Sustentación Campaña Maza Wagner Paúl (Maestría) 08-11.2024..pptx

Residuos de tetraciclinas y genes de resistencia a tetraciclinas en bacterias aisladas de Ucides occidentalis y Litopenaeus vannamei en Tumbes, 2022-2023

1. Tumbes, 2024 Residuos de tetraciclinas y genes de resistencia a tetraciclinas en bacterias aisladas de Ucides occidentalis y Litopenaeus vannamei en Tumbes, 2022-2023 Tesista: Br. Wagner Paúl Campaña Maza Universidad Nacional de Tumbes Escuela de Posgrado Maestría en Ciencias con Mención en Gestión Ambiental

2. INTRODUCCIÓN Los efluentes, es el principal problema en los cuerpos de agua (San Juan-Reyes et al., 2017; Zhuang et al., 2021). Los antibióticos se han usado para tratar infecciones bacterianas (Zhu et al., 2013) El manglar de Tumbes está expuesto a contaminación de efluentes (Hidalgo, 2008; Morán & Hidalgo, 2018)

3. OBJETIVOS Determinar el nivel de residuos antibióticos en tejidos de cangrejo de manglar ( Ucides occidentalis ) y de langostinos silvestres ( Litopenaeus vannamei ), así como el tipo de ARGs de tetraciclinas en cepas bacterianas aisladas de los mismos, en el manglar de Tumbes en el año 2022-2023. 10 10

4. MATERIAL Y MÉTODOS 1. Muestreo 2. Registro de medidas biométricas y pesado 3. Obtención de hemolinfa y tejidos sólidos 4. Siembra en medio TCBS y TSA. 5. Caracterización de colonias. 6. Aislamiento y purificación. Muestreo Registro de medidas biométricas y pesado Obtención de hemolinfa y tejidos sólidos Caracterización de colonias Siembra en medio TCBS y TSA Aislamiento y purificación

5. MATERIAL Y MÉTODO 7. Tinción de Gram, pruebas de catalasa y oxidasa 8. Resistencia antibiótica en cepas bacterianas. 9.Extración de ADN. 10. PCR, migración e identificación de bacterias . 11. Determinación de residuos antibióticos. 12. Genes de ARGs de tetraciclinas. Tinción de Gran, pruebas de catalasa y oxidasa Resistencia antibiótica en cepas bacterianas Extracción de ADN PCR, migración e identificación de bacterias Genes de ARGs de tetraciclinas Determinación de residuos antibióticos

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. Características externas de Ucides occidentalis y langostinos silvestres . Tabla 1. Peso y ancho cefalotorácico (Media ± DE) de U. occidentalis colectados en el manglar de Tumbes. Ucides occidentalis tuvieron un ancho cefalotorácico (AC) mayor a 65 mm, que es la talla mínima de captura según Ordinola et al. (2010), l o que indica que estos cangrejos tuvieron talla comercial. Zona de muestreo Fecha del muestreo Peso (g) (Media ± DE) Ancho cefalotorácico (mm) (Media ± DE) Puerto Pizarro 10/11/2022 183,8 ± 28,6 81,8 ± 3,8 El Bendito 27/10/2022 204,9 ± 42,5 82,7 ± 5,6 06/12/2022 Desembocadura del río Tumbes 06/12/2022 189,2 ± 20,1 77,8 ± 3,9 Zona de muestreo Fecha del muestreo Peso (g) (Media ± DE) Longitud (mm) (Media ± DE) Puerto Pizarro 09/01/2023 8,9 ± 1,5 11,4 ± 0,8 El Bendito 23/01/2023 7,3 ± 2,3 11,2 ± 1,3 Desembocadura del río Tumbes 29/01/2023 8,4 ± 2,2 11,7 ± 1,0 Los tamaños fueron adecuados para hacer la extracción de tejidos, en cambio cuando son pequeños (tamaño poslarvas) debe triturar todo el cuerpo, según indica Cesasin (2003). Tabla 2. Peso y longitud (Media ± DE) de langostinos silvestres ( Litopenaeus vannamei ) recolectados en el manglar de Tumbes.

