Tecnicas moleculares en el estudio de hla

es hermoso

1. TECNICAS MOLECULARES EN EL ESTUDIO DE HLA (SSO – SSP) Lic. T.M. Arturo Arzapalo HNERM SERVICIO DE BANCO DE ORGANOS Y LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD

2. POLIMORFISMO DE HLA SISTEMA HLA PRESENTA ALTO GRADO DE POLIMORISMO (PRESENCIA DE MULTIPLES A LELOS EN UN LOCUS)

3. TIPIFICACION DE HLA MOLECULAR HLA SEROLOGICO ESTUDIO FENOTIPICO HLA MOLECULAR ESTUDIO GENOTIPICO MICROLINFOCITOTOXICIDAD MEDIADA POR COMPLEMENTO PCR- SSO PCR- SSP PCR- SBT A DIFERENCIA DE LOS METODOS SEROLOGICOS LOS METODOS MOLECULARES PERMITEN ESTUDIAR LAS MULTIPLES DIFERENCIAS ALELICAS DEL HLA

4. SEROLOGIA MOLECULAR POLIMORFISMO SEROLOGICO POLIMORFISMO GENETICO

5. NOMENCLATURA – HLA MOLECULAR

6. ENFERMEDAD INJERTO CONTRA HUESPED EICH – GVHD COMPLICACION DE MAYOR IMPORTANCIA EN EL TRASPLANTE ALOGENICO DE CELULAS MADRE: (LEUCEMIAS, LINFOMAS, APLASIA..) UNA AFECCIÓN EN LA CUAL LAS CÉLULAS DEL DONANTE ATACAN A LOS TEJIDOS DEL RECEPTOR LOS ANTIGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD (HLA) ESTAN INVOLUCRADOS EN EL RECHAZO DEL INJERTO CONTRA EL HUESPED ES NECESARIO ENCONTRAR UN DONANTE COMPATIBLE “ HLA IDENTICOS ”

7. Exon 2  1  2 Exon 4  3 Exon 1 Leader Exon 3

8. POLIMORFISMO – HLA A

9. POLIMORFISMO – HLA B

10. POLIMORFISMO – HLA C

11. Exon 2  1  2 Exon 1 Leader Exon 3

12. POLIMORFISMO – HLA DR

13. TIPIFICACION POR PCR-SSO SSO ( Oligonucleotido de Sequencia Especifica ) Son SONDAS complementarias al ADN objetivo ADN amplificado por PCR se hibridiza con SONDAS de SSO. Pueden llegar a resolucion generica o intermedia . De Alto rendimiento . GARANTIZAN LA DISCRIMINACION ENTRE LA SECUENCIA DEL ADN OBJETIVO (ALELO) Y OTRO ESTRECHAMENTE RELACIONADO.

14. SECUENCIA DEL PCR - SSO EXTRACCION DE ADN AMPLIFICACION GENERICA DEL LOCUS A, B Y DR DESNATURALIZACION DEL MOLDE DE ADN EN CADENAS SIMPLES HIBRIDIZACION CON SONDAS ESPECIFICAS PARA LOS ALELOS POLIMORFICOS DE HLA IDENTIFICACION USANDO UN CONJUGADO UNIDO A UNA ENZIMA O FLUOROCROMO

15. PRIMER GENERICOS

16. SONDAS 3’ 5’ SONDA SOPORTE SE ENCUENTRAN UNIDOS A UN SOPORTE Y SON ESPECIFICOS PARA UN ALELO DE HLA SOPORTE SOLIDO : - PERLAS DE LUMINEX - MEMBRANA DE NYLON - TIRAS DE NITROCELULOSA - PLACAS DE MICROTITULACION - MICROCHIPS PERLAS DE LUMINEX

17. ESPECIFICIDAD DE LAS SONDAS LAS SONDAS PERMITEN LA DETECCION DE ALELOS ESPECIFICOS POR HIBRIDIZACION DETECCION DE SECUENCIAS ESPECIFICOS POR HIBRIDIZACION CON SONDAS SONDA

