Tecnicas de hibridacion pcr mlpa eq.5

Tecnicas de hibridacion pcr mlpa

1. Grupo : 8 04 UNIDAD ACADEMICA DE MEDICINA TECNICAS DE HIBRIDACION, PCR Alumnos: Bermúdez García Salvador Hernández Arteaga Karen Yareli Tornes Suastegui Stefany GENETICA Dr. Arturo Vargas

2. ELECTROFORESIS Es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica.

3. Proceso general de Electroforesis 1. Preparar un gel de agarosa o acrilamida a la concentración requerida. 2. Mezclar las muestras a analizar con un buffer de carga adecuado. 3. Cargar las muestras en el gel. 4. Realizar la corrida electroforética al voltaje pertinente. 5. Visualizar.

4. Elementos necesarios para la Electroforesis Cámara de electroforesis Permite la generación de un campo eléctrico alrededor de un gel en el que se depositan las muestras. Cuenta con dos polos que se conectan a una fuente de energía.

5. Gel Da soporte para evitar perturbaciones mecánicas durante la separación.

6. Electroforesis en Gel de Agarosa 100pb a 25 kb No tóxico Permite analizar pesos moleculares variados Menor poder de resolución de la poliacrilaminda

7. 1. Tanque externo 2. Conectores tipo banana 3. Soporte para geles 4. Cuña 5. Tapa 6. Cables fijos

8. Buffer de corrimiento Proporciona el medio para la transmisión de la corriente eléctrica y mantiene el pH sin variaciones mientras se realiza el corrimiento. * En el caso de los ácidos nucleicos, pueden emplearse: TBE TAE Tris base, ácido bórico y EDTA, y se maneja a un pH de 7.2. Tris base, ácido acético y EDTA, ajustado a pH 8.5.

9. Buffer de carga Tiene como fin brindar peso, densidad y color a la muestra, lo que facilita su depósito en el pocillo y evita su salida del gel. Relación 1:3 respecto a la muestra Tris, azul de bromofenol , azul de xileno y glicerol

10. Electroforesis en ácidos nucleicos Las movilidad dependerá únicamente de la longitud ( pb ). Se realiza con voltajes de 25 y 100V. Se monitorea en avance por la visualización de los colorantes. molecular de las moléculas de DNA que se va a separar. Para el caso de productos de PCR (entre 100 pb y 1.5 kb ) se recomienda usar voltajes comprendidos entre 75 y 100V. Para muestras de DNA genómico y plasmídico (> 2 kb ) se recomienda aplicar valores de entre 25 y 75 V.

11. Visualización de las muestras Utilización de bromuro de etidio Incorporar antes de solidificar(0.5mg/ml) Luego del corrimientos, incubando el gel en una solución que contenga 0.5mg/ml Emite fluorescencia naranja al exponerse a UV con longitud de absorción de 254nm y longitud de emisión de 366nm.

12. Colorantes Azul de bromofenol Por su menor tamaño, se mueve más rápido que las proteínas o que la mayoría de moléculas de DNA (siempre que éstas sean superiores a 300 pb ), es decir, marca el "frente de avance".

13. Bromuro de etidio Se trata de un compuesto intercalante , es decir, que tiene afinidad para unirse al DNA, pues se introduce entre sus bases apiladas. interacciona también con DNA monocatenario . Su utilidad deriva asimismo de su fluorescencia. Se excita con luz ultravioleta de onda corta, 254 nm , y emite su fluorescencia como luz visible, de color rosado-anaranjado .

14. Transluminador Ultravioleta

15. Southern blot 1975, Edwin Southern Analiza ADN previamente digerido con enzimas de restricción . Determinar la presencia de un gen o fragmentos del ADN en una mezcla de ácidos nucleicos previamente extraídos. Desnaturalización o separación de las cadenas complementarias del ADN Hibridación o unión de dos cadenas complementarias . Dos procesos:

16. Procedimiento técnico Se aísla el ADN de cualquier célula del organismo. Se digiere con enzimas de restricción y los fragmentos se separan por electroforesis en geles de agarosa. Las moléculas de ADN separadas pueden visualizarse mediante tinción con bromuro de etidio . E l ADN se desnaturaliza para obtener cadenas sencillas , mediante un proceso químico,(tratamiento con álcalis).