7. Zona de muestreo Parámetros químicos de agua Nitritos (mg/l) Nitratos (mg/l) Fosfatos (mg/l) Alcalinidad (mg/l)   Puerto Pizarro 0,145 0,179 0,69 245 El Bendito 0,135 0,540 0,68 225 Desembocadura del río Tumbes 0,115 0,328 0,35 190   RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.2. Parámetros físico químicos del agua en zonas de muestreo Tabla 3. Parámetros físico químicos del agua tomados en zonas de muestreo. VALORES REFERENCIALES NITRITOS: < 0,1 mg/l ( Chávez & Higuera,2003; Vera & Mendoza, 2020) NITRATOS: 1 mg/l (Vera & Mendoza, 2020). FOSFATOS: 0,3 a 0,5 mg/l (Vera & Mendoza, 2020). ALCALINIDAD: 120 y 300 mg de CaCO 3 /l (Vera & Mendoza, 2020). V alores establecidos para el cultivo de langostino Todos los parámetros estuvieron en los rangos establecidos por los autores . Nitritos y fosfatos estuvieron ligeramente sobre el rango establecido.

8. Zona de muestreo Parámetros físicos químicos de agua Salinidad (‰) pH Temperatura (ºC) Oxígeno disuelto (mg/l) Puerto Pizarro 33,9 7,35 28,8 3,2 El Bendito 30,6 7,47 29,3 3,4 Desembocadura del río Tumbes 32,5 7,27 27,3 4,6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.3. Parámetros físico químicos del agua en zonas de muestreo Tabla 4. Parámetros físico químicos del agua tomados en zonas de muestreo. VALORES REFERENCIALES: SALINIDAD: óptimo 17 a 20 ‰, soporta máximo 3 a 50 ‰ (Rojas et al. 2005) pH: 6,8 y 8,5 (Minam, 2017). TEMPERATURA: 25 a 32 °C (Hernández, 2016) OD: ≥ a 4 mg/l (Chávez & Higuera, 2003). Entre 2 y 5 mg/l menor crecimiento (Rojas et al. 2005). V alores establecidos para el cultivo de langostino Todos los parámetros estuvieron en los rangos establecidos por los autores . El OD estuvo por debajo del rango establecido lo condicionaría menor crecimiento de langostino.

9. Características morfológicas de las colonias seleccionadas de U. occidentalis y langostinos silvestres.   Especie Zona de muestreo Medio N° cepas Color Tamaño (mm) Forma U. occidentalis Puerto Pizarro TSA 45 Crema 0,5-2,0 Circular, puntiforme TCBS 14 Verde y amarillo 1,0-4,0 Circular, puntiforme El Bendito TSA 19 Crema 0,5-3,0 Circular, puntiforme TCBS 17 Verde y amarillo 0,5-2,0 Circular, puntiforme Desembocadura del río Tumbes TSA 29 Crema 1,5-2,5 Circular, puntiforme TCBS 22 Verde y amarillo 0,5-3,5 Circular, puntiforme L. vannamei Puerto Pizarro TSA 38 Crema 1,3-1,9 Circular TCBS 28 Verde y amarillo 1,4-4,2 Circular El Bendito TSA 20 Crema 1,2-3,5 Circular TCBS 29 Verde y amarillo 1,8-3,2 Circular Desembocadura del río Tumbes TCBS 7 Verde y amarillo 1,5-6,0 Circular TCBS es muy efectivo para propiciar el crecimiento de Vibrio (Pfeffer & Oliver, 2003). Cepas aisladas : TSA: 151 TCBS: 117 TSA es un medio que permite el crecimiento de cualquier género (Britania, 2021a, 2021b). C olonias de Vibrio son frecuentemente observadas en TCBS ( Aguirre et al., 2021; Tinoco et al., 2023; Potosí 2024). Coloración de colonias: TSA: crema TCBS: verde y amarillo RESULTADOS Y DISCUSIÓN