18. AMPLIFICACION SE REALIZA LA PCR USANDO PRIMERS GENÉRICOS PARA LOCUS A, B, DR LOCUS A y B EXON 2 y 3 LOCUS DR EXON 2 LOS PRIMERS ESTAN MARCADOS CON BIOTINA EXON B B PRIMER GEN HLA (ADN) 5’ 3’ ADN amplificado Biotina B

19. DESNATURALIZACION - HIBRIDIZACION EL ADN SE DESNATURALIZA PARA OBTENER CADENAS SIMPLES DE ADN CADA SONDA ES ESPECÍFICA DE UNA SECUENCIA POLIMORFICA (ALELO) PERO ESTA SECUENCIA PUEDE SER COMPARTIDA POR DIFERENTES ALELOS LAS SONDAS SE UNEN A LA SECUENCIA COMPLEMENTARIA DEL ADN 3’ 5’ 5’ 3’ ADN amplificado SONDA Biotina B 5’ 3’ B

20. DETECCION 3’ 5’ 5’ 3’ DNA amplificado SONDA Biotina Estreptavidina Fluorocromo B

21. TECNOLOGIA LUMINEX PERLAS + SONDAS

22. TIPIFICACION POR SSP PCR-SSP :ES UN METODO QUE USA PRIMERS DE SECUENCIA ESPECIFICA QUE PERMITIRA AMPLIFICAR SOLO ALELOS ESPECIFICOS INVOLUCRA DISEÑO CUIDADOSO DE PRIMER , DONDE EL EXTREMO 3’ DEL PRIMER COINCIDA SOBRE EL NUCLEOTIDO DE LA SECUENCIA POLIMORFICA A SER ANALIZADO (ALELO) ES UNA PRUEBA RAPIDA DE BAJO RENDIMIENTO

23. FUNDAMENTO X

24. SECUENCIA DEL PCR - SSP EXTRACCION DE ADN AMPLIFICACION DE ADN EN UNA PLACA DE 96 POZOS LOS AMPLICONES SON ANALIZADOS POR ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA ANALISIS DE DATOS: LAS MUESTRAS PRODUCIRAN 2 PRODUCTOS DE PCR (CONTROL Y ALELO ESPECIFICO) SOLO EN AQUELLOS POZOS Q CONTINEN EL PRIMER COMPLEMENTARIO AL ALELO DE HLA EN LA MUESTRA ANALISIS DE DATOS: POZOS QUE NO POSEEN ALELOS COMPLEMENTARIOS DEL PACIENTE TENDRAN UNA SOLO BANDA DE CONTROL DE AMPLIFICACION CADA POZO DE REACCION CONTIENE UNA MEZCLA DE PRIMERS DE SECUENCIA ESPECIFICA Y UN PRIMER CONTROL DE AMPLIFICACION

25. ELECTROFORESIS

26. ANALISIS DE DATOS CONTROL NEGATIVO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

27. ANALISIS DE DATOS HLA MOLECULAR A*02XX XX: 020101 020102…. ???¿¿¿¿¿

28. SSO - SSP SSO SSP TECNOLOGIA BASADA EN LA AMPLIFICACION DE PCR CON HIBRIDIZACION CON SONDAS ESPECIFICAS UTILIZA PRIMER ALELO ESPECIFICOS SON ESPECIFICO PARA UN DETERMIANDO ALELO POLIMORFICO USA SOFTWARE PARA SU INTERPRESTACION SE REALIZA EN 10 HORAS (DOS DIAS) ANALISIS SENCILLO Y RAPIDO USANDO ELECTROFORESIS PARA LA OBSERVACION (2 HORAS) BAJA E INTERMEDIO RESOLUCION BAJA Y ALTA RESOLUCION NECESITA 20 ng de ADN NECESITA 100 ng DE ADN SE TRABAJA VARIAS MUESTRAS A LA VEZ SE TRABAJA POR MUESTRAS INDIVIDUALES

29. GRACIAS