17. Los fragmentos se transfieren del gel a un soporte sólido, como membranas de nitrocelulosa o de nailon. Para identificar uno o más fragmentos Se utiliza una sonda específica marcada con alguna molécula reportera La sonda se pone en contacto con la membrana de nitrocelulosa y donde la sonda encuentre su secuencia complementaria se pegará, proceso conocido como hibridación . Se emitirá radiactividad, la cual se detectará mediante revelado con placas de rayos X

18. Aplicaciones Identificar genes asociados con enfermedades de transmisión genética. Identificar mutaciones, como rearreglos , deleciones y dosis génica en caso de portadores. D etectar polimorfismos en los fragmentos de restricción de diversos genes

19. Northern blot Es la contraparte del Southern blot , se utiliza ARN en lugar de ADN . No se utilizan enzimas de restricción Electroforesis Desnaturalización Transferencia Hibridación con una sonda 1977 ,  James Alwine , David Kemp y George Stark en Stanford ARN

20. Permite observar un patrón particular de expresión genética entre tejidos, órganos, estadios del desarrollo, niveles de estrés ambiental, infecciones causadas por patógenos y durante el curso del tratamiento de las mismas. S e ha utilizado para mostrar la sobreexpresión de oncogenes y la desregulación de genes oncosupresores en células cancerosas cuando son comparadas con tejidos normales . Los patrones de expresión obtenidos nos ayudan a conocer las funciones de los genes . La variación en el tamaño del producto de un gen puede además indicarnos deleciones o errores en el proceso de transcripción. Aplicaciones

21. Dot /slot blot Tras el aislamiento y separación de los ácidos nucleicos, éstos se aplican directamente a la membrana. No se realiza electroforesis. La fijación se hace generalmente con vacío y en un molde cuyo pocillo puede tener forma de punto ( dot blot ) o ser lineal (slot blot ). Es posible realizar detecciones cualitativas y cuantitativas, utilizando como patrón diluciones seriadas de concentraciones conocidas del genoma que se está determinando. Sólo puede confirmar la presencia o ausencia de una biomolécula o biomoléculas que pueden ser detectados por las sondas de ADN o el anticuerpo.

22. Hibridación in situ Es un método histoquímico Emplea a la biología molecular de la misma manera que la inmunohistoquímica . Su especificidad se basa en la unión de una sonda con una secuencia complementaria de ADN o ARN dentro de un tejido . No requiere de la extracción de ácidos nucleicos Las sondas que se utilizan para la hibridación in situ pueden ser radiactivas y no radiactivas. En la actualidad, las más relevantes son las marcadas con fluorescencia , modalidad conocida como hibridación in situ acoplada a un sistema de fluorocromos (FISH ), o con biotina, ya que el detalle morfológico no se pierde, a diferencia de lo que ocurre con las modalidades radiactivas.

23. El primer paso es la preparación y fijación del tejido, en el cual deben conservarse los ácidos nucleicos lo más íntegramente posibles, mantener la morfología del tejido y permitir una accesibilidad suficiente para que la sonda penetre. Las secciones de tejido deben adherirse al portaobjetos y no deben desprenderse durante el procedimiento de hibridación. Antes de la hibridación, los tejidos se pretratan con HCl y proteinasa y se someten a una posfijación con paraformaldehído . Aspectos técnicos

24. Permite la localización de secuencias génicas a nivel cromosómico, con lo que se pueden detectar translocaciones y otras alteraciones cromosómicas, así como el estudio de expresión de genes ( ARNm ) a nivel celular y subcelular . Las principales aplicaciones son la identificación de infecciones virales en tejidos, así como el mapeo cromosómico. Aplicaciones

25. PCR

26. EL MÉTODO DE PCR Técnica enzimática in vitro utilizada para amplificar una región determinada de ADN situada entre dos regiones de ADN, cuya secuencia se conoce, a partir de una mezcla compleja de ácidos nucleicos.

