Valoración de antibióticos

Farmacopea

1. Valoración de antibióticos



De acuerdo a los Métodos Generales de Análisis 0100 se tiene:


La actividad o potencia de un antibiótico puede demostrarse por la
inhibición del crecimiento de microorganismos sensibles y específicos.
En los antibióticos puede haber ligeros cambios químicos que se
traducen en perdida de actividad antimicrobiana que no pueden
demostrarse por métodos químicos, por esta razón, en caso de duda
respecto a la actividad de un antibiótico, los métodos de valoración
microbiológica prevalecen sobre los métodos químicos.


Para valorar microbiológicamente un antibiótico, se pueden emplear dos métodos, ambos para
comparar la respuesta del microorganismo de prueba, frente a una sustancia de referencia
(SRef) de actividad conocida y una muestra tratada en las mismas condiciones.

Método de cilindro en placa (difusión en agar). Se basa en la difusión del antibiótico
desde un cilindro vertical, a través de una superficie con agar inoculado con el
microorganismo de prueba. L difusión origina zonas de inhibición del microorganismo
cuyo tamaño (diámetro) esta en relación con la concentración del antibiótico.

Método turbidimetrico. Se basa en medir espectrofotométricamente el crecimiento del
microorganismo de prueba en un medio de cultivo líquido que permite su rápido
crecimiento y en el que al adicionar concentraciones crecientes del antibiótico se inhibe
el crecimiento en forma proporcional a la concentración adicionada.


Material y equipo

El material que se usa debe estar limpio y seco, libre de residuos de detergente y antibiótico. El
material en contacto con el microorganismo de prueba debe esterilizarse empleando procesos
validados.

 Cajas de petri de vidrio o plástico de 20 mm X 100 mm.
 Cilindros de acero inoxidable o porcelana con las siguientes dimensiones:
o Diámetro externo 8 +/- 0.1 mm.
o Diámetro interno 6 +/- 0.1 mm.
o Longitud de 10 +/- 0.1 mm.
 Tapas de porcelana porosa.
 Material volumétrico.
 Tubos de ensayo estériles de 16 mm X 125 mm o de 18 mm X 150 mm, con tapas
metálicas o de plástico resistentes a esterilización.
 Incubadora con termostato capaz de mantener la temperatura con variación no mayor
de +/- 0.5 ºC de la temperatura seleccionada.
 Baño de agua o aire caliente con termostato capaz de mantener la temperatura
seleccionada con una variación no mayor de +/- 0.1 ºC.
 Espectrofotómetro a una longitud de onda a 530 nm o 580 nm.
 Medidor de zonas de inhibición (comparador óptico o vernier).


Reactivos. MGA 0831

 Solución salina estéril
 Solución de acido clorhídrico 1 N ó 0.5 M.
 Solución de hidróxido de sodio 1 N ó 0.5 M.

2.  Solución de acido fosfórico 18 N.
 Solución de hidróxido de potasio 10 N.
 Solución de formaldehído al 12 % (v/v) en agua.


Soluciones diluyentes

Preparar las soluciones diluyentes con agua purificada, determinar el pH de la solución, si es
necesario ajustar con soluciones de acido fosfórico 18 N o hidróxido de potasio 10 N, según se
requiera, para que después de la esterilización se obtenga el pH indicado en cada caso. A
menos que se indique lo contrario esterilizar en autoclave usando procesos validados.


Sustancias de referencia (SRef)

Métodos de secado de la sustancia de referencia

Método 1
En un pesafiltro transferir la cantidad adecuada de la SRef, colocar el pesafiltro destapado en
una estufa de vació secar en una atmósfera con 10% de humedad relativa a 60 ºC y una
presión de 5 mm de Hg o menor durante 3 hrs al termino abrir la estufa, tapar inmediatamente
el pesafiltro y colocar en un desecador con un agente desecante como pentoxido de fósforo o
gel de sílice.

Método 2
Proceder como indica el método 1, excepto que secar la SRef a 110 ºC.