10. Existen reportes realizados en Ucides cordatus , en los cuales se han hallado que las cepas de Vibrio fueron abundantes (Carvalho et al., 2016; Vieyra et al. 2004). En esta investigación se ha encontrado que la mayor parte de cepas identificadas correspondieron a Vibrio spp. Zona de muestreo N° cepas identificadas Género Identidad GenBank SILVA Puerto Pizarro 6 Bacillus 98,55 a 100,00 98,42 a 100,00 4 Vibrio 100,00 99,93 a 100,00 3 Staphylococcus 100,00 99,93 a 100,00 2 Enterobacter 99,31 a 100,00 100,00 El Bendito 7 Vibrio 98,97 a 99,90 98,96 a 100,00 1 Staphylococcus 99,34 99,17 1 Halomonas 99,93 99,92 Desembocadura del río Tumbes 6 Vibrio 99,50 99,76 a 100,00 4 Bacillus 99,93 a 100,00 99,508a 100,00 1 Exiguobacterium 100,00 100,00 Zona de muestreo N° cepas identificadas Género Identidad GenBank SILVA Puerto Pizarro 3 Vibrio 99,80 a 100,00 99,40 a 100,00 4 Staphylococcus 100,00 96,93 El Bendito 5 Vibrio 99,80 a 100,0 99,93 a 100,00 4 Enterobacter 98,66 a 99,81 99,32 a 99,65 Desembocadura del río Tumbes 6 Vibrio 99,86 a 100 99,73 a 100,00 1 Shewanella 100,00 99,93 La mayor parte de cepas identificadas correspondieron a Vibrio spp Aguirre et al. (2021); Tinoco et al. (2023) y Potosí (2024), han reportado abundantes cepas Vibrio spp. aislados en langostinos silvestres y langostinos de cultivo ( Litopenaeus vannamei ). Tabla 6 . Identificación molecular de cepas bacterianas aisladas de langostinos silvestres. Tabla 5 . Identificación molecular de cepas bacterias aisladas de U. occidentalis . RESULTADOS Y DISCUSIÓN

11. Zona Cepa Penicilinas Fosfonatos Feni-coles Tetraciclinas Aminoglucósidos Quinolonas Macró-lidos Número de antibióticos a los que es resistente Número de familias antibióticas a las que resiste Índice MAR Multirresistencia Ampicilinas (10µg) Fosfomicina (50 µg) Cloranfenicol (30µg) Florfenicol (30µg) Oxitetraciclina (30µg) Tetraciclina (30µg) Estreptomicina (10 µg) Gentamicina (10µg) Ácido nalidíxico (30µg) Norfloxacina (10µg) Enrofloxacina (5 µg) Azitromicina (15 µg)             Puerto Pizarro 14 hep S   S   S S   I S   R S   R S I   R 3 3 0,25 Si 23 hep I   R   S S   S S   R S   I S S   R 3 3 0,25 Si 45 int I   S   S S   S S   R R   R S S   I 3 2 0,25 No 53 int R   I   S S   S S   R R   S S R   I 4 3 0,33 Si                                               El Bendito 4C S   S   S S   S S   I S   I S S   I 0,00 No 5B-hem S   S   S S   S S   R S   S S S   S 0,00 No 8C S   I   S S   S S   S S   I S S   S 0,00 No 9B-hem S   S   S S   S S   I S   S I S   S 0,00 No 14B-hep S   S   S S   S S   I S   I S S   R 1 1 0,08 No 15B-int I   R   S S   S S   R S   S S S   S 2 2 0,16 No 16B-int I   I   S S   S S   I S   S S S   S 0,00 No                                               Desembocadura del río Tumbes 21 I   I   S R   S S   R S   S S I   I 1 1 0,08 No 24 S   S   S S   I I   R S   R S I   I 2 2 0,16 No 30 R S S S S S R S S S S S 2 2 0,16 No 34 R   R   S S   S S   R I   S S R   I 4 4 0,33 Si 41 S   S   S S   S S   I S   S S I   I 0,00 No 48 S   R   S S   S S   S S   S S S   S 1 1 0,08 No Cepas resistentes 3   4   1     10 2   3 2   3         4.5 . Resistencia antibiotica de cepas bacterianas aisladas de cangrejos y langostinos silvestres. Tabla 7. Resistencia antibiótica en Vibrio spp. aislados de Ucides occidentalis . 4 cepas multirresistentes Se observa que todas las cepas de Vibrio spp. aisladas de cangrejos fueron sensibles al cloranfenicol y la mayoría fueron sensibles al florfenicol, oxitetraciclina, tetraciclina y norfloxacina. Adicionalmente la mayoría de las cepas de Vibrio spp. fueron resistentes para estreptomicina; con respecto al índice MAR, este varió entre 0,0 y 0,33 Resultados Las cepas que mostraron mayor resistencia antibiótica fueron las cepas 53 int y 37 que correspondió a Vibrio alginolyticus también mostró una alta multirresistencia a antibióticos. Resultados Estas cepas de dicha especie han sido reportadas anteriormente en cangrejos del manglar, particularmente en el cangrejo del manglar brasileño U. cordatus , en el cual entre 78 a 86% fueron resistentes a estreptomicina (Carvalho et al., 2016) , adicionalmente Vieira et al. (2004) . Discusión RESULTADOS Y DISCUSIÓN