27. Dr. Kary Mullis 1986:conceptualizó la PCR 1993: recibió el premio Nobel por su invención   Multiplicar una hebra de ADN millones de veces Polymerase chain reaction PCR Gran numero de copias de fragmentos específicos de DNA Replicación exponencial de ADNg y ADNc

28. Características de la amplificación in vitro y requerimientos necesarios para la PCR Misma secuencia de la replicación 5`a 3` Se requiere ADNg y ADNc que sirva de molde ADN polimerasa Desoxinucleotidos Primers

29. ADN Polimerasa Taq ADN polimerasa enzima mas empleada Polimeriza una cadena tomando un molde. 95º C se tienen que soportar Aislamiento de la Taq polimerasa de la Bacteria Thermophilus aquaticus 1-2.5 U / Reacción de PCR Polimeriza en promedio 1000 nt /x min

30. ADN Molde Se obtiene de cualquier muestra biológica ADN La retrotranscripcion Amplificación a partir de 300 ng para ADNg y de 50-100 ng para ADNc CLORURO DE MAGNESIO El Cloruro de Magnesio actúa como cofactor de la ADN polimerasa Concentración de entre 1.0 y 2.5 mM.

31. DESOXINUCLEOTIDOS ( dATP , dCTP , dGTP , dTTP ) Forma trifosfatada Concentración óptima de entre 50 y 200 μ M, cantidad suficiente para sintetizar de 6.5 a 25 μ g de ADN. AMORTIGUADOR Concentraciones de sales adecuadas para la correcta función de la ADN polimerasa.

32. INICIADORES OLIGONUCLEÓTIDOS CON SECUENCIA ESPECÍFICA Delimitar los extremos del producto que se desea amplificar Su función radica en proporcionar un extremo 3’ libre al que se han de añadir los nucleótidos consecutivos mediante enlace fosfodiéster . A partir de ellos, la ADN polimerasa inicia la polimerización en dirección 5’-3’. Los iniciadores reciben el nombre de sentido y antisentido , según la secuencia a la que dan origen.

33. 1. D esnaturalización . 2. A lineamiento . 3. E xtensión. Termociclador Es el equipo en el cual se realiza la PCR. Los rangos de temperatura que abarca el equipo van de 4 a 96°C . Esquema de la PCR D esarrollada en 1986 por Kary Mullis Tres etapas principales

34. Desnaturalización Temperatura de 95°C. Permite el acceso de los primers a la cadena molde en sus secuencias complementarias.(30 s) Alineación o Hibridación 55 y 60°C L os iniciadores Buscan en las cadenas de ADN su secuencia complementaria y formen los puentes de hidrógeno con la cadena molde , dejando el extremo 3’OH disponible para la adición de los nucleótidos por la ADN polimerasa. ( 30 a 40 segundos) Extensión Se produce a la temperatura óptima para el funcionamiento de la ADN polimerasa empleada. T aq polimerasa, la más utilizada es de 72°C, según la longitud del producto que se va a amplificar, considerando la adición de 1000 nucleótidos en 60 segundos. Un ciclo típico de PCR consta de las tres temperaturas siguientes:

35. Sensibilidad de la técnica de PCR sensibilidad y una especificidad de 100%.

36. Modalidades de la técnica de PCR PCR convencional Los amplicones son visualizados a través de una electroforesis en geles de agarosa. La visualización de los amplicones se lleva a cabo tomando una foto digital al gel de agarosa expuesto a luz UV . . Los amplicones son corridos en el gel, deben ser cargados junto con un marcador molecular que contenga un número determinado de segmentos de ADN conocidos, lo que facilita la identificación de los amplicones .