Método 3
Proceder como indica el método 1, excepto que secar la SRef a 40 ºC, a un presión de 5 mm
de Hg o menor durante 2 hrs.

Método 4
Proceder como indica el método 1, excepto que secar la SRef a 100 ºC, a una presión de 5 mm
de Hg o menor, durante 4 hrs.

Método 5
Proceder como indica el método 1, excepto que secar la SRef a 25 ºC, a una presión de 5 mm
de Hg o menor, durante 4 hrs.


Medios de cultivo

Preparar los medios de cultivo a partir de mezclas deshidratadas comerciales siguiendo las
indicaciones del fabricante. Cuando sea necesario prepararlos a partir de ingredientes, se
permiten pequeñas modificaciones siempre y cuando los medios de cultivo presenten
propiedades promotoras de crecimiento iguales o mejores a los medios aquí descritos.

Disolver en 1 L de agua purificada los ingredientes especificados, determinar el pH, si es
necesario, ajustar con soluciones de hidróxido de sodio 1 N ó 0.5 M y acido clorhídrico 1 N ó
0.5 M, según se requiera para que después de esterilizar se obtenga el pH señalado en la
Tabla 5.


Microorganismos de prueba preparación del inóculo

Método 1. Para bacterias gram negativas y gram positivas no esporuladas, excepto
Enterococcus hirae. Mantener a los microorganismos de prueba en tubos con medio de
cultivo Nº 1, solidificado en posición inclinada e incubado a la temperatura y tiempo señalada
en la Tabla 6. A partir de un tubo de cultivo reciente, preparar la suspensión de prueba, agregar
3 mL de solución salina estéril para resuspender el crecimiento. Inocular con la suspensión

3. resultante 5 tubos de 22 mm por 200 mm, que contengan aproximadamente 15 mL del medio
de cultivo inclinado o en una botella de Roux con 250 mL de medio de cultivo, con ayuda de
perlas de vidrio estériles extender la suspensión en toda la superficie de la botella. Incubar en
las condiciones señaladas en la Tabla 6. Transcurrido el periodo de incubación, resuspender el
crecimiento de cada tubo con aproximadamente 3 mL de solución salina estéril o con 50 mL
cada botella de Roux (el volumen depende de la cantidad de crecimiento).

Para ajustar la suspensión, diluir una pequeña alícuota usando el factor de dilución señalado
en la Tabla 6, leer el por ciento de transmitancia de la dilución a una longitud de onda de 580
nm, la dilución de la suspensión original debe proporcionar una lectura de 25% +/- 2% de
transmitancia. Esta dilución, sólo sirve de referencia para ajustar la transmitancia de la
suspensión original, ésta es la que se inocula a la capa siembra. Tomando como base el por
ciento de inoculo sugerido en la Tabla 6, determinar el volumen de suspensión que debe
adicionarse a cada 100 mL de la capa siembra para obtener zonas de inhibición bien definidas
y de tamaño adecuado (14 mm – 16 mm de diámetro) o un crecimiento proporcional a la
concentración del antibiótico cuando se utiliza el método turbidimetrico. Conservar la
suspensión en refrigeración durante el periodo sugerido en la Tabla 6.

Método 2. Preparación de espora de Bacillus subtilis. Proceder como se indica en el
método 1, excepto que inocular 3 mL de la suspensión del microorganismo de prueba en una
botella de Roux con 250 mL del medio de cultivo Nº 32. Incubar a la temperatura y tiempo
indicados en la Tabla 6. Recuperar el crecimiento con 50 mL de solución salina estéril,
centrifugar y decantar el sobrenadante. Resuspender el sedimento con 50 mL a 70 mL de
solución salina estéril y calentar la suspensión a 70 ºC durante 30 min. Determinar la cantidad
de inoculo que debe adicionarse a cada 100 mL de medio de cultivo para la capa siembra para
obtener halos de inhibición bien definidos y de tamaño adecuado. Conservar la suspensión de
esporas en refrigeración durante el periodo sugerido en la Tabla 6.