12. Zona Cepa Penicilinas Fosfonatos Feni-coles Tetraciclinas Aminoglucósidos Quinolonas Macró-lidos Número de antibióticos a los que es resistente Número de familias antibióticas a las que resiste Índice MAR Multirresistencia   Ampicilinas (10µg) Fosfomicina (50 µg) Cloranfenicol (30µg) Florfenicol (30µg) Oxitetraciclina (30µg) Tetraciclina (30µg) Estreptomicina (10 µg) Gentamicina (10µg) Ácido nalidíxico (30µg) Norfloxacina (10µg) Enrofloxacina (5 µg) Azitromicina (15 µg)             Puerto Pizarro 1-PV R S S S S S R S S S S S 2 2 0,16 No Lang 39 R R S S I S R S I S S I 3 3 0,25 Si Lang 55 R   R   S S   I S   I I   R S S   I 3 3 0,25 Si                                               El Bendito B-20V I S S S S S R S S S I I 1 1 0,08 No B-25V R   I   S S   S S   I S   S S I   S 1 1 0,08 No B-44V R   I   S S   S I   I S   S S R   I 2 2 0,16 No B-48V R   R   S S   S I   R S   S S I   I 3 3 0,25 Si B-72V R S S S S S R S S S S I 2 2 0,16 No                                               Desembocadura del río Tumbes BV-40 R   S   S S   R S   I S   S S S   S 2 2 0,16 No BV-47 R   I   S S   I S   I S   S I I   S 1 1 0,08 No BV-49 R   R   S S   I I   I S   I S I   S 2 2 0,16 No BV-50 R   I   S S   R S   R S   S I I   S 3 3 0,25 Si BV-75 R   S   S S   S I   I S   S S I   S 1 1 0,08 No BV-78 R   R   S S   I I   I S   S S I   S 2 2 0,16 No Cepas resistentes 13   5     2   6   1 1           Tabla 8. Resistencia antibiótica de Vibrio spp. aislados de langostinos silvestres. 4 cepas multirresistentes Varias investigaciones como las de Aguirre et al. (2021); Grande (2020); Rosado (2018) y Tinoco (2020) , se ha evidenciado que existen cepas de Vibrio resistentes e incluso multirresistentes a antibióticos en langostineras aledañas al manglar de Tumbes En esta investigación tres cepas fueron multirresistentes siendo las cepas Lang 55, B-48V y BV-50 las mismas que fueron identificadas como Vibrio alginolyticus . Se observa que todas las cepas de Vibrio spp. aisladas de langostinos silvestres fueron sensibles al cloranfenicol y florfenicol, mientras que la mayoría de cepas fueron sensibles al ácido nalidíxico, gentamicina y norfloxacina, por otro lado la mayoría de las cepas fueron resistentes a la ampicilina y en menor proporción a estreptomicina y fosfomicina. El índice MAR vario entre 0,08 y 0,25 Resultados Un estudio en una langostineras de Tumbes mostró que V. alginolyticus tuvo resistencia a antibióticos principalmente a ampicilina, tetraciclina y cloranfenicol (Rosado, 2018) . Discusión RESULTADOS Y DISCUSIÓN