37. PCR cualitativa Detectar la presencia o ausencia de un fragmento de ADN determinado. PCR cuantitativa El producto de PCR es cuantificable , lo que permite reportar en números absolutos la cantidad de un microorganismo o del ARNm de un gen en una muestra . PCR múltiple Se realiza la amplificación de más de un fragmento de ADN en una sola reacción de PCR con dos o más juegos de primers .

38. PCR selectiva (detecta genes silvestres o mutados) Para la PCR selectiva se diseñan primers capaces de hibridar solamente en secuencias con presencia de una mutación, por lo que, en caso de estar ausente, no se produce un producto de PCR. Mayor sensibilidad, al amplificar las secuencias de ADN en dos rondas de amplificación con distintos pares de primers en cada una. Primero se realiza una PCR con un par de iniciadores externos para amplificar una región de ADN extensa. Después, este producto de amplificación sirve de molde para una segunda PCR con otro par de iniciadores internos para amplificar una región más pequeña (interna). PCR anidada ( nested -PCR)

39. Es una variante de la PCR convencional utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ADN. . PCR EN TIEMPO REAL Russel Higuchi 1992 Mediante la detección de la fluorescencia liberada durante la reacción de amplificación puede medirse la cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de producto de PCR formado. Esto permite conocer y registrar en todo momento la cinética de la reacción de amplificación Sustancia marcada (Fluorocromo) La temperatura de alineación y extensión es la misma, por lo que ambos pasos se unifican y se reduce el tiempo de reacción.

40. PCR en tiempo real empleando SyberGreen El fluoróforo se une al ADN de doble cadena de manera inespecífica y produce fluorescencia. La desventaja estriba en que la unión, al ser inespecífica , será a lo largo de toda la molécula de ADN de doble cadena, incluyendo los dímeros de primer que pudieran formarse.

41. PCR en tiempo real con sondas TaqMan Se lleva a cabo en un termociclador que realiza, a la vez, la detección de fluorocromos mediante luz láser. La sonda tiene acoplado un fluorocromo en su extremo 5’, silenciado por otro fluorocromo o quencher

42. PCR en tiempo real con primers LUX Uno de los iniciadores se encuentra marcado con un fluoróforo ; cuando el iniciador hibrida con la cadena blanco, el fluoróforo es excitado, lo que da como resultado un incremento significativo de la señal de fluorescencia que el láser detecta.

43. Semicuantificación en tiempo real con el método 2DDCt En la PCR en tiempo real la concentración relativa se obtiene interpolando todas las muestras en un punto umbral ciclo de corte o cyclethreshold (CT ). El CT permite discriminar el comportamiento de las muestras, ya que a un menor valor de CT existe mayor cantidad inicial de moléculas del gen de interés en una muestra . El CT lo determina un software a un umbral de fluorescencia fijo ( threshold ) seleccionado por el analista. Estos valores pueden relacionarse con una curva estándar para determinar la cantidad de moléculas de ADN existentes ( cuantifi cación absoluta) o con un grupo de referencia ( cuantifi cación relativa).

44. Retrotranscripción como paso previo a la PCR Se lleva a cabo antes de una PCR, cuando se pretende analizar secuencias de ARN. Se basa en el uso de transcriptasa inversa de los retrovirus. No se requieren ciclos, y basta con una hora a la temperatura óptima de la enzima para realizar la conversión Los pasos de que consta esta reacción son: Desnaturalización del ARN a 70°C por 10 minutos para eliminar estructuras secundarias A lineación de los hexámeros por 10 min a 25°C Polimerización por la retrotranscriptasa a 37°C por una hora. Una vez obtenida la cadena de ADNc , ésta se emplea como molde para la técnica de PCR .

