Seminário 02

1. Capítulo 01: Os Cromossomos Metafásicos e o Ciclo Mitótico

2. ~ 1865 a 1883: Citologistas e Mendel Estrutura característica das células C apaz de formar novos núcleos por divisão Divisão - estruturas alongadas = cromossomos 1866 – Haeckel - * núcleo é o principal agente da herança 1880 – Flemming - *mitose – cromossomos se dividem longitudinalmente - *visualizou cromossomos plumosos 1881 – Balbiani - * descobriu cromossomos politênicos 1883 – Roux - *comportamento dos cromossomos meióticos = Mecanismo de herança

3. ~ 1900 a 1904: Proposta a Teoria da Herança Cromossômica Base Leis mendelianas da herança (redescobertas de Correns – 1900) T rabalhos citológicos ( Sutton , 1903 e Boveri , 1904) Citogenética Estudo relativo cromossomo i solado / em conjunto c ondensado / distendido m orfologia / organização f unção / replicação v ariação / evolução

4. Cromossomos Metafásicos cromátide = um único fio de DNA + proteínas + RNA = cromonema = cromatina região mais delgada = centrômero 2 braços (constrição secundária satélite) telômero = extremidade do braço Centrômero Acrocêntrico – perdidos na divisão celular Dicêntricos, Tricêntricos ... * constrição primária muito longa * anáfase – “quebra” do cromossomo

5. Morfologia do cromossomo metafásico Cromossomos com vários centrômeros

6. Centrômero Inativação do cromossomo extra ou Mecanismo de coorientação dos centrômeros Funcionamento normal de cromossomos que têm + de 01 centrômero Quebra de cromossomo: funciona como monocêntrico centrômero latente = retoma sua ativ. funcional Cinetócoro estrutura globosa ou em forma de placa se liga as fibras do fuso presente em todo o ciclo (desde a intérfase) Holocêntrico: várias placas / uma única ausência de C.P.

7. Fibras Cinetocóricas

8. Comparação entre cromossomos anafáficos monocêntricos e holocêntricos

9. Constrição Secundária : em um cromossomo de cada espécie (lote n) prófase - associado ao nucléolo = RON produção de RNA ribossomais fortemente corada com nitrato de prata Telômero : Diferenças na composição/organização de seu DNA Qd perdido – “adesão” nas novas extremidades - * dificuldade na anáfase Cicatrizante nos terminais cromossômicos Organização cromossômica – intérfase, prófase

10. Cariótipo : Descrição das características do conj. cromossômico de uma espécie. compara citogeneticamente espécies diferentes variação entre indivíduos da mesma espécie correlacionar patologias Representação: Cariograma Idiograma

11. Cariograma: fotografia de uma metáfase homólogos emparelhados e enumerados Idiograma: representação esquemática do cariótipo posição e tamanho do centrômero número, tamanho e largura do cromossomo conj. haplóide

12. Idiograma de algumas espécies do gênero Briza (gramínea) Cariograma humano

13. Número Cromossômico: 02 números cromossômicos diferentes haplóide = gamético = n diplóide = somático = 2n Extremos: 2n = 2 – Parascaris equorum (nematelminto) 2n = 1260 – Ophioglossum reticulatum (pteridófita) 2n = 4 – poucas plantas e animais

14. Tamanho Cromossômico: tamanho médio 5 a 6 um cromossomos muito pequenos – descrição cariótipa – restrita ao número cromossômico variação de tamanho gradativa bimodal Cariótipo simétrico assimétrico – variação do tamanho/posição do centrômero Diversidade cromossômica e cariótipica Cravo-bravo, 2n=48 Iridácea, 2n=28

15. Posição do Centrômero: Metacêntrico Telocêntrico Submetacêntrico Acrocêntrico 01) Razão entre braços (r) r = l/c 02) Índice centrométrico (ic) ic = c x 100 / c + l Tipos cromossômicos

16. Divisão Nuclear Eucariotas Meiose Mitose sequência de eventos basicamente a mesma originados antes dos pluricelulares