13. Zona Cepa Penicilinas Fosfonatos Fenicoles Tetraciclinas Aminoglucósidos Quinolonas Macró-lidos Número de antibióticos a los que es resistente Número de familias antibióticas a las que resiste Índice MAR Multirresistencia   Ampicilinas (10µg) Fosfomicina (50 µg) Cloranfenicol (30µg) Florfenicol (30µg) Oxitetraciclina (30µg) Tetraciclina (30µg) Estreptomicina (10 µg) Gentamicina (10µg) Ácido nalidíxico (30µg) Norfloxacina (10µg) Enrofloxacina (5 µg) Azitromicina (15 µg)             Puerto Pizarro 40 Int** S R S ND S S R S I S S R 3 3 0,16 si 49 Int** S   R   S ND   S S   S S   S S S   S 1 1 0,09    No 50 Int* S   ND***   S S   S S   S S   ND ND S   S 0,00  No  52 Int* S ND S S S S I S ND ND S R 1 1 0,11 No 56 Hep* R   ND   S S   R I   S S   ND ND R   R 4 4 0,44 Si                                               El Bendito 12B-Hep* S S S S S S S S ND ND S I 0,00 No * Staphylococcus spp. ** Enterobacter cloacae Tabla 9. Resistencia antibiótica de Staphylococcus spp. y Enterobacter spp. aisladas de Ucides occidentalis . P uesto que las cepas identificadas que mostraron mayor resistencia a antibióticos fueron la cepa 56 hep (aislada del hepatopáncreas de U. occidentalis ) que correspondió a Staphylococcus epidermidis , la misma que resistió a 4 de los 12 antibióticos ensayados siendo la ampicilina, oxitetraciclina, enrofloxacina y azitromicina, además ésta cepa fue la mayor índice de multirresistencia obtuvo; esta situación no es infrecuente para cepas de esta bacteria, pues según ha reportado Otto (2009) En la tabla 17 se muestra la resistencia antibiótica de Staphylococcus spp. y Enterobacter spp. en cepas aisladas de Ucides occidentalis . RESULTADOS Y DISCUSIÓN

14. Zona Cepa Penicilinas Fosfonatos Feni-coles Tetraciclinas Aminoglucósidos Quinolonas Macró-lidos Número de antibióticos a los que es resistente Número de familias antibióticas a las que resiste Índice MAR Multirresistencia   Ampicilinas (10µg) Fosfomicina (50 µg) Cloranfenicol (30µg) Florfenicol (30µg) Oxitetraciclina (30µg) Tetraciclina (30µg) Estreptomicina (10 µg) Gentamicina (10µg) Ácido nalidíxico (30µg) Norfloxacina (10µg) Enrofloxacina (5 µg) Azitromicina (15 µg)             Puerto Pizarro Lang 53* I ND*** S S S S S S ND ND S S 0,00 No                                               El Bendito 45L** R R S ND S S I S S S S R 3 3 0,27 Si   67** R   S   S ND   S S   I S   S S S   R 2 2 0,18  No    50** R   R   S ND   S S   R S   S S S   S 3 3 0,27  Si  56** S   S   S ND   S S   R R   S S S   S 2 1 0,09  No  * Staphylococcus capitis . ** Enterobacter cloacae ***ND: No se pudo determinar Tabla 10. Resistencia antibiótica de Staphylococcus spp. y Enterobacter spp. aislados de langostinos silvestres. E n la tabla 26 se observa la resistencia antibiótica de Staphylococcus spp. y Enterobacter spp. aislados de langostinos silvestres. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Estos fármacos como la estreptomicina son utilizados exclusivamente para el tratamiento de tuberculosis en humanos (Domínguez et al., 2016); mientras que la azitromicina es empleada con frecuencia en infecciones respiratorias (Gwenzi et al., 2022 )