45. Los productos de PCR pueden utilizarse para: S ecuenciación , detección de patógenos infecciosos (virus bacterias, hongos), amplificación de segmentos para su análisis, o huella deADN , en medicina forense, detección de mutaciones, análisis de la expresión génica o determinación de carga viral, entre otras muchas aplicaciones. Aplicaciones de la PCR Con ella se pueden amplificar segmentos que contienen una mutación conocida (diagnóstico) o bien mutaciones desconocidas que se secuenciarán y determinarán después de una PCR. H a sido de gran ayuda para el diagnóstico y la correlación de variaciones génicas con enfermedades. En cuanto a las enfermedades adquiridas, la detección de genomas de patógenos es la aplicación diagnóstica más empleada de la PCR. Debido a su alta sensibilidad, permite la detección aun de pocas copias del genoma, lo que suele suceder en los periodos iniciales de la infección; por lo tanto, la PCR permite un diagnóstico temprano. Diagnóstico como aplicación de la PCR

46. MLPA MULTIPLEX LIGATION PROBE AMPLIFICATION Multiplex ligadura-dependiente de la sonda de amplificación  La técnica está diseñada y usada por laboratorios para detectar problemas genéticos que van desde un número anormal de cromosomas, supresiones, duplicaciones y expansiones de genes, utiliza la ortografía de los pares de bases para determinar si las porciones de los cromosomas o genes han cambiado o mutado.

47. Pasos: 1. Comienza con las sondas que se conectan a los pares de bases de los genes y los cromosomas en una ubicación específica. Así contar el número de mitades de sonda la cuales tan hechas en diferentes longitudes. Y sirven cuando se han montado correctamente en su gen o localización cromosómica entre si . 2. Reacción en cadena de polimerasa (PCR) se utiliza para hacer muchas copias de las mitades de la sonda correctamente emparejados y adjuntos.

48. Secuenciación de ADN Determinación del orden de los nucleótidos Aplicaciones Investigación básica de los procesos biológicos fundamentales Investigación forense Conocer mutaciones somáticas, sustituciones de bases En los decenios de 1960 y 1970 Sanger y Alan Coulson Alan Maxam y Walter Gilbert

49. Didesoxinucleótidos trifosfatados ( ddNTP ) Carecen de hidroxilo en el carbono 3’ de la desoxirribosa Se incorporan a una cadena de ADN en crecimiento por medio de la ADN pol se aísla y se clona el ADN que se desea secuenciar; este ADN se desnaturaliza y se emplea una sola hebra en la secuenciación . iniciador o primer marcado radiactivamente Complejo iniciador-molde Con estas mezclas se preparan cuatro tubos de reacción En cada una se producirán cadenas de ADN de distintas longitudes, terminando todas en el lugar en el que se incorporó el “ didesoxi ” Método de Sanger

50. Las cuatro mezclas son separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida-urea en condiciones desnaturalizantes (acrilamida 12% con urea 8 M ). Visualizar mediante autorradiografía cuando se utiliza marcaje radiactivo, ya sea en el iniciador o en alguno de los dNTP . El tiempo de exposición de la placa de rayos X sobre el gel varía de 20 a 30 horas y se expone a temperatura ambiente . Marcas quimioluminiscentes ( fluorescentes) para evitar el manejo de radiactividad. En este caso el marcaje es con fluorocromos en el extremo 5’ del iniciador. C adenas de longitud variable con terminación T en su extremo 3’, pero todas con el mismo extremo 5’ ( el extremo 5’ original del iniciador).

51. Bibliografía Voet;Voet .(2011).Biochemistry.4 th Edition.USA, JOHN WILEY & SON,INC. Salazar; Sandoval; Armendáriz (2016) Biología Molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud.2 Edición.McGrawHillEducation . Pérez, D. M. (2000). Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos, . Obtenido de bvs.sld.cu/revistas/ uni /vol1_2_00/uni07200.pdf Wink . (2009) An Introduction to Molecular Biotechnology . Fundamentals, Methods and Aplications.2 Edition.Willey-Blackwell