17. INTÉRFASE Cromatina parte condensada = cromocentro parte descondensada = cromatina difusa G 1 duração variável influenciável pelo meio externo S duplicação do DNA nuclear período mais longo G 2 qtd de DNA duplicada 2 cromátides por cromossomo

18. PRÓFASE massa difusa CROMONEMA Citoplasma fuso acromático desaparecem os nucléolos rompe-se a carioteca fibrilas do fuso ligam-se ao cinetocóro Final Prófase = PROMETÁFASE cromossomos razoavelmente condensados espalhados pelo núcleo

19. METÁFASE alinhados no plano mediano da célula com maior contração e individualização * aplicação de substâncias anti-mitóticas * se ligam as tubulinas * fusos inativados * células c - metáfases * montagem de cariogramas ou idiogramas Cromossomos

20. ANÁFASE divisão do centrômero encurtamento das fibras do fuso alongamento das fibras entre cinetocóros irmãos cromossomos chegam nos pólos opostos

21. TELÓFASE cromossomos fortemente condensados e agregados cromatina difusa mais descondensada aparecimento dos cromocentros e da cromatina difusa reaparecem nucléolos e a carioteca desaparecem o cromonema e o fuso acromático cromossomos polarizados divisão nuclear Citocinese núcleo celular Intérfase G 1 = G 0

22. Capítulo 2: Organização Molecular da Cromatina

23. Composição Química da Cromatina pequena fração constituída de DNA maior parte é protéica menor fração é RNA proteínas básicas = histonas proteínas ácidas = não-histônicas

24. Estrutura do DNA dupla cadeia helicoidal cadeia nucleotídeo grupo fosfato + pentose + base nitrogenada bases Pareamento específico púricas (A, G) pirimídicas (C, T) G C e A T

25. Estrutura e pareamento dos nucleotídeos no DNA

26. Estrutura do DNA Informação genética do DNA transcrita para o RNA traduzida para proteínas passagem da informação através de um código cada aminoácido codificado por sequência 3 nucleotídeos DNA contém “trincas” codoficam uma proteína Variação na qtd de DNA Conteúdo médio de DNA filo menos complexo < filo mais complexo fungos poríferas < briófitas moluscos < angiospermas mamíferos

27. Variação na qtd de DNA Gimnosperma Angiosperma Peixes Anfíbios não há correlação entre complexidade organismal Ex.: 2 ervas tetraplóides menos de 50 cm de altura com estruturas semelhantes uma com cerca de 670x mais DNA que outra Codificação das informações genéticas qtd mínima de DNA EUCARIOTAS - excesso de DNA Difícil estabelecer uma correlação entre qtd de DNA e estágio evolutivo

28. Sequência de Base no DNA “técnica para deduzir a sequência de bases de um segmento de DNA” permite ler segmentos pequenos de DNA necessário cortar em pedaços menores sequenciar as bases de cada pedaço reunir corretamenteas sequências para ler o segmento inteiro Genes se organizam separados por um “DNA espaçador” fonte de variação na qtd de DNA não se relaciona com a informação genética nem com a complexidade do organismo

29. Genes éxons + íntrons Éxons: contém informação genética Íntrons: não contém informação genética não estão rigidamente controlados pela seleção natural DNA altamente repetitivo uma mesma sequência de bases se repete mais de 100 000 x DNA moderadamente repetitivo repetitividade inferior a 100 000x DNA de sequências únicas sequências se repetem poucas vezes ou não se repetem

30. Relação entre o tamanho do gene da ovalbulina no DNA e no RNAm

31. Determinação da repetitividade do DNA * solução com DNA isolado, fragmentado em pequenos pedaços * aquecimento rompe pontes de H (desnaturação) * baixando-se a temperatura reassociação das cadeias * a velocidade e o tempo necessário para renaturação constante de reassociação (c.r.) Compara-se a c.r. de um DNA com a de outro DNA não-repetitivo Quanto mais rápida a reassociação, maior o grau de repetitividade do DNA testado