15. A: Puerto Pizarro; B: Desembocadura del río Tumbes.  Zona Cepa Penicilinas Fosfonatos Fenico-les Tetraci-clinas Amino-glucósidos Quinolonas Macrólidos Número de antibióticos a los que es resistente Número de familias antibióticas a las que resiste Índice MAR Multirresistencia Ampicilinas (10µg) Fosfomicina (50 µg) Cloranfenicol (30µg) Florfenicol (30µg) Oxitetraciclina (30µg) Tetraciclina (30µg) Estreptomicina (10 µg) Gentamicina (10µg) Ácido nalidíxico (30µg) Norfloxacina (10µg) Enrofloxacina (5 µg) Azitromicina (15 µg)             A 3 hem I ND S S S S S S ND ND S S 0,00 No 20 hep S ND S S S S S S ND ND S S 0,00 No 46 hem S ND S S S S S S ND ND S R 1 1 0,11 No 48 hem S ND S S S S S S ND ND S I 0,00 No 54 int I ND S S S S S S ND ND S R 1 1 0,11 No 55 hep S ND S S S S S R ND ND S R 2 2 0,22 No B 20 S ND S S S S S S ND ND I I 0,00 No 32 S ND S S S I S S ND ND S I 0,00 No 37 S ND S S S S S S ND ND S S 0,00 No 49 S   ND   S S   S I   S S   ND ND S   I  0,00 No Tabla 11. Resistencia antibiótica de Bacillus spp. de cangrejos del manglar. La ma y oria de las cepas fueron sensibles a los antibióticos ensa y ados, excepto la cepa 55 hep que fue resistente a dos antibióticos (gentamicina y azitromicina), y las cepas 54 int y 46 hem fueron resistentes solo a la azitromicina. Resultados Para la evaluación de la resistencia antibiótica de Bacillus spp. se utilizaron los puntos de corte de estafilococos debido a la falta de estándares establecidos por el Eucast, puesto que Adamski et al. (2023) utilizó los puntos de corte de estafilococos para realizar la evaluación de la resistencia antibiótica de Bacillus spp. Discusión RESULTADOS Y DISCUSIÓN

16. Tabla 12. Porcentaje de resistencia antibiotica de Vibrio spp. aislados de Ucides occidentalis . . Antibiótico Porcentaje de resistencia antibiotica de Vibrio spp n Resistentes n Intermedias n Sensibles Ampicilina 3 17,6 5 29,4 9 52,9 Fosfomicina 4 23,5 4 23,5 9 52,9 Cloranfenicol 0,0 0,0 17 100,0 Florfenicol 1 5,9 0,0 16 94,1 Oxitetraciclina 0,0 2 11,8 15 88,2 Tetraciclina 0,0 1 5,9 16 94,1 Estreptomicina 10 58,8 5 29,4 2 11,8 Gentamicina 2 11,8 1 5,9 14 82,4 Ácido nalidíxico 3 17,6 4 23,5 10 58,8 Norfloxacina 0,0 1 5,9 16 94,1 Enrrofloxacina 2 11,8 4 23,5 11 64,7 Azitromicina 3 17,6 7 41,2 7 41,2 4.6. Porcentaje de resistencia antibiotica de cepas bacterianas en cangrejos y langostinos silvestres. El 100% de cepas de Vibrio spp. fueron sensibles al cloranfenicol. La mayor resistencia se observó para la estreptomicina (58,8%) y fosfomicina (23,5). Mientras que el 94,1% fueron para florfenicol, tetraciclina y norfloxacina. Seguido la fosfomicina (23,5%) y en menor proporción la ampicilina, ácido nalidíxico y azitromicina (17,6) Aguirre (2019), encontró cepas de Vibrio spp. aislados de Litopenaeus vannamei en langostineras de Tumbes y Santa Rosa (Ecuador), tuvieron alta resistencia a la gentamicina (64,3%), el cual es un antibiótico que pertenece a la misma familia que la estreptomicina (aminoglucósido). RESULTADOS Y DISCUSIÓN

