antirretroviral altamente efectiva. (6)
Por otra parte, los trastornos hematológicos como
la anemia, leucopenia y la trombocitopenia son
hallazgos frecuentes durante la progresión de la
infección por el VIH y en el síndrome de
inmunodeficiencia adquirida. En cuanto a la
anemia, este es el hallazgo más frecuente y posee
una importante relación con el deterioro de la
calidad de vida, progresión de la enfermedad y
mortalidad. (6)

En la población con VIH las causas de pancitopenia
(disminución de los 3 tipos de células sanguíneas)
incluyen los síndromes de falla medular congénita
y adquirida, las lesiones infiltrativas de la médula
ósea, la destrucción periférica de células
hematológicas, el efecto de medicamentos, los
trastornos autoinmunes, la infección y la
producción medular inefectiva. A su vez, en
pacientes con VIH se presentan frecuentemente
citopenias (Glóbulos sanguíneos disminuidos)
aisladas o combinadas, con el hallazgo de
bicitopenia (disminución de dos series sanguíneas)
o pancitopenia con incidencia variable según los
diferentes estudios. (6)
En la población general frecuentemente se indica
el aspirado de medula ósea para el estudio de la
pancitopenia y en pacientes con VIH no solo dicha
herramienta se emplea para estudiar
pancitopenias, sino también citopenias aisladas
asociadas o no a fiebre de origen desconocido. A
medida que la enfermedad por VIH progresa
disminuyen los recuentos de linfocitos T-CD4 y se
eleva la carga viral del VIH l que se asocia a la
presencia de las alteraciones hematológicas antes
descritas. En los pacientes con VIH también se
presentan enfermedades hematológicas
especiales y definitorias de sida, algunas como el
linfoma no hodgkiniano relacionado al SIDA han
disminuido su incidencia, pero otras no
definitorias de SIDA como las leucemias mieloides
agudas y crónicas se diagnostican frecuentemente
en este grupo. De igual manera, las neoplasias
hematológicas no definitorias de SIDA tienen
pronóstico similar a los pacientes sin VIH. (6)

El uso de pruebas de laboratorio es indispensable
para el diagnóstico de la infeccion por VIH, puesto
que ninguna manifestación clínica es lo
suficientemente especifica; sin embargo, estas
pruebas no permiten determinar si el individuo se
encuentra en el estadio del síndrome de

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inmunodeficiencia adquirida (SIDA), además
tienen limitante de que, al ser estandarizadas in
vitro aunque se ejecuten en condiciones óptimas,
se pueden obtener resultados que no se condigan
con la realidad. (6)
Entre las pruebas más difundidas para detectar el
virus de inmunodeficiencia humana (VIH)
Pruebas rapidas: su tiempo de ejecución es de 20
minutos mas o menos, no necesitan equipamiento
y tienen incorporados sistemas de control de
calidad interno. Actualmente las pruebas rápidas
permiten efectuar diagnósticos múltiples y
simultaneos con otras infecciones de transmisión
sexual (ITS), entre ellas la sífilis y la hepatitis B, e
incluso pueden detectar antígenos/ anticuerpos
del VIH. (4)
ELISA: caracterizada por una alta sensibilidad y una
buena especificidad superior a la de las pruebas
rapidas. La especificidad depende de la calidad del
antígeno que contiene la prueba, quie es el
componente su generación, hoy solo son
aceptables los ELISA de tercera y cuarta
generación debido a su eficacia de detección de
antígenos y anticuerpos activos en el VIH. (4)
Western Blot: Prueba altamente especifica pero
debido a su alto costo se emplea básicamente
como prueba confirmatoria. Su resultado
confirma definitivamente la infeccion por VIH; el
negativo la descarta, excepto cuando existe
evidencia de exposición reciente y reiterada de
esta infección. En tales circunstancias se debe
repetir el ensayo luego de tres y seis meses
respectivamente. Los resultados indeterminados
pueden ocurrir en las fases tempranas o estadios
avanzados de la infección con deterioro
inmunológico grave, en los recién nacidos de
madre VIH positiva, en sueros hemolizados y que
contienen el factor reumatoide o niveles altos de
bilirrubina, en las reacciones cruzadas con otros
retrovirus, en la hipergammaglobulinemia
secundaria a la hiperestimulacion antigénica, en
multitransfundidos y en las enfermedades
autoinmunes. (4)

Conclusiones. – Esta técnica tiene ciertas
ventajas respecto a otras como la prueba ELISA,
debido a que el Wester Blot permite obtener
fotografías para presentar los resultados mientras
que en la ELISA estos son lecturas numéricas, y no
pueden presentarse en formato de imagen. Pero a
su vez también presenta otras contras como lo es
su complejidad debido a que es un proceso
completo, mientras que la técnica ELISA es más
sencilla y puede llevarse a cabo con éxito por
incluso personas menos experimentado. En la
actualidad el Western Blot es el estudio
confirmatorio más empleado para el diagnóstico
del VIH/SIDA. Es una técnica de uso cotidiano en el
laboratorio, permitiendo la cuantificación de
proteínas especificas en diferentes muestras.
Debido a que la infeccion de VIH no tiene cura,
además de cada dia sumarse más y más casos, es
más importante que nunca hacer todo lo posible
para identificar personas infectadas y ligar a estas
a un tratamiento y prevención de trasmisión a
otras personas. El Western Blot confirma
definitivamente la infección de VIH y el resultado
negativo lo descarta, excepto en los casos
especiales, y el resultado indeterminado requiere
repetir el ensayo hace necesario recurrir a esta
prueba.

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