32. Identificação do DNA altamente repetitivo Por densidade de flotação DNA nuclear é extraído, fragmentado e centrifugado em CsCl banda principal banda satélite contém o DNA de sequências únicas e o moderadamente repetitivo contém o DNA altamente repetitivo

33. Isolamento do DNA satélite pela densidade de flotação.

34. RNA RNA m RNA t RNA r traduzido para proteína auxiliares no processo de tradução Constutie maior parte do RNA nuclear Representa uma pequena fração da cromatina RNA r: * 4 tipos 5 s 5,8 s 18 s 28 s Localizam-se nos telômeros Surgem simultaneamente da quebra de uma molécula maior – RNA 45 s

35. RNA t: * teoricamente existem 64 tipos diferentes (um para cada anticódon possível) RNA m: * origena-se do DNA de sequências únicas Estrutura do RNA r e RNA t: cadeia simples dobrada sobre si mesmo parcialmente pareado originam-se do DNA moderadamente repetitivo

36. Histonas * 5 tipos: H1 H2A H2B H3 H4 rica em lisina moderadamente rica em lisina rica em arginina Interação Histonas - DNA: Nucleossomos – octâmero de histonas envolvidos em 2 voltas de DNA (nucleóide), interligados por um filamento de DNA espaçador Solenóide – forma pequenos cromômeros numerosas alças Cromômeros - formam o cromossomo metafásico

37. “ Estrutura da Cromatina ” Nucleóide * composto de um octâmero de histonas ( 2moléculas de H2A, H3, H4, H2B) * H1 ou H5 aparecem por fora ou no interior dos giros de DNA DNA ligado a histona em sítios específicos DNA não complexado a histonas é clivado, fragmentos de tamanhos variados Cromatina é clivada, fragmentos de DNA padronizados

38. Os quatro pares de histonas que compõem o núcleo do nucleossoma. Representação: A = cromatina intacta, B = nucleossoma, C = cromatossoma .

39. “ Proteínas não-histônicas – NHP ” “papéis” desde o estrutural até o enzimático atuam na transcrição, replicação e reparo do DNA atuam na condensação e descondensação cromatínica Após extração de DNA, histonas e RNA, permaneceu um arcabouço de proteínas não histônicas Em Politênicos: Formação de pufe – envolve acúmulo de NHP na interbanda adjacente Papéis: Ativam a transcrição de RNA Empacotam e transportam RNA recém-transcrito Ativam genes no pufe

40. Eletromicrografia de um cromossomo humano do qual se extraíram as histonas. Certas proteínas não histônicas formam uma armação, da qual emergem laços ou anéis de DNA.

41. Capítulo 03: Heterocromatina e Bandamento cromossômico

42. 1928 – Emil Heitz 2 tipos de cromatina Heterocromatina – condensada durante todo o ciclo celular Eucromatina – possue um ciclo de condensação-descondensação Características gerais da Heterocromatina: ausência de atividade gênica replicação tardia do DNA prófase = blocos heterocromáticos mais condensados que o restante do cromossomo

43. Tipos de Heterocromatina Constitutiva permanece condensada concentra-se em blocos no cromossomo em ambos os homólogos, na mesma posição e mesmo tamanho não contém genes estruturais local onde se situa se não total / a maior parte do DNA satélite em todo o ciclo em todas as células do indivíduo

44. Tipos de Heterocromatina Facultativa se comporta como heterocromatina / eucromatina aparece em apenas um dos homólogos envolve todo o cromossomo composição de DNA típica de eucromatina

45. * Corpúsculo de Barr – Heterocromatina Facultativa um cromocentro encontrado no núcleo interfásico só aparece em fêmeas = cromatina sexual = cromatina x diferencia o sexo citogenético do indivíduo nº de Corpúsculos de Barr = nº de cromossomos x – 1 Comparação entre núcleos interfásicos de (a) um homem normal XY, (b) uma mulher normal XX, (c) uma mulher X0, (d) uma mulher XXX.