17. Tabla 13. Porcentaje de resistencia antibiotica de Vibrio spp. aislados de langostinos silvestres. Antibiótico Porcentaje de cepas de Vibrio spp n Resistentes n Intermedias n Sensibles Ampicilina 13 92,9 1 7,1 0,0 Fosfomicina 5 35,7 4 28,6 5 35,7 Cloranfenicol 0,0 0,0 14 100,0 Florfenicol 0,0 0,0 14 100,0 Oxitetraciclina 2 14,3 5 35,7 7 50,0 Tetraciclina 0,0 5 35,7 9 64,3 Estreptomicina 6 42,9 8 57,1 0,0 Gentamicina 0,0 1 7,1 13 92,9 Ácido nalidíxico 1 7,1 2 14,3 11 78,6 Norfloxacina 0,0 2 14,3 12 85,7 Enrrofloxacina 1 7,1 8 57,1 5 35,7 Azitromicina 0,0 6 42,9 8 57,1 El 100% de cepas de Vibrio spp. fueron sensibles al cloranfenicol y florfenicol El 92,9 fueron sensibles a la gentamicina . El 92,9% de cepas de Vibrio spp. fueron resistentes a la ampicilina. El 42,9% de cepas de Vibrio spp. fueron sensibles al estreptomicina Carvalho et al. (2016), encontró cepas de Vibrio spp. aisladas de U. cordatus en Brasil. mostraron ser sensible a la tetraciclina. Grande (2020), obtuvo cepas de Vibrio spp. aisladas L. vannamei en investigaciones por Sanipes, las cepas fueron resistentes a ampicilina, 35,29%. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

18. Tabla 14. Residuos antibióticos en tejidos de cangrejos del manglar y langostinos silvestres. Poll Zona ng/g Pulpa de langostino Santuario <0,0044 El Bendito 0,0700 Puerto Pizarro 0,0482 La desembocadura del río Tumbes <0,0044 Pulpa de cangrejo Santuario <0,0044 El Bendito <0,0044 Puerto Pizarro <0,0044 La desembocadura del río Tumbes <0,0044 Cefalotórax de langostino Santuario <0,0044 El Bendito <0,0044 Puerto Pizarro <0,0044 La desembocadura del río Tumbes <0,0044 Todas las muestras analizadas ( Pool de pulpa de cangrejo, pulpa y cefalotórax de langostino) se encontraron dentro de los límites máximos de residuos (LMR). Digesa (2016), mediante la norma técnica sanitaria Nº 120-Minsa/Digesa ha establecido que en el musculo de peces y crustáceos para consumo humano, el LMR en clortetraciclina, tetraciclina y oxitetraciclina es de 200 µg/kg La Unión Europea ha un LMR más bajo para productos cárnicos en su informe EMEA/MRL/023/95, el LMR es de 100 µg/kg para oxitetraciclina, tetraciclina y clortetraciclina y sus 4-epímeros. Es confiable consumir estos recursos (cangrejos y langostinos silvestres); puesto que al menos están libres de residuos antibióticos (tetraciclinas) que a futuro podrían ser perjudiciales para la salud del consumidor. Kit de tetraciclinas Muestras de pulpa de langostino y cangrejo RESULTADOS Y DISCUSIÓN

19. Tabla 15. Genes de resistencia antibiótica de tetraciclinas en cepas seleccionadas de langostinos silvestres. Zona de muestreo Cepa Especie Genes ARGs de tetraciclinas tetA tetB tetD tetE Puerto Pizarro 1-PV Vibrio parahaemolyticus - - - - Lang 53 Staphylococcus capitis - - - - Lang 39 Vibrio alginolyticus - - - - Lang 55 Vibrio alginolyticus - - - - Lang 46 ND - - - -             El Bendito B-20V Vibrio parahaemolyticus - - - - B-44V Vibrio alginolyticus - - - - B-48V Vibrio alginolyticus - - - - B-25V Vibrio parahaemolyticus - - - - B-72V Vibrio proteolyticus - - - - 45 Enterobacter cloacae - - - - 67 Enterobacter cloacae - - - - 50 Enterobacter cloacae - - - - 56 Enterobacter cloacae - - - -             La Desembocadura BV-75 Vibrio diabolicus - - - - BV-40 Vibrio furnissi - - - - BV-50 Vibrio alginolyticus - - - - BV-46 Shewanella algae - - - - BV-47 Vibrio alginolyticus - - - - BV-49 Vibrio harveyi - - - - BV-78 Vibrio alginolyticus - - - - El motivo que no se haya encontrado presencia de genes de tetraciclinas ( tetA, tetB, tetD y tetE ) en cepas bacterianas aisladas de Ucides occidentalis y langostinos silvestres no se descarta la posibilidad de encontrar otros genes en antibióticos diferentes a las tetraciclinas Esto es por el motivo que muchos de los antibióticos están prohibidos para el uso veterinario (Dos Santos, 2015). Gao et al. (2012), el cual cuantificaron genes a tetraciclinas ( tetM , tetO , tetT , tetW ) y sulfonamidas ( sul1 y sul2 ) en bacterias aisladas de seis granjas acuícolas de Tianjin del norte de China; sin embargo encontraron dos genes de sulfonamidas ( sul1 y sul2 ). Figura 1. Genes de resistencia antibiótica de tetraciclinas en cepas seleccionadas de Ucides occidentalis . RESULTADOS Y DISCUSIÓN