Método 3. Preparación de Enterococcus hirae. Mantener el microorganismo de prueba en
tubos con medio cultivo Nº 1 solidificado en posición vertical e incubados entre 36 ºC y 37.5 ºC
durante 24 hrs para la prueba, inocular a partir de un cultivo reciente 100 mL del medio de
cultivo Nº 3. Incubar en las condiciones señaladas en la misma tabla. Conservar en
refrigeración durante el periodo sugerido en la Tabla 6.

Método 4. Preparación de levaduras. Mantener el microorganismo de prueba en tubos con
medio de cultivo Nº 19, en posición inclinada, incubar de 29 ºC – 31 ºC durante 24 hrs los tubos
y las botellas de Rous durante 48 hrs determinar la cantidad de inóculo que debe adicionarse a
cada 100 mL de la capa siembra. Conservar en refrigeración durante el periodo sugerido en la
Tabla 6.

Método 5. Preparación de Mycobacterium smegmatis. Mantener el microorganismo de
prueba en el medio de cultivo Nº 36 solidificado en posición inclinada, incubar en las
condiciones establecidas en la Tabla 6. Resembrar el microorganismo como se indica en el
método 1, excepto que utilizar el medio de cultivo Nº 36 e incubar en las condiciones señaladas
en la misma tabla. Recuperar el crecimiento con el medio de cultivo Nº 34 y determinar el
volumen de la suspensión que se debe adicionar a cada 100 mL del medio de cultivo para la
capa siembra. Conservar en refrigeración durante el periodo sugerido en la Tabla 6.

TABLA 4. Soluciones diluyentes.

Ingredientes gramos por litro de agua
Número
1 3 4 6 10 16
Concentración 1% 0.1 M 0.1 M 10% 0.2 M 0.1 M
pH 6 +/- 0.5 8 +/- 0.1 4.5 +/- 0.05 6 +/- 0. 10.5 +/- 0.1 7 +/- 0.2
K2HPO4 2 16.73 - 20 35 13.6
K2HPO4 8 0.523 13.61 80 - 4
KOH - - - - 2 mL -

4. MÉTODO DE DIFUSIÓN EN AGAR


Preparación de la muestra

Para preparar la solución de prueba de la muestra, proceder de acuerdo a lo indicado en la
monografía específica del producto.


Preparación de las placas

Para cada antibiótico enlistado en la Tabla 7, seleccionar los medios de cultivo, el volumen del
medio de cultivo para la capa base y la capa siembra, el microorganismo, el volumen de
inóculo sugerido y la temperatura de incubación. Preparar 12 placas para la curva dosis
respuesta y tres para cada muestra.

Sobre una superficie plana y a nivel distribuir en cada caja Petri, 21 mL o la cantidad señalada
del medio de cultivo base, estéril, fundido y mantenido en baño de agua entre 48 °C y 50 °C
aproximadamente, dejar las tapas de las cajas entreabiertas para evitar la acumulación de
agua de condensación, permitir que el agar solidifique y tapar.

Tomando en consideración el número de placas, preparar el volumen necesario del medio de
cultivo para la capa siembra.

Inocular el medio de cultivo (estéril, fundido y mantenido en baño de agua a una temperatura
entre 48 °C y 50 °C) con la cantidad sugerida de la suspensión del microorganismo de prueba,
adicionar a cada caja con la capa base solidificada, la cantidad de la capa siembra indicada en
la Tabla 7, extender uniformemente y rápidamente el medio de cultivo inoculado, dejar
solidificar.

Colocar seis cilindros de acero inoxidable a intervalos regulares de 60° en un radio de 2.8 cm.
Para la curva dosis respuesta, utilizar un total de 12 placas, 3 para cada concentración,
excepto por la media o punto de referencia de la curva, la cual se incluye en todas las placas.
Llenar 3 cilindros de un conjunto de 3 placas con la concentración de referencia y alternar tras
cilindros con la concentración más baja y así sucesivamente para cada concentración.