46. * Corpúsculo de Barr Hipótese de Lyon a inativação de um dos X da mulher garantiria um equilíbrio entre o nº de genes ativos no homem e na mulher Cromossomo Y: um dos menores cromossomos humanos em parte formado por heterocromatina constitutiva não tem muita influência no equilíbrio gênico contem poucos genes Inativação do X mecanismo de compensação de dose equipara a qtd de genes ativos no homem e na mulher

47. Técnicas de localização da Heterocromatina Constitutiva em cromossomos Metafásicos 01) Técnica de Tratamento com frio a temperatura baixa faz com que a heterocromatina se descondense mais que a eucromatina apenas algumas poucas espécies apresentam esse tipo de comportamento nessa condição

48. 02) Técnica Auto-Radiográfica expor o organismo / célula em crescimento a uma solução contendo substância radioativa ( timidina tritiada) que será normalmente metabolizada posteriormente pode-se reconhecer a localização dessa substância devido a sua radioatividade tecnica que vai atingir os núcleos celulares que estiverem na fase S, onde os novos DNAs sintetizados incorporarão o elemento radioativo.

49. Replicação tardia do DNA da heterocromatina

50. 03) Técnica Hibridação in situ se reconhece a heterocromatina pela localização do seu DNA repetitivo 3 etapas: 1ª : DNA satélite isolado e fragmentado é induzido à replicação em presença de timidina tritiada; as novas cadeias marcadas são separadas 2ª : cromossomos com cadeias pareadas são desnaturados 3ª : DNA cromossomal desnaturado é colocado em contato com as cadeias simples de DNA satélite marcado; induz o pareamento, revelando-se assim a exata localização da heterocromatina constitutiva no cromossomo.

51. 04) Técnica Bandamento C cromossomos são mergulhados numa solução básica (hidróxido de bário) em seguida expostos a uma solução salina a temperatura elevada o DNA da heterocromatina constitutiva é menos extraído que o DNA restante do cromossomo qd os cromossomos são corados, as regiões heterocromáticas coram mais fortemente, formando blocos escuros = bandas C O padrão de bandas C podem servir como um parâmetro que facilita a identificação e caracterização de certos cromossomos, por exemplo, os cromossomos humanos 8 e 9.

52. “ 05) Técnica Bandamento G ” produz várias bandas claras e escuras no cromossomo essa técnica não evidencia a heterocromatina O bandamento G constitue um meio de identificação cromossômica , permite detectar rearranjos cromossômicos e comparar cariótipos de espécies relacionadas regiões escuras (bandas G ) representam segmentos cromossômicos que se condensam mais cedo na prófase regiões claras são condensados mais tardiamente na prófase

53. 06) Técnica Fluorocromos específicos para AT ou GC Corantes fluorescentes - fluorocromo quinacrina mustarda – bandas Q alguns fluorocromos são altamente específicos para AT ou GC, identificando apenas o DNA satélite Estes tipos de corantes também podem localizar o cromossomo Y humano em núcleos interfásicos

54. Importância do Bandamento cromossômico Bandamento G e Q *permitem detectar pequenas variações estruturais (deleções,duplicações, inversões) * possibilita localizar exatamente a região diretamente afetada Bandamento C * nos casos de híbridos interespecíficos, esta técnica tem permitido reconhecer, na célula híbrida, quais os cromossomos de cada espécie parental Para estudos evolutivos * as técnicas possibilitaram observação detalhada das transformações que ocorreram em grupos de espécies próximas que apresentam cariótipos muito semelhantes.

55. Representação esquemática do cariótipo humano com bandamento. Os setores de heterocromatina constitutiva, incluíndo os centrômeros, estão em vermelho.

56. “ Referências Bibliográficas ” GUERRA,Marcelo. Introdução à Citogenética Geral . Editora Guanabara (1986) RECCO-PIMENTEL, Shirlei M.; CARVALHO, Hernandes F. A célula. (2007) DE ROBERTIS, Eduardo M. F.; HIB, José. Bases da Biologia Celular e Molecular. Guanabara Koogan, 2006.