20. CONCLUSIONES Se aislaron 53 cepas en TCBS y 93 cepas en TSA, a partir de muestras de Ucides occidentalis , se seleccionaron e identificaron 35 cepas bacterianas de las cuales 17 cepas pertenecieron al género Vibrio . Se aislaron 64 cepas en TCBS y 68 cepas en TSA en muestras de tejido sólido y hemolinfa de langostinos silvestres; las mismas que se seleccionaron 23 cepas bacterianas y solo 20 cepas se logró obtener la identificación molecular; principalmente el género Vibrio . La mayoría de las cepas de Vibrio spp. aisladas de muestras de Ucides occidentalis fueron resistentes de 1 a 3 antibióticos de los 12 antibióticos ensayados; sin embargo la cepa 34 fue la única que resistió a 4 familias de 7 familias ensayadas. Todas las cepas de Vibrio spp. aisladas de muestras de langostinos silvestres fueron resistentes de 1 a 3 antibióticos de los 12 antibióticos evaluados. En los ensayos de resistencia antibiótica en cepas aisladas de muestras de U. occidentalis se observó que el mayor porcentaje de resistencia fue para la estreptomicina (58,8%), y en menor grado la fosfomicina (23,5%); sin embargo el 100% fueron sensibles cloranfenicol, y en menor proporción el florfenicol, tetraciclina y norfloxacina (94,1%). Todas las cepas aisladas de muestras de langostinos silvestres fueron sensibles al cloranfenicol y florfenicol (100%); mientras que el 92,9% fueron resistentes para ampicilina y el 42,9% para estreptomicina. En la parte comestible de cangrejos y langostinos silvestres recolectados en el mangar de Tumbes, los niveles de residuos antibióticos de tetraciclinas no excedieron el límite máximo de residuos (LMR) establecido en la legislación peruana e internacional. Ninguna de las cepas bacterianas aisladas de cangrejos del manglar y langostinos silvestres no presentaron genes de resistencia a tetraciclinas ( tetA , tetB , tetD y tetE ).

21. Producción científica Revista Científica FCV-LUZ (Scopus Venezuela) Revista Bioscience Journal (Scopus Brasil) Resistencia antibiótica en bacterias cultivables aisladas del cangrejo del manglar Ucides occidentalis en el mayor manglar del Perú. Resistencia antibiótica a oxitetraciclina y otros antibióticos en bacterias de camarones silvestres Litopenaeus vannamei en el mayor manglar del Perú. Manuscrito enviado Manuscrito por enviar Grupo de investigadores

22. Agradecimiento A la Universidad Nacional de Tumbes, por financiar en parte con fondos de canon el Proyecto titulado “Contaminación por tetraciclinas y genes de resistencia en componentes bióticos y abióticos del manglar de Tumbes” aprobado con Resolución N° 1171-2021/UNTUMBES-CU A mi asesor Dr. Alberto Ordinola Zapata y co-asesores Dra. Enedia Graciela Vieyra Peña y Dr. Héctor Alfredo Sánchez Suárez, al jurado de tesis: Dr. Auberto Hidalgo Mogollón, Dr. Oscar Mendoza Neyra y Dra. Tessy Peralta Ortiz, a los técnicos de laboratorio : Ing . Nicole Alessandra Vergara Alfaro, Técnico Pedro Masias Ramírez, Técnico Peter Baca, Mg. Yeni Seminario Yamunaque y Mg. Robert Peralta O tero

23. ¡¡GRACIAS!!