De esta manera se obtienen 36 zonas de inhibición para la concentración de referencia (c) y 9
para las 4 concentraciones restantes de la curva (a, b, d, e).

Para cada muestra utilizar 3 placas, llenar tres cilindros de cada placa con la concentración
media de referencia y en forma alterna llenar los otros 3 con la muestra preparada a la
concentración media o de referencia. Incubar las placas durante 16 hrs a 18 hrs a la
temperatura indicada para cada antibiótico en la Tabla 7.

Después del periodo de incubación medir el diámetro de la zona de inhibición.


Preparación de las disoluciones de la SRef

Para cada antibiótico enlistado en la Tabla 8, seleccionar las condiciones de secado de la
sustancia de referencia, solventes, diluyentes y concentración base de la sustancia de
referencia.

Considerando la concentración media (c) y el factor de dilución indicados de la misma tabla
preparar las 4 concentraciones restantes de curva (a, b, d y e).

Conservar la solución concentrada en refrigeración y usar dentro del periodo de
almacenamiento indicado en la Tabla 8.

5. Cálculos

Para calcular la potencia utilizar un método estadístico apropiado.

Uno de los procedimientos analíticos comúnmente usados, se basa en el cálculo de la
respuesta a la concentración alta (H) y la concentración baja (L) como el que a continuación se
indica:

Preparación de la línea dosis-respuesta. Promediar las zonas de inhibición de cada una de
las concentraciones de la SRef de los 4 conjuntos de tres placas. El promedio de las 36
lecturas de la concentración media de la SRef (punto “c”) corresponde al punto de corrección
de la curva con el cual se corrigen los promedios de cada una de las concentraciones de la
SRef (puntos a, b, d, y e).

La corrección se efectúa de la siguiente manera: si el promedio de las 36 lecturas de la SRef
(punto “c”) es mayor al valor promedio de las lecturas del punto “c” en cualquiera de las
concentraciones de la curva, la diferencia se suma; si por el contrario el promedio de la SRef
de 36 lecturas es menor, la diferencia se resta para así corregir el valor de este punto.

Ejemplo número 1:

Promedio SRef36 =17.2 mm
Promedio SRef9 =17.0 mm
Promedio Sol a9 =16.3 mm
Por lo tanto 17.2-17.0 = 0.2 (diferencia)
Valor corregido punto “a”

A = 16.3 + 0.2 = 16.5

Ejemplo número 2:

Promedio SRef36 = 17.2 mm
Promedio SRef9 = 17.5 mm
Promedio Sol a9 = 16.3 mm
Por lo tanto 17.2-17.5 = 0.3 (diferencia)
Valor corregido punto “a”

a = 16.3 + 0.3 = 16.0

Preparar la línea dosis-respuesta sobre papel semilogarítimico de doble ciclo usando la
concentración en µ/mL o en U/mL en las ordenadas (escala logarítmica) y el diámetro de las
zonas de inhibición en las abscisas (escala milimétricas). La línea de dosis-respuesta se traza
a través de los puntos corregidos o bien utilizando los valores del punto más alto (H) y del
punto más bajo (L) que se calculan con las siguientes ecuaciones:


L = (3a + 2b + c – e)/5
H = (3e + 2d + c – a)/5

Donde:

L = diámetro de la zona de inhibición en milímetros para la concentración más baja de
la SRef.
H = diámetro calculado de la zona de inhibición en milímetros para la concentración
más alta de la SRef.
a,b,c,d,e = son los promedios de los valores corregidos para las concentraciones de la
SRef.

Estimación de la potencia de la muestra. Promediar los diámetros de las zonas de inhibición
de la SRef y de la muestra en las tres placas empleadas. Si el promedio del diámetro de las

6. zonas de inhibición de la muestra es mayor que el de la SRef, sumar la diferencia entre ellos al
diámetro de la concentración media de referencia de la línea dosis-respuesta de la curva
estándar.

