Tecnologia do DNA recombinante

Seminários

1. TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE GOVERNO DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE SECRETARIA DO ESTADO DA EDUCAÇÃO , DA CULTURA E DOS DESPORTOS - SECD UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE - UERN FACULDADE DE CIÊNCIAS EXATAS E NATURAIS – FANAT DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – DECB DISCIPLINA: GENÉTICA BÁSICA

2. CONCEITOS BÁSICOS Essa tecnologia foi desenvolvida a partir da década de 70 quando foram descobertas as endonucleases de restrição ou enzimas de restrição. Conjunto de técnicas que permitem a manipulação de moléculas de DNA, considerando seqüências específicas, com a perpetuação de tal seqüência in vivo.

3. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO VETORES DE CLONAGEM DNA LIGASE CÉLULA HOSPEDEIRA SELEÇÃO

4. CONCEITO DE CLONAGEM MOLECULAR A origem do termo clonagem vem da Genética Bacteriana. A técnica central do DNA recombinante é a clonagem molecular Consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas.

5. Estágios da Clonagem molecular Vetor r DNA recombinante Transformação transformante ou célula transformada Inserto

6. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Enzimas Especializadas em degradar DNA exógeno em bactérias. Função: reconhecer e clivar um DNA estranho. Sistema de restrição e modificação.

7. Duas classes de enzimas colocam-se para gerar e propagar o DNA recombinante: Endonucleases de restrição. DNA ligases

8. Existem três tipos de endonucleases de restrição: I, II e III; I e II geralmente grandes complexos com múltiplas subunidades contendo tanto a atividade endonucleásica como metilase; sua clivagem é aleatória; III cliva o DNA a cerca de 25pb da seqüência de reconhecimento.

9. Há 2 tipos distintos de clivagens: Extremidades abruptas: os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da seqüência específica. Extremidades coesivas: os cortes são feitos simetricamente, porém, fora do eixo de simetria.

10. EcoRI é purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de transferência de resistência RI. Hind III é isolada da Haemophilus influenzae , linhagem d III.

11. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO INTERESSE IMPORTÂNCIA FAMÍLIA ÚNICA DE FRAGMENTOS

12. DNA LIGASE Promove a ligação dos fragmentos de DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrição.

13. Junção de duas fitas de DNA A DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia

14. CONSTRUÇÃO DO DNA RECOMBINANTE Ela atua na clonagem molecular unindo o fragmento de interesse ao vetor utilizado, formando um híbrido vetor/fragmento. A função das ligases na célula é reparar quebras em fitas individuais, que surgem em moléculas de DNA de fita dupla durante a replicação do DNA

15. Fragmentos de DNA Fragmentos com extremidades coesivas; Fragmentos com extremidades não coesivas;

16. Adição de polidesoxiadenina na extremidade 3’ de um fragmento de DNA, e polidesoxitimina na extremidade 3’ de um outro fragmento de DNA; B. Adição de adaptadores às extremidades não coesivas.

17. CLONAGEM Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser transformadas em coesivas pela adição de poli (A) e poli (T).

18. Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser transformados em coesivas pela adição de adaptadores e posterior tratamento com a enzima de restrição que reconhece o adaptador.

19. TRASFORMAÇÃO BACTERIANA TRANSFORMAÇÃO INDUZIDA CAPTAÇÃO DO DNA

20. CLONAGEM - As bactérias e o vetor são misturados com uma solução de cloreto de cálcio seguido de um choque térmico de curta duração. - Os íons cálcio têm a função de neutralizar as cargas do DNA e da membrana bacteriana, facilitando a passagem do vetor pela membrana no momento do choque térmico .

21. Vetor - Conceito Um vetor pode definir-se como um agente capaz de promover uma ou mais etapas no processo global de transferência de material genético. Plasmídeos Bacteriófago λ BACs

22. VETORES UTILIZADOS EM ANIMAIS Lipossomos Retrovírus ( integram seu DNA ao do hospedeiro) Adenovírus Microinjeção pronuclear Transferência de genes por bombardeamento de partículas ( biobalística )

23. LIPOSSOMOS ( in vitro ) MICROINJETADOS TODO ESSE PROCESSO É INDUZIDO TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO

24. VETORES RETROVIRAIS Transcriptase reversa (RNA – DNA) e integrase ; Retrovírus: seqüências LTR e ψ e gene exógeno; Vírus assistentes Genes gag , pol e env ( sem ψ – requerida para o empacotamento )

25. MICROINJEÇÃO EM PRONÚCLEO PIPETA MICROCAPILAR MICROSCÓPIO INVERTIDO

26. IMPORTÂNCIA DA APLICAÇÃO DESSA TÉCNICAS O fim da seleção artificial Xenotransplante Biorreatores Terapia gênica

27. QUESTÕES RELACIONADAS COM A TRANSGENIA Bioéticas Ecológicas Econômicas Científicas