Si el promedio del diámetro de las zonas de inhibición de la muestra es más baja que la SRef,
restar la diferencia entre ellos al diámetro de la concentración media de la línea dosis-
respuesta. Interpolar en la línea dosis respuesta el valor corregido para obtener la
concentración correspondiente y multiplicarla por el factor de dilución para obtener el contenido
del antibiótico en la muestra.


MÉTODO TURBIDIMÉTRICO


Preparación de la muestra

Para preparar la solución de prueba de la muestra, proceder de acuerdo a la monografía
especifica del producto.


Preparación de las diluciones de la SRef

Para cada antibiótico enlistado en la Tabla 10, seleccionar las condiciones de secado de la
sustancia de referencia, solventes, diluyentes y concentración base de la sustancia de
referencia.

Considerando la concentración media (c) y el factor de dilución indicados en la misma tabla
preparar las cuatro concentraciones restantes de curva (a, b, d y e).


Procedimiento para el ensayo

Para cada antibiótico enlistado en la Tabla 9, seleccionar el microorganismo de prueba, medio
de cultivo, volumen de inóculo sugerido para cada 100 mL de caldo nutritivo.

Para la curva dosis respuesta usar 15 tubos (cinco series de 3 tubos cada una) y para la
muestra usar 3 tubos.

A cada serie de 3 tubos adicionar 1 mL (ó 0.1 mL en el caso de la Gramicidina) de cada
concentración de la curva dosis respuesta y en el caso de la muestra, adicionar a cada uno de
los 3 tubos 1 mL de la concentración de la muestra.

Adicionar a cada serie de 3 tubos (curva de dosis respuesta y muestra) 9 mL del medio de
cultivo inoculado. Incubar en baño de agua con agitación continúa a la temperatura indicada en
la Tabla 9, el tiempo de incubación se determina al observar crecimiento en los tubos que
contienen la concentración media (c) de la SRef entre 2 y 4 hrs.

Retirar los tubos el baño y adicionar inmediatamente a cada uno 0.5 mL de una solución de
formaldehido al 12%. Ajustar el espectrofotómetro a 100% de transmitancia con un blanco que
contiene medio de cultivo sin cultivo y 0.5 mL de solución de formaldehido a la concentración
indicada. Leer la transmitancia de cada tubo a una longitud de onda de 530 nm y promediar los
valores obtenidos.


Cálculos

Para calcular la potencia utilizar un método estadístico apropiado, comúnmente se utiliza un
procedimiento analítico basado en el cálculo de la respuesta de la concentración alta (H) y la
concentración baja (L), como se indica a continuación:

7. Preparación de la línea dosis-respuesta. Promediar los valores de transmitancia para cada
concentración de la línea. Preparar la línea dosis-respuesta en papel semilogarítimico de un
ciclo colocando los valores de transmitancia en escala milimétrica.

La línea dosis-respuesta se traza a través de todos los puntos, o bien, utilizando los valores
alto (H) y bajo (L) obtenidos mediante las siguientes ecuaciones:


L = (3a+2b+c-e)/5
H = (3e+2d+c-a)/5

Donde:
L = Valor de transmitancia calculado para la concentración más baja de la SRef.
H = Valor de transmitancia calculado para la concentración más alta de la SRef.
a, b, c, d, e = Promedios de los valores de transmitancia para cada concentración de la
SRef del más abajo al más alto respectivamente.

Estimación de la potencia de la muestra. Promediar los valores de transmitancia para la
muestra y determinar la concentración interpolando en la línea dosis respuesta. Multiplicar la
concentración obtenida por el factor de dilución para obtener el contenido del antibiótico en la
muestra.


De acuerdo a los Métodos Generales de Análisis 01001, “Valoración yodométrica de
antibióticos β-lactámicos se tiene:

Se basa en la inactivación de las penicilinas por rompimiento hidrolítico del anillo β-lactámico
por la acción catalítica de un álcali. El producto resultante es acido peniciloico el cual consume
yodo.

Para el análisis se prepara un blanco y una muestra, esta es inactivada con hidróxido de sodio,
a ambos (blanco y muestra) se añade un exceso de solución valorada de yodo. El yodo no
consumido se titula con tiosulfato de sodio y la diferencia en los volúmenes de solución de yodo
consumido se relaciona al contenido de penicilinas de la parte alícuota que se midió.


Preparación de la solución de referencia

Secar la SRef, como se especifica en la monografía correspondiente, disolver una cantidad de
la SRef de acuerdo a como se especifica en la monografía individual, efectuar diluciones con el
mismo disolvente hasta obtener una solución de concentración aproximada a la de la tabla de
concentraciones finales y disolventes (Tabla 11). Transferir 2 mL de esta solución en cada uno
de dos matraces Erlenmeyer de vidrio con tapón de vidrio.


Preparación de la muestra

A menos que se especifique otra cosa en la monografía individual del producto, disolver una
cantidad adecuada de la muestra en el disolvente indicado en la Tabla 11, diluir
cuantitativamente con el mismo disolvente hasta obtener una solución cuya concentración final
sea la especificada en la tabla. Transferir 2 mL de esta solución en cada uno de dos matraces
Erlenmeyer con tapón de vidrio.


Procedimiento


Inactivación y titulación. A 2 mL de la solución de referencia y de la muestra, añadir 2 mL de
solución de hidróxido de sodio 1 N, mezclar mediante agitación y dejar reposar durante 15 min.
Adicionar a cada uno de los matraces 2 mL de solución de acido clorhídrico 1.2 N y 10 mL de

8. solución de yodo 0.01 N, inmediatamente colocar el tapón y dejar reposar durante 15 min.
Titular con SV de almidón yodurado y continuar la titulación hasta que el color azul producido
por el indicador desaparezca.

Determinación del blanco. Adicionar a un matraz que contenga 2 mL de la solución de
referencia, 10 mL de solución de yodo 0.01 N. Si la solución contiene amoxilina o ampicilina,
inmediatamente adicionar 0.1 mL de solución de acido clorhídrico 1.2 N y titular de inmediato
con SV de tiosulfato de sodio 0.01 N. Para visualizar el punto final añadir unas gotas de SI de
almidón yoduro pasta y continuar la titulación hasta la desaparición del color azul producido por
el indicador. De manera similar, tratar un matraz que contenga 2 mL de la solución de la
muestra preparada.


Cálculos

Calcular los microgramos (o unidades) equivalentes (F) a cada mililitro de solución de tiosulfato
de sodio 0.01 N consumido por la solución de referencia, con la formula siguiente:

(2CP) / (B-I)

Donde
C = Concentración en miligramos por mililitro de la SRef en la solución de referencia.
P = Potencia en microgramos (o unidades) por miligramo de la SRef.
B = Volumen en mililitros de la solución de tiosulfato de sodio 0.01 N consumido en la
determinación del blanco.
I = Volumen en mililitros de solución de tiosulfato de sodio 0.01 N consumido en la
titulación e inactivación.

Calcular la potencia de la muestra que se está valorando mediante la fórmula dada en la
monografía individual.

A menos que se especifique otra cosa las soluciones amortiguadoras empleadas son de fosfato
de potasio como se define en el capítulo correspondiente de medios y diluyentes con el nombre
de antibióticos-ensayo microbiológico [0100] excepto que no se requiere esterilizar antes de
utilizar.


TABLA 11. Concentraciones finales y disolventes.

Antibiótico Disolvente Concentración final
Amoxicilina Agua 1 mg/mL
Ampicilina Agua 1.25 mg/mL
Cloxacilina Agua 1 mg/mL
Meticilina sódica Solución amortiguadora Nº 1 1.25 mg/mL
Penicilina sódica Solución amortiguadora Nº 1 2000 U/L
Penicilina potásica Solución amortiguadora Nº 1 2000 U/L
Feneticilina potásica Solución amortiguadora Nº 1 2000 U/L




Referencia bibliográfica

Secretaría de Salud. Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. Octava edición, Volumen I. México,
2004.



PSS.Q.F.B. Lluvia Briseida Espinoza Morales